אופטימיזציה Assay מאפס במבחנה בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית

Summary

כאן נתאר הליך כדי לבחון את התא ההעברה במבחנה עם מיקרוסקופ אופטי מצלמה אוטומטית. וזמינותו מאפס כבר בשימוש נרחב שבו הסגר על השריטה מלווה קצוב. מיקרוסקופ אופטי מאפשר זיהוי אמין וזול של נדידת תאים.

Abstract

נדידת תאים הוא תהליך חשוב זה משפיע על היבטים רבים של בריאות, כגון ריפוי הפצע סרטן, וזה, לפיכך, חיוני לפיתוח שיטות ללמוד את ההעברה. וזמינותו מאפס כבר זמן רב השיטה הנפוצה ביותר במבחנה לבדיקת תרכובות בעלות מאפיינים migration נגד פרו בגלל הליך שלו זולה ופשוטה. אולם, לבעיית וזמינותו מדווחים לעתים קרובות היא ההצטברות של תאי מעבר לקצה של השריטה. יתר על כן, כדי להשיג מידע וזמינותו, תמונות של חשיפות שונות חייב להילקח על פני תקופה של זמן, באותו מקום בדיוק כדי להשוות את התנועות של ההעברה. ניתן להשתמש בתוכניות ניתוח שונים כדי לתאר את הסגר מאפס, אך הם עבודה אינטנסיבית, אינו מדויק, ואת כוחות מחזורים של שינויי טמפרטורה. במחקר זה, נדגים שיטה ממוטב עבור בדיקת ההשפעה ההעברה, למשל עם החלבונים המתרחשים באופן טבעי האדם - ו שור-לקטופרין, שלהם פפטיד N-מסוף Lactoferricin על הקו תאים אפיתל HaCaT. אופטימיזציה מכריע היא לשטוף את לגרד ב- PBS, מה שמבטל את הצטברות תאים לאורך הקצה הנ. זו יכולה להיות מוסברת על ידי ההסרה של קטיונים, אשר הוכחו יש השפעה על חיבור תאים תאים תקין. כדי להבטיח זיהוי נכון של הגירה, בטיפול מראש עם מיטומיצין C, מעכב סינתזת ה-DNA, נוספה לפרוטוקול. לבסוף, נדגים אוטומטיות אופטי למצלמה, מה שמבטל מחזורי בטמפרטורה הקיצונית, כפיים עם ניתוח סגירת מאפס, תוך שהיא משפרת על הפארמצבטית להבטיח ניתוח קטעים זהים של השריטה לאורך זמן.

Introduction

ההעברה היא תהליך חשוב המשפיע מספר היבטים פיזיולוגיים. בריפוי הפצע, העברת מקל epithelization מחדש של העור. הפצעים ללא ריפוי, כגון לפצעים כרוניים, חיידקים הזדמנותית לגרום לזיהום הפצע, פצעים פתוחים הם אידיאליים עבור גידול חיידקים ועל היווצרות biofilm^1,2. Biofilm הוא אחד הגורמים להתפתחות חיידקים עמידים, אשר הוא אחד האיומים הגדולים ביותר שלנו בחברה המודרנית³. בריפוי הפצע, תאים חיסוניים לא יכול לחדור את biofilm. ב סרטן, העברה של תאים סרטניים הוא צעד מכריע של גרורות, שהוא הגורם העיקרי למוות אצל חולים עם גידולים מוצקים^4,5. לכן, זה הכרחי להיות מסוגל ללמוד ההעברה.

גירוד וזמינותו משמש לעתים קרובות כדי לבדוק את נדידת תאים כי זה זול וקל לביצוע על שורות תאים חסיד, כגון פיברובלסט, אנדותל, ותא אפיתל קווים^6,7. כיום, קיימות מספר שיטות לביצוע שריטות⁸, חומרים שונים דווח לשמש, לרבות קיסמים⁹, מגרדים תא¹⁰, לייזרים¹¹זרמים חשמליים¹². כל אחת מהשיטות יש והחסרונות השונים, השיטה צריכה להיות החליט על פי הכלי סוג תקציב, ניתוח התא. לדוגמה, אם סוג התא בשימוש דורש ציפוי, הסרת לחץ ידני, למשל עם טיפ קיסם או פיפטה, ישפיע הדבר על הגירה בתוך האזור, יש להשתמש בשיטה שונה. במחקר זה, אנו נתמקד גירוד ידנית.

חסרון עבור גירוד ידני הוא וריאציה של גודל, צורות של השריטות, הצטברות של תאים בקצוות של השריטה. קיימים פרוטוקולים רבים, ומייעץ מאמר מצוטט מאוד מהירות מוגברת ו/או שטיפה לאחר גירוד¹³. בנוסף, מספר שיטות השתמשו כדי לצמצם את התפשטות, כיוון התפשטות התאים ניתן להבחין בין הגירה ולכן עלולה להחזיר תוצאות חיוביות שגויות של הגירה. כמה דיווח שיטות הרעבה סרום שקדמו מאפס¹⁴ ולאחר הפחתת כמות הנסיוב¹⁵. עם זאת, אף אחת מהשיטות האלה תוכל להבטיח שיש אין התפשטות. לכן, אנחנו מדווחים על טיפול טרום התאים עם מיטומיצין C כדי להבטיח תוצאות אמת של הגירה. מיטומיצין C הוא אנטיביוטיקה כי מעכב סינתזת ה-DNA על ידי יצירת של קשר קוולנטי עם ה-DNA, ומונע את הדנ א של הפרדת¹⁶. על ידי טיפול מראש עם מיטומיצין C ושטיפת תסיים לפני גירוד, הסגר שזוהו על הפער מדגים את ההעברה נכון של התאים (איור 1).

מאפיין של כל השיטות הוא הצורך עבור מערכת לנתח את תהליך ההעברה¹⁷. נפוצה שיטה זולה כדי לנתח את ההתקדמות הוא להשתמש במיקרוסקופ אור-השדה לקחת תמונות של השריטה בנקודות זמן שנקבע מראש, ואחריו ניתוח של סגירת הפער התמונה תוכנה^18,19. שיטה זו גוזלת זמן, אמין לגבי לצלם באותו מקום, מיקוד, התנועה מן החממה המצלמה כוחות מחזורים של שינויי טמפרטורה בזמן מצולמות התמונות. פותחו שיטות אחרות כדי לזהות ההעברה על ידי מדידת הזרם הנוכחי. השינויים הנוכחיים, כתאי לכסות יותר שטח על הצלחת, אשר קרא כמו עלייה עכבה²⁰. על ידי מדידת התנגדות, הסביבה של התאים אינו מושפע, השיטה ולכן היא נחשבת לא פולשנית. שיטה זו מסתמכת על צלחות מיוחדות עם אלקטרודות זהב, אשר יקר, אבל הם מאפשרים זיהוי של תהליכים רבים, כגון הדבקות הסלולר, הפצה, העברה מוות של תאים. חיסרון גדול של שיטה זו הוא כי המדידה עכבה לא ישירות מצביעות על ההעברה, כמו גורמים כמו טמפרטורה יש השפעה רבה על עכבה. שינויים עכבה יכולה להיגרם על ידי מספר גורמים אשר לא נבדקות על ידי התוכנה, יותר מקשה על הניתוח של הנתונים. לפיכך, היעדר ויזואליזציה דורש מיקרוסקופ אור קונבנציונלי כדי לוודא העברה.

כדי להתגבר על רוב המגרעות של טכניקות זמינים, אנו משתמשים במצלמה אופטית אוטומטית בזמן אמת. המצלמה אופטי היא מערכת זיהוי עם מיקרוסקופ תפוקה גבוהה ב פלטפורמה קטן עם עדשה, יחידת תאורה של מצלמה דיגיטלית. יש תוכנה מובנית, אשר ניתן לבחון ההגירה והתפשטות בין היתר. כדי לזהות את ההעברה, שני אלגוריתמים משמשים כדי לנתח את הצמיחה וקינטיקה ההעברה של תאים, אשר נקראים ההתפשטות ו הפצע ריפוי ניתוח, בהתאמה. ניתוח התפשטות הוא מבוסס על אלגוריתם פילוח תמונה בשני שלבים שחל במרקם ניתוח כדי לזהות את ההבדל בין שטחים מכוסי תא (מוצג בצהוב) וריק רקע אזורים על-ידי ניתוח ההיסטוגרמה מתקדם. הפצע ריפוי ניתוח מבוססת על אלגוריתם שלושה שלבים מזהה את טפט תא, מאתרת את הפער הפצע, והוא קובע את רוחב המרווח. השלבים נערכים אצל המוגדרות על-ידי המשתמש בזמן נקודות, הנתונים מוצג באזור מקורה, רוחב המרווח ואזור הפער. אחד היתרונות הגדולים של מחשב זה הוא כי הוא מאפשר הדמיה של תאים חסיד דרך נוזלי בגלל זווית המצלמה²¹. תמונות lenstakes בעת הטיית המצלמה מוקרנים אל ערימה-z של z-מטוס בודד ליצור כדי להבטיח כי התמונות בפוקוס (איור 2). z-במחסן נוצרות על-ידי מיזוג הסדרה של תמונות (למשל 40) שצולמו בניצב לקצה הפצע, ועל -פני כל הפצע. Z-הערימות מאפשר לכידה של העומק של השכבה תא, כמו גם מטוס בפוקוס על פני הפצע. יתר על כן, הסדרה של תמונות שאפשר להרכיב על אוסף וידאו של התמונות, בלחיצה על כפתור.

נדגים פרוטוקול ממוטבת גילוי של ההעברה בקו תא תקין HaCaT. בדקנו לקטופרין, שלה N-מסוף פפטיד, Lactoferricin, בני האדם, פרות, כדי לנתח את השפעתם על הגירה כמו מולקולות אלה הוכחו יש יישומים רבים מיקרוביאלית ו החיסונית להתכוונן מולקולות^{22 , 23}. תרכובות ארבע, לעומת תאים HaCaT אינו מטופל, גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) שימש פקד חיובי.

Protocol

הגדרת הניסוי נערך מסכים עם אוניברסיטת רוסקילדה, ויש אין מגבלה אתית ומשפטית. סקירה כללית של הסידור ניסיוני ניתן לראות באיור 1 ואת המנגנונים של המצלמה אופטי באיור2.

1. הכנה

1. לבצע את כל הצעדים זרימה שכבתית-ספסל סטרילי על-ידי ניקוי הספסל, חסכון כל עם 70% אתנול לפני התחלת הניסוי.
2. מקם את המצלמה אופטי חממה קונבנציונאלי ב 37 ° C עם 5% CO₂ ליצירת תנאים אופטימליים עבור התאים.
3. לגדל תאים HaCaT בתקשורת DMEM עם 10% FBS ואנטיביוטיקה 1 x (פניצילין, סטרפטומיצין) בבקבוקון T75.
4. השתמש טריפסין 1 x 1 מ"ל כדי לנתק את התאים ואת תת מטפח אותן כל 3-4 ימים, על ידי פיזור זה מעל השכבה הסלולר. מחממים מראש לטמפרטורת החדר לפני השימוש.

2. יצירת של טפט של HaCaT תאים בצלחת Microtiter 48-ולס

1. הסר את המדיום של הבקבוק T75 עם פיפטה פסטר.
2. רחץ התאים חסיד הבקבוק על-ידי הוספת מ ל 1 x PBS עקר הבקבוקון T75.
   הערה: ודא PBS חינם של סידן ומגנזיום.
3. הפיצו את PBS ולהסיר אותו עם פיפטה פסטר.
4. חזור על שלב 2.2-2.3.
5. להוסיף הבקבוקון טריפסין 1 x 1 מ"ל ומעוררים אותה לאורך השכבה התא.
6. דגירה. הבקבוק ב- 37 מעלות צלזיוס חממה קונבנציונאלי עד התאים הם צמודי קרקע (5-8 דקות מספיקה עבור מרבית שורות תאים).
7. להציג במיקרוסקופ אם התאים הם צמודי קרקע. ברגע התאים מנותקים, להוסיף 9 מ של התקשורת תרבות קבוע עם 10% FBS כדי להשבית את טריפסין 1 x.
8. לספור את התא עם, או hemocytometer קולטר-מונה או דומה.
   הערה: Trypan blue יכול לשמש כדי להציג תאים מתים. עם זאת, טריפסין 1 x HaCaT תאים הם לגמרי בסיבוב כאשר בחיים.
9. העברה 7.5 x 10⁴ תאים/טוב בתקשורת FBS 10% µL 250 צלחת תרביות רקמה של 48-ובכן להטלטל עגול (צלחת רגילה).
   הערה: Assay גם ניתן להגדיר ב- 6-, 12-, 24- או צלחות 96-ובכן, אשר כולם יכולים להיות לבדיקה במיקרוסקופ אופטי.
10. להניע בעדינות את הצלחת מצד לצד כדי להבטיח שהתאים מתפשטים באופן שווה בתוך הבארות, או התאים אנקה במרכז הבארות. לבדוק תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהתא מופצת באופן שווה בתקשורת
11. לשים את הצלחת חממה₂ CO קונבנציונאלי ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד התאים יש דבקה בתחתית הבארות.

3. תוספת של גירויים לאפקטים ההעברה

1. בדוק אם הבארות הן 90-95% confluent תחת מיקרוסקופ אור.
2. הכינו 10 µg/mL של מיטומיצין C בהכמות המתאימה של המדיום.
   הערה: במחקר זה, מיטומיצין C נשמרת ב 4 ° C בפתרון מניות ב 1 מ"ג/מ"ל. מיטומיצין C בתמיסה ניתן לאחסן שבוע בחושך ב 2-8 ° c
3. הסר את המדיה בילה עם פיפטה פסטר מכל קידוח.
4. להוסיף 250 µL של µg/mL 5 של מיטומיצין C בכל טוב.
5. דגירה את הצלחת. בשביל 2 h-CO 37 ° C ו-5%₂.
6. הכן גירויים של פפטידים על ידי דילול אותם בסכום המתאים של המדיום.
   הערה: במחקר זה, נבדקו שור ואנושי לקטופרין והן Lactoferricin-µg/mL 25 בנפח של 250 µL
7. הסר את המדיום עם מיטומיצין C עם פיפטה פסטר.
8. לשטוף את הבארות x 1 עם µL 250 1 x PBS (טמפרטורת החדר) ולהסיר לשטוף עם פסטר פיפטה.
9. להוסיף µL 250 ל- 1 x PBS ותגרד באופן ידני את הבארות אנכית עם טיפ פיפטה µL 200. השתמש טיפ פיפטה חדש עבור כל טוב.
10. להסיר את PBS ולהוסיף 250 µL פפטיד גירויים.
11. לטעון את הצלחת במערכת אופטי מצלמה על-ידי התאמת את הברגים משני צידי הלוח. להשאיר את המכסה הצלחת microtiter.
    הערה: המצלמה יכולה לפעול עם מכסה פתוח במידת הצורך.

4. להגדיר את התוכנית עבור המצלמה אופטי במחשב

1. לחץ על לחצן ייבוא בשורת המשימות בצד השמאל.
2. בחר בפונקציה ריפוי פצעים בשורת המשימות בצד השמאל.
3. בחר את סוג הלוח על ידי לחיצה מתחת לצלחת איור.
4. ביטול בחירה של וולס, לא נעשה בו שימוש, על-ידי סימונן ולחץ לאפשר בצד השמאלי העליון על המסך.
   הערה: וולס כל נבחרות כברירת מחדל.
5. התאם את המוקד של העדשה על הבארות כדי להתאים את המיקום של התאים על-ידי לחיצה ימנית על אחת הבארות.
   הערה: פוקוס אוטומטי יכול גם להיות מותאם באופן ידני על-ידי הזזת הסרגל בצד ימין של האיור צלחת.
6. הגדר את תקופת הזמן לתמונות תחת התמונות מרווח (למשל (00: 30:00)).
7. להגדיר את מספר החזרות שיתאימו תקופת הרצוי (למשל 97 חזרות).
8. התחל ההפעלה על ידי לחיצה על לחצן ' התחל ' בפינה הימנית התחתונה.

תוצאות

HaCaT הוא קו תא תקין, אחד הסוגים התא הנפוץ ביותר של העור. כאשר פצע, תאי העור מתחיל להתרבות ולהעביר מעל למיטה הפצע כדי לסגור את הפצע (איור 3). שני התהליכים הם, לכן, חשיבות עליונה עבור ריפוי תקין.

המצלמה אופטי יכול לעקוב אחר שני תהל...

Discussion

החשיבות של ההגירה במחקרים של פיתוח, ריפוי פצעים, אימונולוגיה, וסרטן הוביל מספר שיטות שונות ללמוד ההעברה. ההעברה יכול להיות ביטוי של ההתרחבות או סגירת הפער על ידי התאים. לרוב הסגר על השריטה נבדק, כפי שהוא קל יותר לגדל תאים חד שכבתי ולאחר מכן לבצע שריטה יותר גוברת התאים לטופס מסוים⁸

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
oCelloScope	BioSense Solution ApS		Optical camera
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell			Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medium for HaCaT
FBS	Gibco	10270	Fetal bovine serum
PBS	Gibco	D837	Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibiotics
Trypsin (10x)	Sigma	T3924
Mitomycin C	Tocris	3258	Inhibits proliferation
Microtiter plate	Greiner Bio-one	677 180
Incubator	Panasonic		37°C, 5% CO2
Hemocytometer	Assistent		Türk (0.1 mm)
Pipet boy	Accu-Jet pro