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요약

Polysome 프로 파일링 기술의 전반적인 목표 단백질 합성 하는 동안 개별 mRNAs 또는 transcriptome mRNAs의 변환 활동의 분석입니다. 방법은 단백질 합성 규제, 번역 활성화 및 건강과 여러 인간의 질병에 억압의 연구에 대 한 중요 합니다.

초록

적절 한 단백질 식 및 오른쪽 금액에 적절 한 시기에 정상적인 세포 기능 및 빠르게 변화 하는 환경에서 생존의 기초 이다. 오랜 동안에, 유전자 표현 연구 transcriptional 수준에 대 한 연구에 의해 지배 되었다. 그러나, mRNAs의 정상 수준을 잘 단백질 생산, 연관 되지 않습니다 그리고 translatability mRNAs의 조건에 따라 크게 다릅니다. Leishmania, 기생충 같은 몇몇 유기 체에서 단백질 식이 주로 변환 수준에서 통제 된다. 최근 연구는 단백질 번역 dysregulation는 암, 대사, 신경 및 기타 인간의 질병 관련 된 시연 했다. Polysome 프로 파일링 단백질 번역 규칙을 공부 하는 강력한 방법입니다. 그것은 개별 mRNAs의 변환 상태를 측정 하거나 게놈 넓은 규모에 번역을 검토 수 있습니다. 이 기법의 기초 polysomes, 리보솜, 그들의 소 단위 및 자당 그라디언트를 통해 lysate는 세포질의 원심 분리 동안 무료 mRNAs의 분리 이다. 여기, 우리가 현재 보편적인 polysome 프로 파일링 사용 되는 프로토콜에 세 가지 모델-기생충 주요 Leishmania, 경작된 한 인간 세포 및 동물의 조직. Leishmania 셀 서 스 펜 션에서 자유롭게 성장 하 고 마우스 고환 동물 조직 샘플을 나타내는 부착 단층에서 경작된 한 인간 세포 성장. 따라서, 기술은 이러한 소스의 모든 적응 이다. Polysomal 분수의 분석을 위한 프로토콜 개별 mRNA 수준의 실시간 정량 Pcr에 의해 서쪽 오 점 및 전기 이동 법에 의해 리보솜 RNAs의 분석에 의해 단백질의 탐지를 포함 한다. 메서드는 분수의 질량 분광학에 의해 mRNAs 연관 깊은 RNA-seq에 의해 transcriptome 수준에 리보솜의 검사 및 리보솜 관련 단백질의 분석에 의해 더 확장할 수 있다. 메서드는 다른 생물 학적 모델을 쉽게 조정할 수 있습니다.

서문

세포에 있는 유전자 발현의 규칙 transcriptional, posttranscriptional 및 posttranslational 메커니즘에 의해 제어 됩니다. 깊은 RNA 시퀀싱에서 전례 없는 수준에 게놈 넓은 규모에 정상 mRNA 수준의 연구를 수 있습니다. 그러나, 최근 연구 결과 밝혀 정상 mRNA 수준은 단백질 생산1,2와 항상 연결 되지 않습니다. 개별 성적표의 운명 매우 복잡 하 고 내부/외부 자극, 스트레스 등과같은 많은 요인에 따라 달라 집니다. 단백질 종합 동안에 유전자 발현의 규칙 변화에 신속한 대응에 필요한 식 컨트롤의 또 다른 레이어를 제공 합니다. 프로 파일링, 분리 및 리보솜, 적극적으로 번역의 시각화 polysome (또는 "polyribosome") 단백질 종합의 규칙을 공부 하는 강력한 방법입니다. 비록, 그것의 첫번째 실험적인 응용 프로그램 1960 년대3에 등장, polysome 프로 파일링은 현재 단백질 번역 연구4에서 가장 중요 한 기술 중 하나. 단일 mRNAs는 polysome의 형성을 선도 하는 하나 이상의 리보솜에 의해 번역 될 수 있다. 성적 증명서 cycloheximide5 리보솜에 지연 수 있습니다 및 mRNAs polysomes의 다른 숫자를 포함 하 여 자당 그라데이션 ultracentrifugation6,7 polysome 분류 과정에서 분리 될 수 있다 , 8 , 9. polysomal 분수의 RNA 분석 수 있습니다 개별 mRNAs의 변환 상태에 변화의 측정 및 다른 생리 적인 조건4,7, 중 게놈 넓은 규모에 10. 5' UTR 및 3' UTR 시퀀스 mRNA translatability11의 제어의 역할을 공개, 번역 상 진압12miRNAs의 역할을 검토, 리보솜 속13에에서 결함을 밝히기 메서드를 또한 사용 , 인간의 질병14,15리보솜 관련 단백질의 역할을 이해 하 고. 지난 10 년 동안 번역 중 유전자 발현의 규칙을 위한 성장 역할 인간의 질병에 그것의 중요성을 나타내는 등장 했습니다. 암, 대사에 변환 제어 및 신경 퇴행 성 질환에 대 한 증거는 압도적인15,,1617,18. EIF4E-종속 변환 제어의 dysregulation에 기여 하는 예를 들어 자폐증 관련 적자15 와 FMRP은 자폐증14에 연결 된 mRNAs에 리보솜의 연기에 참여 하 고. 따라서, polysomal 프로 파일링 변환 여러 인간 질병에 있는 결함을 공부 하는 매우 중요 한 도구입니다.

다른 생리 적인 조건 하에서 polysomal 분수의 단백질 분석 번역 중 리보솜과 관련 된 요인의 기능 dissects. Polysome 프로 파일링 기법 등 효 모, 포유류 세포, 식물, 원생 동물10,19,,2021많은 종에서 사용 되었습니다. Trypanosoma 등 Leishmania protozoan 기생충 유전자 발현의 제한 된 transcriptional 제어를 전시 한다. 그들의 유전자는 polycistronic 유전자 클러스터 발기인 통제 전사22부족으로 구성 됩니다. 대신, 발달 유전자 발현은 주로 단백질 번역 및 trypanosomatid 종23,24에 mRNA 안정성의 수준에서 제어 됩니다. 따라서, 이해 transcriptional 규칙의 부재에서 변환 제어의이 유기 체에 대 한 특히 중요 하다. Polysomal 프로 파일링 Leishmania25,26,,2728에 유전자 발현의 posttranscriptional 레 귤 레이 션을 공부 하는 강력한 도구입니다.

진짜 개인적인 mRNAs 레벨의 검출에 최근 진행 시간 정량 PCR (RT-정량) 및 차세대 시퀀싱, 프로 테오 믹스 기술에 의해 전체 transcriptome, 해상도 새로운 수준 polysomal 프로 파일링의 장점을 제공 합니다. 이러한 메서드를 사용 하 여 깊은 RNA 시퀀싱 proteomic 분석 게놈 넓은 규모에 셀의 변환 상태를 모니터링을 결합 하 여 개별 polysomal 분수의 분석에 의해 더 확장 수 있습니다. 다른 생리 적 및 병 적인 조건 하에서 번역을 규제 하는 새로운 분자 선수의 식별 수 있습니다. 여기, 우리는 세 가지 모델에 사용 되는 프로토콜을 프로 파일링 범용 polysome 제시: 기생충 주요 Leishmania, 경작된 한 인간 세포 및 동물의 조직. 우리는 다른 유기 체, 그라데이션 조건의 최적화, RNase 억제제의 선택과 polysome 분수가이 연구에서 분석 하는 실시간 정량, 서쪽 오 점 및 RNA 전기 이동 법의 응용 프로그램에서 세포 lysates의 준비에 조언을 제시.

프로토콜

모든 동물 치료 및 연구에서 얻은 조직의 취급 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 국가 학회에 택 사스 기술 대학 건강 과학 센터에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행 했다 건강 동물 복지 지침, 프로토콜 번호 96005입니다. 척 추가 있는 동물을 희생 하 고 지침에 따라 조직 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 준비 하십시오. 이러한 위원회 부족, 건강의 국가 학회 동물 복지 가이드라인을 참조 하십시오. 성인 (> 60 일 이전) C57BL/6 마우스 사용 되었다. 모든 동물 및 조직 기관 동물 관리 및 사용 위원회 건강의 국가 학회 동물 복지 지침에 따라 택 사스 기술 대학 건강 과학 센터에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 얻은 했다. 안락사, 단일 마우스 작은 챔버에 배치 했다 그리고 공중 약 30%로 점차적으로 전치 되었다 이산화탄소는 동물의 고통을 최소화 하 고 anesthetize. 호흡의 정지, 다음 우리는 조직 수확 전에 동물의 죽음을 확인 하 경부 전위를 사용.

주의: 라이브 Leishmania 경작된 한 인간 세포와 모든 작업 biosafety BSL-2 실험실 인증 캐비닛에서 이루어졌다.

1. 준비에서 세포질 Lysates의 Leishmania 주요 , 경작된 한 인간 세포 및 마우스 조직

참고: 다른 원본 자료에서 lysate 준비에 몇 가지 차이점이 있습니다. 자당 그라데이션 준비와 polysomal 분류를 포함 하 여 다른 단계는 동일 하 고 샘플 소스에 종속 되지 않습니다.

  1. Leishmania 주요 세포질 lysate 준비
    1. 주요 Leishmania (FV1 스트레인) 셀 1 x M199 중간29 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)과 페니실린/스 혼합물 포함 30 mL에 접종 (100 단위 및 100 μ g/mL correspondingly)1 x 105 셀/mL의 농도에서 .
      참고: 캐비닛 biosafety Leishmania 주요 셀을 포함 하는 모든 단계를 실시 해야 합니다.
    2. 인큐베이터에 셀을 배치 하 고 로그 단계까지 27 ° C에서 그들을 성장 (로그 중반에 해당 5 x 106 셀/mL). 그것은 일반적으로 성장을 약 2 일 걸립니다.
    3. Leishmania 주요 문화 번역 된 mRNAs에 리보솜 체포를 100 μ g/mL의 최종 농도에 cycloheximide를 추가 합니다. 27 ° c.에서 10 분 동안 인큐베이터에 다시 장소 세포
    4. Cycloheximide 치료 완료 후 50 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송 하 고 1800 x g와 8 분 삭제 상쾌한에 4 ° C에서 그들을 회전.
    5. Dulbecco의 버퍼 인산 염 (DPBS) 30 mL로 세포 세척. 원심 분리기에서 1800 x g와 4 ° C 8 분.
    6. 폐기는 상쾌한. 셀 DPBS의 1 mL에 resuspend
    7. 셀의 약 수 고 3.5% 포름알데히드 솔루션을 함께 섞는다.
    8. Hemocytometer 여 셀 개수 하 고 그들의 농도 결정 합니다. Microfuge 관으로 원하는 셀 수를 전송 합니다. 0.5x108-2 x 108 셀/mL에서 준비 Lysate 한 자당 그라데이션 선적을 위해 충분 하다.
    9. 1800 x g에서 셀 회전와 4 ° C 8 분에 대 한 삭제는 상쾌한.
    10. Protease 억제제와 RNase 억제제 (20 mM HEPES-코, pH 7.4, 100 m m KCl, 10mm MgCl2, 2mm DTT, 1 %NP-40, 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일 (EDTA 무료), 200 단위/mL RNase 억제제)를 포함 하는 세포의 용 해 버퍼의 1 mL에 얼음에 셀 펠 릿 resuspend
    11. 통과 lysate 23 게이지 바늘을 통해 세 번. lysate 해야 될 투명 바늘 통과 후.
    12. 원심 분리기 11,200 x g와 lysate 명확 하 게 10 분 동안 4 ° C 명확히 전송 lysate 신선한 튜브와 자당 그라데이션 ultracentrifugation까지 얼음에 그것을 유지.
    13. 수집 입력으로 (나중에 분석), lysate의 400-500 μ 바로 미래의 단백질 분석을 위한 액체 질소 동결 또는 RNA 분석에 대 한 동결 전에 RNA 정화 시 약을 추가.
  2. 배양된 인간 헬러 세포에서 세포질 lysate 준비
    1. 헬러 세포를 분할 하 고 20 mL의 10 %FBS 페니실린/스 혼합물 포함 된 DMEM 매체에 씨앗 (100 단위 및 100 μ g/mL correspondingly) 셀 계산 2 x 105 셀/mL 15 cm 접시에.
    2. 37 ° C, 5% CO2 제조 업체의 프로토콜에 따라 20-24 h. 수행 플라스 미드 DNA transfection에 HeLa 세포 성장.
    3. 37 ° c, 5% CO2transfection 후 24 h에 대 한 셀을 전파 합니다.
    4. 번역 된 mRNAs에 리보솜을 체포 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 10 분에 대 한 셀을 품 어를 100 μ g/mL의 최종 농도에 성장된 HeLa 세포에 cycloheximide를 추가 합니다. 중간 발음 얼음에 차가운 DPBS 셀 두 번 씻는 다.
    5. 접시에 500 μ의 세포의 용 해 버퍼 (20 mM HEPES 코 pH 7.4, 100 m m KCl, 5 mM MgCl2, DTT, 0.5 %NP-40, 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일 1 mM (EDTA-무료), 단위/200ml의 RNase 억제제 또는 1 mg/mL 헤 파 린)를 추가 하 고 얼음에 셀을 다쳤어요.
    6. Microfuge 관 lysed 세포를 전송 합니다. 0.5% 및 MgCl2 는 샘플의 양이 증가 따라 5mm NP-40의 농도 조정 합니다.
    7. 통과 lysate 23 게이지 바늘 3-6 시간.
    8. 스핀 11,200 x g와 lysate 명확 하 게 8 분 4 ° C. 원심, 후 상쾌한 새로운 튜브를 전송 합니다. 세포 세포의 용 해 효율을 평가 하 고 그라데이션에 로드에 대 한 샘플 크기를 결정 하는 분 광 광도 계를 사용 합니다. 0.1%의 0.5 mL를 추가 하는 샘플의 10 μ 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS). 0.1 %SDS 대 한 빈. 260에서 흡 광도 측정 nm. 예상된 흡 광도 값은 주위 15-20 단위/mL.
    9. 자당 기온 변화도 원심 분리 하기 전에 같은 흡 광도 값을 세포의 용 해 버퍼 모든 샘플을 희석. 자당 기온 변화도 원심 분리까지 얼음에 샘플을 계속.
  3. 마우스 고환에서 세포질 lysate 준비
    1. 마우스 고환 해 부. Tunica albuginea에 작은 절 개를 하 게 하 고 testes의 seminiferous tubules를 수집 하 고 0.1 m m phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF) 보충 하는 DPBS의 5 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 그들을 전송.
    2. 여러 번을 반전 하 여 적극적으로 조직을 믹스. 5 분 동안 얼음에 단위 중력에 정착을 조직을 수 있습니다.
    3. 제거 하 고 연결 세포와 조직 파편을 포함 하는 흐린 버퍼를 삭제 합니다. 절차 2-3 번 더 반복 합니다. 나머지 흰색 펠 릿 seminiferous tubules 및 생식 세포 농축입니다.
    4. 2 mL microcentrifuge 튜브를 seminiferous 관 펠 릿을 전송 및 스핀 1 분에 500 x g에서 삭제는 상쾌한.
    5. tubules에 세포의 용 해 버퍼 (20 mM Tris HCl, pH 7.4, 100 m m KCl, 5 mM MgCl2, DTT, 0.5 %NP-40, 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일 1 mM (EDTA-무료), 1 mg/mL 헤 파 린 또는 RNase 억제제의 200 단위/mL)의 500 µ L를 추가 합니다. 한 피 펫을 사용 하 여 조직 triturate.
    6. 작은 정지 전송 (0.5-1.0 mL) Dounce 균질 화기. 유리 유 봉의 7 ~ 8 스트로크 조직 방해.
    7. 1.5 mL microcentrifuge 튜브 lysate를 전송할.
    8. 12000 x g와는 lysate를 8 분 동안 4 ° C에서 샘플 원심 자당 기온 변화도에 로드 될 때까지 얼음에 새로운 튜브와 저장소에는 상쾌한 전송.
    9. 수집 하는 입력된 샘플으로 lysate의 50 μ, 향후 단백질 분석;-80 ° C에서 그것을 지금 당장 동결 또는 RNA 분석에 대 한 동결 전에 RNA 정화 시 약을 추가.

2. 자당 그라데이션 준비 및 Ultracentrifugation

  1. 두 자당 그라데이션 (20 mM HEPES-코, pH 7.4, 100 m m KCl, 10mm MgCl2, 1mm DTT, 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일), 포함 하는 솔루션 10% 자당 또는 50% 자당을 준비 합니다. (PH 7.4, Tris HCl HEPES 대신 사용할 수 있습니다). 200 단위/mL RNase 억제제 또는 1 mg/mL 헤 파 린 실험 디자인에 따라 추가 합니다. 마커 블록으로 남서 41로 터에 대 한 ultracentrifuge 튜브를 놓고 블록의 상위 레벨에 따라 라인을 그립니다. 안정적인 랙 튜브를 전송 합니다.
  2. 연결 된 레이어 링 장치 10 mL 주사기를가지고 하 고 10% 자당 해결책 (위와 같이 준비)와 주사기를 입력. 마크 튜브에 도달할 때까지 부드럽게 ultracentrifuge 튜브의 하단에 그것을 해제.
  3. 50% 자당 해결책으로 다른 주사기를 조심 스럽게 삽입 튜브의 아래쪽 10% 자당 레이어를 통해 그것의 레이어 링 장치. 부드럽게 튜브에 마크에 도달할 때까지 아래에서 시작 하는 자당 솔루션 출시. 제공 된 모자와 튜브 인감.
  4. 자당 기온 변화도 준비 하려면 그라데이션 메이커 장치에 설정 합니다. 위로 또는 아래로 단추를 사용 하 여 접시를 레벨 하 고 DONE을 누릅니다. 수평 선형 그라데이션에 대 한 중요 하다입니다.
  5. 접시를 평준화 후 대학원 그라데이션 메뉴를 열려면 누릅니다. 목록 에 그라데이션 메뉴에가 고 남서 41 Ti로 터를 선택. 다음 위로 및 아래로 단추를 사용 하 여 메뉴의 목록에서 원하는 자당 그라디언트를 선택 합니다. 사용키를 누릅니다.
  6. 그라데이션 튜브 홀더를 그라데이션 메이커 접시에 놓습니다. 소유자에 튜브를 전송 합니다. 6 그라데이션까지 동시에 준비 될 수 있다. 눌러서 실행합니다. 그라데이션 메이커 프로그램된 속도 선형 그라데이션을 형성 하는 각도에서 튜브를 회전 합니다. 그라디언트를 준비 하는 몇 분 밖에 소요 됩니다.
  7. 프로세스가 완료 되는 때, 튜브 랙에 배치. 모자를 벗어. Ultracentrifuge 튜브의 상단에서 샘플 볼륨으로 동일한 볼륨을 제거 합니다.
  8. 조심 스럽게 lysate의 상단에 polysomes 15 20 A260 단위를 포함 하는 400-500 μ 로드. 로 터 양동이에 튜브를 놓고 균형을 합니다.
  9. 원심 분리기 260000 x g와 4 ° C 2 h SW 41로 터를 사용 하 여.

3. polysome 분류 및 샘플 컬렉션

참고: lysate 준비 소스에 따라 약간의 차이가 있지만, 그라데이션 준비 및 polysome 분별 프로토콜은 lysates의 모든 종류에 대해 동일 합니다.

  1. 완료 후에 ultracentrifugation의, 얼음에 튜브와로 터 양동이 놓습니다. 일부 수집기 및 그라데이션 fractionator ON을 설정 합니다. Fractionator 메뉴에서 검색 을 클릭 합니다. 분수 수집기에 24 컬렉션 튜브와 선반을 넣어.
  2. 이온을 제거 된 물으로 fractionator 측면 린스 저수지를 작성. 린스 키 10 s fractionator에 펌프를 씻어. 보정에 대 한 피스톤에 물으로 채워진 주사기 린스 어댑터를 연결 합니다.
  3. 컴퓨터에 fractionator 소프트웨어를 엽니다. 보정을 누릅니다. 기본 설정을 사용 하 고 확인을 누릅니다. 주사기에서 물을 주사를 준비가 되어있습니다.
  4. 보정 확인 을 누릅니다. 즉시 다음 5에 대 한 물 주입 시작 s. 이 시간 동안 UV 검출기 흐름 셀 통해 물 흐름 것 이다 하 고 악기를 측정 될 것 이다. 부호 0 교정 완료 나타납니다. 악기 분류에 대 한 준비가 되어있습니다.
  5. 주사기와 린스 어댑터를 제거 합니다. 팁은 fractionator의 피스톤에 연결 합니다.
  6. 황동 공기 밸브와 언론에 어 키 10 건조 관과 흐름 셀을 s. 공기 밸브를 닫습니다.
  7. 부드럽게 회전자 통에서 그라데이션 튜브를 제거 하 고 선반에 그것을 배치. 튜브의 상단에 튜브 홀더 캡 적용 신중 하 게 튜브 튜브 홀더 이동 하 고 위치에 그것을 잠금.
  8. 아래는 fractionator 피스톤 홀더를 배치 합니다. 종종, polysomal 악대는 눈으로 볼 수 있습니다. 분수 숫자와 볼륨에 대 한 원하는 설정을 소개 (500 μ/분수 24 분수는 일반적으로 충분 한). 파일을 적절 하 게 이름을 지정 합니다. 확인, 그리고 그래프를 이동 버튼을 누릅니다. 다음 창에서 검색 시작을 누릅니다. 확인을 눌러 설정 표시 됩니다. 수집기는 첫 번째 분수 시 궁 창에서 이동할 것 이다 고 피스톤 튜브로 이동 합니다. 피스톤 그라데이션의 상단에 도달 하면 선택한 속도에 느린 것입니다 하 고 분수를 수집 합니다. 완료 되 면, 피스톤 그라데이션 튜브 이동 합니다.
  9. 황동 공기 밸브와 언론 어 키를 마지막 분수 검색 fractionator에서 엽니다.
  10. 얼음에는 선반에서 튜브를 이동 합니다.
  11. 2 양의 RNA 정화 시 약 각 분수를 플래시 RNA 정화까지 액체 질소에서 고정을 추가 합니다. 또는, 단백질 분석 하는 경우, 서쪽 더 럽 히 (섹션 8 참조)에 대 한 집중에 10%의 최종 농도에 trichloroacetic 산을 추가 합니다.

4. 실시간 정량 데이터 분석 수준 동안 mRNAs의 정규화에 대 한 합성 RNA 생체 외에서 준비

참고: 대장균 OmpA mRNA 정규화에 대 한이 프로토콜에 사용 됩니다. 광범위 한 정체성 공부 유 기체의 mRNAs가 없는 다른 RNA (포유류 또는 Leishmania) 사용할 수 있습니다.

  1. OmpA 유전자30를 포함 하는 플라스 미드에서 표준 PCR 반응에 의해 SP6 발기인 시퀀스가 포함 된 OmpA DNA 파편을 준비 합니다.
  2. 혼합물의 100 µ L를 준비: 80 mM HEPES-코, pH 7.5, 16 m m MgCl2, 2 mM Spermidine, 10mm DTT, ATP, CTP, 3mm 3mm 3mm UTP, 3mm GTP, 0.5 U/μ RNase 억제제, OmpA PCR DNA, 3 μ s p 6 RNA 중 합 효소의 1 μ g 0.005 U/μ pyrophosphatase.
  3. 2 시간 동안 40 ° C에서 품 어.
  4. RNA 정화 키트에 의해 RNA를 정화.
  5. 분 광 광도 계에 의해 농도 측정 하 고 agarose 젤 전기 이동 법으로 검사.

5. RNA 격리 그라데이션 분수를 cDNA 준비

참고: RNase 억제제 ribonuclease 억제제로 사용 하는 경우이 프로토콜 RNA 정화와 직접 진행 합니다. 그러나, ribonuclease 억제제로 사용 하는 경우 헤 파 린 역전사 cDNA 준비에 사용 된 억제 됩니다. 따라서, 추가 정화 RNA의 헤 파 린 세포의 용 해 버퍼 및 그라데이션에 사용 된 경우에 필요 합니다. 헤 파 린 사용 cDNA 합성에 RNA를 준비 섹션 6을 참조 하십시오.

  1. RNA 정화 시 약을 포함 하는 샘플을 녹여, 20를 추가 실시간 정량 Pcr 결과의 정규화에 대 한 내부 통제로 합성 RNA의 ng. 한 수정 제외 하 고 제조 업체의 프로토콜에 따라 RNA 준비 진행. RNA 학년 glycogen (20 µ g) 이전 소 프로 파 놀 강수량의 1 µ L를 추가 합니다. 20-25 µ L RNase 무료 물 펠 릿 RNA를 분해.
    참고: Glycogen 캐리어 역할 하 고 손실을 방지 하 고 정화 동안 RNA 펠 릿을 시각화 하는 데 도움이. OmpA mRNA는 실시간 정량 Pcr 반응에 더 정규화에 사용 됩니다.
  2. 분 광 광도 계를 사용 하 여 적절 한 수익률을 보장 하는 RNA 농도 측정 합니다. 40, 60 및 prepolysomes로 monosomes를 포함 하는 RNA 분수의 동일한 볼륨을 결합 한다. 2-4 리보솜을 포함 하는 분수 빛 polysomes로 결합 하 고 5-8 리보솜과 분수 무거운 polysomes로 결합.
  3. 결합 된 분수에서 RNA의 5-10 µ L를 사용 하 여 cDNAs 키트를 사용 하 고 제조 업체의 권장 사항에 따라 준비.
  4. CDNA의 20 µ L를 nuclease 무료 물 80 µ L를 추가 합니다. -20 ° c.에 cDNA 샘플을 동결

6. RNA 정화 덤플링 오염에서

참고: 헤 파 린 같은 역전사 효소를 처리 하는 핵 산을 억제. 따라서, 세포의 용 해 버퍼 또는 그라데이션에서 헤 파 린 사용이 추가 정화 프로토콜을 사용 합니다.

  1. 순화 된 RNA 샘플을 1 M 최종 농도에 LiCl을 추가 합니다.
  2. 샘플을 혼합 하 고 1 시간에 대 한 얼음에 품 어.
  3. 샘플에서 16000 x g와 15 분 동안 4 ° C 회전.
  4. 가능한 한 피 펫을 사용 하 여 완전 한 상쾌한을 제거 합니다.
  5. 약 5 분 동안 펠 릿 건조
  6. 다시 물 RNase 무료 초기 볼륨에 펠 릿을 일시 중단 합니다.
  7. 260에 spectrophotometric 측정을 수행 RNA의 농도 결정 하기 위해 nm. 일반적으로, 샘플의 손실 최소화 됩니다.

7. 실시간 정량 Pcr 및 mRNA 분포의 데이터 분석

  1. 물, SYBR 녹색의 20 μ, 유전자 특정 뇌관 (2.5 μ M 세트)의 4.8 μ의 10.2 μ, cDNA의 5 μ를 결합 하 고 잘 섞어 384-잘 접시에 잘 triplicates에 당 10 μ를 로드.
  2. 접착 필름으로 접시를 단단히 커버 하 고 접시 5 분 1800 x g에서 원심.
  3. 실시간 PCR 악기를 사용 하 여 표 1에 표시 된 조건에서 정량 반응을 설정 합니다.
  4. 사이클 임계값 (CT)를 사용 하 여 값과 비교 CT (ΔΔCT) 방법31 계산 백분율 (%) prepolysomes, 빛, 그리고 무거운 polysomes 한 수정 설명된32 로 mRNA 분포의. 합성 RNA (OmpA 여기)를 사용 하 여 실시간 정량 데이터 분석에서 데이터 정규화에 대 한. 합성 RNA 상대 mRNAs 레벨을 계산 하 여 그라디언트의 다른 분수에 그들을 비교할 수 있는 정규화 제어를 제공 합니다.

8. 서 부 Blotting에 의해 Polysomal 분수에 단백질의 분석

  1. 100% (w/v) 주식에서 추가 trichloroacetic 산 (TCA) 10%의 최종 농도에 선택한 분수 (500 μ) 적어도 15 분, 5 분 대에 microfuge 분리기 얼음 계속, 상쾌한 삭제, 차가운 아세톤과 두 번 세척 및 25 μ S의 분해 전기 이동 법에 대 한 DS-페이지 샘플 로딩 버퍼입니다.
  2. SDS 페이지에 로드 하 고 다음 전송 전송 PVDF 막에 표준 전기 이동 법을 실시. 33를 더럽혀 서 진행 합니다.

결과

이 연구에서는 3 개의 서로 다른 소스에 polysomal 프로 파일링 기술의 응용 프로그램 설명: 기생 주요 Leishmania, 경작된 한 인간 세포 및 마우스 고환. Leishmania 세포 현 탁 액에 있는 액체 매체에서 자유롭게 성장, 경작된 한 인간 세포 플레이트에 부착 단층에서 성장 하 고 마우스 고환 조직 샘플을 나타냅니다. 메서드를 사용 하면 다른 종류의 서 스 펜 션, 다양 ?...

토론

자당 기온 변화도 의해 polysome 분별 RNA와 결합 및 분수의 단백질 분석은 개별 mRNAs 또는 전체 translatome의 변환 상태 뿐만 아니라 변환 조절 단백질 요인의 역할을 분석 하는 강력한 방법을 정상적인 생리 적 또는 질병 상태 기계입니다. Polysomal 프로 파일링은 Leishmania transcriptional 제어 크게 결 석 하 고 유전자 표현 규제는 주로 발생을 포함 하는 trypanosomatids와 같은 유기 체에 있는 변환 규칙을 ...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

저자는 오디오 녹음에 대 한 칭이 감사합니다. 연구 택 사스 기술 대학 건강 과학 센터에서 창업 자금에 의해 지원 되었다 및 변환 신경 과학 및 치료제 (CTNT) 우수의 센터에 의해 부여 PN CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; NIH 교부 금에 의해 부분에서 R01AI099380 K.Z. 제임스 C. 퍼레이드와 순 영 R. Baca CISER (줄기의 통합 교육 및 연구를 위한 센터) 학자 고 프로그램에 의해 지원 되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Instruments:
Gradient masterBiocomp Instruments Inc.108
Piston Gradient FractionatorBiocomp Instruments Inc.152
Fraction collectorGilson, Inc.FC203B
NanoDrop OneThermo ScientificNanoDrop One
Nikon inverted microscopeNikonECLIPSE Ts2-FL/Ts2
2720 Thermal CyclerApplied Biosystems by Life Technologies4359659
CO2 incubatorPanasonic Healthcare Co.MCO-170A1CUV
HERATHERM incubatorThermo Scientific51028063
Biological Safety Cabinet, class II, type A2NuAire Inc.NU-543-400
Revco freezerRevco TechnologiesULT1386-5-D35
Beckman L8-M UltracentifugeBeckman CoulterL8M-70
CentrifugeEppendorf5810R
CentrifugeEppendorf5424
Ultracentrifuge Rotor SW41Beckman Coulter331362
Swing-bucket rotorEppendorfA-4-62
Fixed angle rotorEppendorfF-45-30-11
Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228Applied Biosystems by life technologies4470661
TC20 Automated cell counterBio-Rad145-0102
HemacytometerHausser Scientific02-671-51B
Software 
Triax software Biocomp Instruments Inc.
Materials:
Counting slides, dual chamber for cell counterBio-Rad145-0011
1.5 mL microcentrifuge tubeUSA Scientific1615-5500
Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm)Seton Scientific7030
Syringe, 5 mLBD309646
BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch NeedleBD10020439
Nunclon Delta Surface plate, 14 cmThermo Scientific168381
Nunclon Delta Surface plate, 9 cmThermo Scientific172931
Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPESThermo Scientific569-0020
BioLite 75 cm3 flasksThermo Scientific130193
Nunc 50 mL conical centrifuge tubesThermo Scientific339653
Chemicals:
Trizol LSAmbion by Life Technologies10296028
HEPESFisher ScientificBP310-500
Trizma baseSigmaT1378-5KG
Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM)SigmaD6429-500ML
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF0926-50ML
Penicillin-Streptomycin (P/S)SigmaP0781-100ML
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)SigmaD8537-500ML
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O)Acros OrganicsAC413415000
Potassium Chloride (KCl)SigmaP9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40)Fluka (Sigma-Aldrich)74385
Recombinant Rnasin Ribonuclease InhibitorPromegaN2511
Heparin sodium saltSigmaH3993-1MU
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitorsRoche Diagnostics11836170001
GlycogenThermo ScientificR0551
WaterSigmaW4502-1L
CycloheximideSigmaC7698-1G
ChloroformFisher Scientific194002
Dithiotreitol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Ethidium BromideFisher ScientificBP-1302-10
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA)Fisher ScientificS316-212
OptimemLife Technologies22600050
Puromycin dihydrochlorideSigmaP8833-100MG
SucroseFisher ScientificS5-3KG
Trypsin-EDTA solutionSigmaT4049-100ML
Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase KitApplied Biosystems by life technologies4368814
Power SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems by life technologies4367659
HClFisher ScientificA144SI-212
IsopropanolFisher ScientificBP26324
Potassium Hydroxide (KOH)Sigma221473-500G
Anti-RPL11 antibodyAbcamab79352
Ribosomal protein S6 (C-8) antibodySanta Cruz Biotechnology Inc.sc-74459
1xM199SigmaM0393-10X1L
Lithium clorideSigmaL-9650
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificD128-500
Gel Loading Buffer IIThermo ScientificAM8546G
UltraPure AgaroseThermo Scientific16500-100
Trichloracetic acid (TCA)Fisher ScientificA322-100
SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrateThermo Scientific34580
FormaldehydeFisher ScientificBP531-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)SigmaL5750-1KG
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)SigmaP7626-5G
RNeasy Mini kitQiagen74104
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)SigmaA1852-1VL
Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP)SigmaC1506-250MG
Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP)SigmaU6625-100MG
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)SigmaG8877-250MG
SP6 RNA PolymeraseNEBM0207S
PyrophoshataseSigmaI1643-500UN
SpermidineSigmaS0266-1G

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