محسن المقايسة الصفر للاختبار في المختبر للهجرة الخلية مع كاميرا بصرية الآلي

Summary

هنا يصف لنا إجراء اختبار في الخلية الهجرة في المختبر مع مجهر كاميرا بصرية الآلي. والرزن الصفر قد استخدمت على نطاق واسع حيث يتبع إقفال نقطة الصفر لفترة زمنية محددة. المجهر الضوئي تمكن من كشف خلية الهجرة رخيصة ويمكن الاعتماد عليها.

Abstract

الهجرة الخلية هو عملية هامة يؤثر على جوانب كثيرة من الصحة، مثل التئام الجروح والسرطان، وأنها، لذلك، حاسمة بالنسبة لتطوير أساليب لدراسة الهجرة. والرزن الصفر منذ فترة طويلة في المختبر الأسلوب الأكثر شيوعاً لاختبار المركبات مع خصائص migration المناهضة والمؤيدة بسبب إجراءاتها بسيطة ومنخفضة التكلفة. مشكلة كثيرا ما ذكرت للفحص غير أن تراكم الخلايا عبر الحافة من الصفر. وعلاوة على ذلك، للحصول على البيانات من المقايسة، صور التعرض مختلفة يجب اتخاذ على مدى فترة من الزمن في نفس المكان الدقيق لمقارنة حركات الهجرة. يمكن استخدام برامج التحليل المختلفة لوصف إغلاق الصفر، لكنها العمالة المكثفة، غير دقيقة، ودورات القوات للتغيرات في درجات الحرارة. في هذه الدراسة، ونظهر أسلوب أمثل لاختبار تأثير الهجرة، مثلاً مع البروتينات التي تحدث بشكل طبيعي Lactoferrin الإنسان والأبقار وعلى الطرفي ن الببتيد لاكتوفيريسين على خط الخلية الظهارية هاكات. تحسين حاسم هو الصفر في برنامج تلفزيوني، مما يلغي تراكم الخلايا على طول الحافة الآنفة الذكر ويغسل. ويمكن تفسير ذلك بإزالة الكاتيونات، التي ثبت أن يكون لها أثر على keratinocyte خلية خلية الاتصال. لضمان كشف الحقيقية للهجرة، قبل التعامل مع ميتوميسين ج، مثبط توليف الحمض النووي، تمت إضافة إلى البروتوكول. وأخيراً، علينا أن نظهر الآلي الضوئية الكاميرا، مما يلغي دورات درجة الحرارة المفرطة، والعمل اليدوي مع تحليل إغلاق الصفر، مع تحسين في إمكانية تكرار نتائج وضمان تحليل المقاطع متطابقة من الصفر على مر الزمن.

Introduction

الترحيل هو عملية هامة يؤثر على العديد من الجوانب الفسيولوجية. في التئام الجروح، يسهل الهجرة epithelization إعادة الجلد. في الجروح غير الشفاء، مثل الجروح المزمنة، البكتيريا الانتهازية تسبب العدوى للجرح، والجروح المفتوحة ومثالية لنمو البكتيريا وتشكيل بيوفيلم^1،2. بيوفيلم أحد أسباب التنمية لمقاومة البكتيريا، وواحدة من أكبر الإخطار التي تهدد المجتمع الحديث لدينا³. في التئام الجروح، لا يمكن اختراق الخلايا المناعية بيوفيلم. بالسرطان، وهجرة الخلايا السرطانية خطوة محورية لورم خبيث، وهو السبب الرئيسي للوفاة للمرضى الذين يعانون من الأورام الصلبة^4،5. ولذلك، من الأهمية بمكان أن يكون قادراً على دراسة الهجرة.

غالباً ما يستخدم المقايسة الصفر لاختبار الهجرة الخلية لأنها رخيصة وسهلة لتنفيذ خطوط الخلية ملتصقة، مثل تنتجها الخلايا الليفية، بطانية، والخلايا الظهارية خطوط^6،7. اليوم، توجد عدة طرق لأداء الخدوش⁸، ووردت مواد مختلفة لاستخدامها، بما في ذلك المسواك⁹وخلية كاشطات¹⁰وأشعة الليزر¹¹والتيارات الكهربائية¹². جميع الأساليب مختلفة من إيجابيات وسلبيات، والأسلوب ينبغي البت فيها وفقا لأداة نوع، والميزانية، وتحليل الخلية. على سبيل مثال، إذا كان يتطلب نوع الخلية المستخدمة في طلاء، إزالة الضغط اليدوي، مثلاً مع تلميح مسواك أو ماصة، سوف تؤثر الهجرة داخل المنطقة، ينبغي أن تستخدم أسلوباً مختلفاً. في هذه الدراسة، سوف نركز على إلغاء اليدوي.

الجانب سلبي القشط اليدوي هو تفاوت حجم، وأشكال خدوش، وتراكم الخلايا على الحواف من الصفر. توجد العديد من البروتوكولات، وتنصح ورقة المذكورة عالية زيادة السرعة و/أو غسيل شامل بعد الخدش¹³. بالإضافة إلى ذلك، استخدمت عدة طرق لتقليل الانتشار، منذ انتشار الخلايا لا يمكن تمييزها عن الهجرة وذلك قد تعطي نتائج إيجابية كاذبة للهجرة. وأفادت بعض الأساليب هي المجاعة المصل السابق لنقطة الصفر¹⁴ وتناقص كمية المصل¹⁵. غير أن أيا من هذه الأساليب يمكن التأكد من أنه لا يوجد أي انتشار. ولذلك، نحن التقرير معالجة المسبقة للخلايا مع ميتوميسين ج لضمان النتائج الحقيقية للهجرة. ميتوميسين ج هو مضاد حيوي الذي يمنع تركيب الدنا عن طريق تشكيل سندات تساهمية مع الحمض النووي، مما يحول دون فصل¹⁶الحمض النووي. قبل التعامل مع ميتوميسين ج والغسيل مع برنامج تلفزيوني قبل الخدش، يوضح الكشف عن إغلاق الفجوة الحقيقية هجرة الخلايا (الشكل 1).

سمة من سمات جميع الأساليب هو الحاجة إلى نظام لتحليل عملية الهجرة¹⁷. مشتركة ووسيلة غير مكلفة لتحليل التقدم استخدام مجهر الضوء-الحقل إلى التقاط صور الصفر في نقاط زمنية محددة سلفا، تليها تحليلاً لإغلاق الفجوة في^18،برمجيات صورة¹⁹. هذا الأسلوب يستغرق وقتاً طويلاً، ولا يمكن الاعتماد عليها فيما يتعلق بالتقاط الصور في نفس المكان والتركيز، وقوات الحركة من حاضنة للكاميرا دورات للتغيرات في درجات الحرارة أثناء التقاط الصور. وقد وضعت أساليب أخرى للكشف عن الهجرة عن طريق قياس التدفق الحالي. التغيرات الراهنة، كخلايا تغطي مساحة أكبر على اللوحة، نصها كزيادة في مقاومة²⁰. بقياس مقاومة، لا يتأثر بيئة الخلايا، وذلك يعتبر الطريقة غير الغازية. يعتمد هذا الأسلوب على لوحات المتخصصة مع أقطاب الذهب، ومكلفة، إلا أنها تتيح الكشف عن العديد من العمليات، مثل انضمام الخلوية والانتشار والهجرة وموت الخلية. عيب كبير من هذا الأسلوب أن قياس مقاومة لا تشير مباشرة إلى الهجرة، كما أن عوامل مثل درجة الحرارة يكون لها تأثير كبير على المقاومة. يمكن أن يكون سبب تغييرات في المقاومة العديد من العوامل التي لا يتم مراجعتها بواسطة البرمجيات، ويزيد من صعوبة تحليل البيانات. ولذلك، يتطلب عدم وجود التصور مجهر خفيفة تقليدية للتحقق من الهجرة.

للتغلب على العديد من الجوانب السلبية للتقنيات المتاحة، نستخدم كاميرا بصرية الآلي في الوقت الحقيقي. الكاميرا الضوئية نظام كشف مع مجهر الفائق في منصة صغيرة مع عدسة، ووحدة إضاءة، وكاميرا رقمية. فقد برمجيات مدمجة، التي يمكن اختبار الهجرة وانتشار من بين أشياء أخرى. وتستخدم اثنين من خوارزميات للكشف عن الهجرة، لتحليل النمو وحركية الهجرة من الخلايا، التي تسمى الانتشار والجرح الشفاء التحليل، على التوالي. يتم تحليل انتشار استناداً إلى خوارزمية تجزئة صورة خطوتين ينطبق تحليل مادة للكشف عن الفرق بين المناطق المغطاة بالخلية (يظهر باللون الأصفر) وفارغة خلفية المناطق بتحليل الرسم البياني المتقدم. ويستند الجرح الشفاء تحليل خوارزمية الخطوات الثلاث التي يكتشف أحادي الطبقة الخلية، يحدد موقع الفجوة الجرح، ويحدد عرض الفجوة. وتجري هذه الخطوات في نقاط زمنية يحددها المستخدم، ويتم تقديم البيانات كمنطقة مغطاة وعرض الفجوة والفجوة في مجال. ومن المزايا الكبيرة لهذا الجهاز أنه يمكن تصوير الخلايا ملتصقة من خلال السائل بسبب زاوية الكاميرا²¹. توليد الصور لينستاكيس إمالة الكاميرا التي من المتوقع إلى كدسة z z-طائرة واحدة التأكد من وجود الصور في التركيز (الشكل 2). ض-مداخن تم إنشاؤها بواسطة دمج سلسلة الصور (مثلاً 40) اتخذت عمودي على حافة الجرح، وعبر كامل الجرح. ض-رزمة يتيح التقاط عمق طبقة الخلايا، فضلا عن طائرة في التركيز عبر الجرح. وعلاوة على ذلك، يمكن وضع سلسلة الصور معا لمجموعة فيديو من الصور، بنقرة زر واحدة.

علينا أن نظهر بروتوكولا أمثل للكشف عن الهجرة في خط الخلايا keratinocyte هاكات. نحن اختبار Lactoferrin والببتيد على الطرفي ن، لاكتوفيريسين، من البشر والأبقار، لتحليل تأثيرها على الهجرة كما أثبتت هذه الجزيئات للعديد من التطبيقات كمضادات الميكروبات والمناعة تحوير جزيئات^{22 , 23}-كانت مقارنة مع أربعة مركبات من المركبات غير المعالجة هاكات الخلايا وعامل نمو البشرة (لو) كان يستخدم كعنصر إيجابي.

Protocol

الإعداد التجريبية بأي قيود أخلاقية وقانونية، وجرى الاتفاق مع جامعة روسكيلد. لمحة عامة عن طريقة إعداد تجريبية يتبين في الشكل 1 ، وآليات الكاميرا الضوئية في الشكل 2.

1-إعداد

1. تنفيذ كافة الخطوات في مقعد الاندفاق الصفحي عقيمة بتنظيف مقاعد البدلاء وجميع المعدات مع الإيثانول 70% قبل البدء التجربة.
2. مكان الكاميرا الضوئية في حاضنة تقليدية في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ لضمان أفضل الظروف للخلايا.
3. تنمو خلايا هاكات في وسائط الإعلام دميم مع 10% FBS والعاشر 1 المضادات الحيوية (البنسلين وستربتوميسين) في قارورة T75.
4. استخدام التربسين 1 x 1 مل لفصل الخلايا ودون زراعتها كل 3-4 أيام، بتفريق ذلك فوق الطبقة الخلوية. قبل الحرارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.

2-توليد أحادي الطبقة هاكات الخلايا في صفيحة ميكروتيتير 48-آبار

1. إزالة المتوسطة من قارورة T75 مع ماصة باستور.
2. يغسل خلايا ملتصقة قارورة بإضافة 5 مل س 1 PBS العقيمة إلى قارورة T75.
   ملاحظة: تأكد من أن برنامج تلفزيوني خال من الكالسيوم والمغنيسيوم.
3. تعميم برنامج تلفزيوني وإزالته مع ماصة باستور.
4. كرر الخطوة 2، 2، 2-3.
5. إضافة التربسين 1 x 1 مل قارورة وتفريق عبر طبقة الخلية.
6. احتضان قارورة على 37 درجة مئوية في حاضنة تقليدية حتى يتم فصل الخلايا (5-8 دقيقة غير كافية لمعظم خطوط الخلايا).
7. عرض تحت المجهر إذا كان يتم فصل الخلايا. متى يتم فصل الخلايا، إضافة 9 مل وسائط الثقافة العادية مع 10% FBS لإلغاء تنشيط التربسين 1 x.
8. حساب الخلية التي تحتوي أما هيموسيتوميتير، عداد كولتر أو ما شابه.
   ملاحظة: يمكن استخدام تريبان الأزرق لعرض الخلايا الميتة. ومع ذلك، في التربسين 1 x هاكات الخلايا هي تماما جولة عندما كان على قيد الحياة.
9. نقل 7.5 × 10⁴ خلايا/بئر في 250 ميليلتر 10% FBS وسائط إلى لوحة القاع المستديرة زراعة الأنسجة 48-جيدا (لوحة القياسية).
   ملاحظة: يمكن أيضا إعداد المقايسة في 6-12-، 24-أو لوحات 96-جيدا، وكلها يمكن أن تكون جزيئي تحت المجهر الضوئي.
10. تحرك بلطف اللوحة من جانب إلى جانب للتأكد من الخلايا تنتشر على قدم المساواة في الآبار، أو سيتم جمع الخلايا في مركز الآبار. فحص تحت مجهر خفيفة للتأكد من أن الخلية ينتشر بالتساوي في وسائل الإعلام
11. وضع اللوحة حاضنة₂ CO تقليدية في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو حتى الخلايا انضمت إلى الجزء السفلي من الآبار.

3-إضافة المحفزات لآثار الهجرة

1. تحقق إذا كانت الآبار روافد 90-95% تحت مجهر خفيفة.
2. إعداد 10 ميكروغرام/مل من mitomycin C في مبلغ مناسب من المتوسط.
   ملاحظة: في هذه الدراسة، يتم الاحتفاظ "ميتوميسين ج" في 4 درجات مئوية في حل أسهم في 1 ملغ/مل. ويمكن تخزين mitomycin C في حل لمدة أسبوع واحد في الظلام في 2-8 درجة مئوية.
3. قم بإزالة وسائط المستهلك مع ماصة باستور من كل بئر.
4. إضافة 250 ميليلتر 5 ميكروغرام/مل من mitomycin C لكل بئر.
5. احتضان لوحة ح 2 في CO 37 درجة مئوية و 5%₂.
6. تحضير محفزات الببتيدات بتمييع منهم في مبلغ مناسب من المتوسط.
   ملاحظة: في هذه الدراسة، جرى اختبارها كل البشر والبقر Lactoferrin ولاكتوفيريسين في 25 ميكروغرام/مل في وحدة تخزين من 250 ميليلتر
7. إزالة المتوسطة مع ميتوميسين ج مع ماصة باستور.
8. غسل الآبار x 1 مع 250 ميليلتر من 1 × برنامج تلفزيوني (درجة حرارة الغرفة) وإزالة الغسيل مع باستور "الماصة؛".
9. إضافة 250 ميليلتر من 1 x PBS والصفر يدوياً الآبار عمودياً مع تلميح ماصة 200 ميليلتر. استخدام تلميح ماصة جديدة لكل بئر.
10. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 250 ميليلتر الببتيد المحفزات.
11. جبل اللوحة في نظام التصوير الضوئي عن طريق ضبط الخناق على كلا الجانبين من اللوحة. اترك الغطاء على لوحة ميكروتيتير.
    ملاحظة: يمكن أن تعمل الكاميرا مع الغطاء مفتوح إذا لزم الأمر.

4. قم بإعداد البرنامج للكاميرا الضوئية على الكمبيوتر

1. انقر فوق الحصول على شريط المهام على اليسار.
2. اختر دالة التئام الجروح في شريط المهام على اليسار.
3. اختر نوع لوحة بالنقر فوق لوحة الرسم التوضيحيأدناه.
4. إلغاء تحديد الآبار، ولا تكون قيد الاستعمال، بوضع علامة عليها، ثم انقر فوق تمكين في الجانب الأيسر العلوي على الشاشة.
   ملاحظة: يتم تحديد جميع الآبار بشكل افتراضي.
5. ضبط تركيز العدسة على الآبار لتناسب موقف الخلايا بالنقر على أحد الآبار.
   ملاحظة: يمكن أيضا تعديل ضبط تلقائي يدوياً بتحريك الشريط على يمين لوحة الرسم التوضيحي.
6. تعيين الفترة الزمنية للصور ضمن الفاصل الزمني للصورة (مثلاً (00: 30:00)).
7. تعيين عدد التكرار لتناسب الفترة المطلوبة (مثلاً 97 من التكرار).
8. بدء التشغيل بواسطة النقر فوق زر ابدأ في الزاوية اليمنى السفلي.

النتائج

هاكات خط خلايا keratinocyte، أحد أنواع الخلايا الأكثر وفرة في الجلد. عند حدوث جرح، تبدأ خلايا الجلد تتكاثر وتهاجر عبر إلى السرير الجرح لإغلاق الجرح (الشكل 3). كلتا العمليتين، لذلك، أهمية قصوى للعلاج السليم.

يمكن تتبع الكاميرا ال?...

Discussion

أهمية الهجرة في دراسات التنمية والتئام الجروح، وعلم المناعة والسرطان قد أدى إلى العديد من الأساليب المختلفة لدراسة الهجرة. يمكن أن تكون الهجرة أما تعبير عن التوسع أو إغلاق الفجوة بالخلايا. يتم اختبار الإغلاق في أغلب الأحيان من الصفر، كما أنه من الأسهل لتنمو الخلايا في أحادي الطبقة ومن ثم ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
oCelloScope	BioSense Solution ApS		Optical camera
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell			Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medium for HaCaT
FBS	Gibco	10270	Fetal bovine serum
PBS	Gibco	D837	Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibiotics
Trypsin (10x)	Sigma	T3924
Mitomycin C	Tocris	3258	Inhibits proliferation
Microtiter plate	Greiner Bio-one	677 180
Incubator	Panasonic		37°C, 5% CO2
Hemocytometer	Assistent		Türk (0.1 mm)
Pipet boy	Accu-Jet pro