체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화

요약

여기는 자동된 광학 카메라 현미경으로는 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 테스트 하는 절차에 설명 합니다. 스크래치 분석 결과 널리 사용 되었습니다 어디 스크래치의 폐쇄는 세트 기간에 대 한 다음. 광학 현미경 세포 이동의 신뢰할만 하 고 저렴 한 감지 수 있습니다.

초록

셀 이동 건강, 암, 상처 치유 등의 여러 측면에 영향을 미치는 중요 한 프로세스 이며 그것은, 따라서, 마이그레이션 공부 방법 개발을 위한 중요 한. 스크래치 분석 결과 가장 일반적인 생체 외에서 방법 그것의 저가 및 간단한 절차 때문에 안티 프로 migration 속성으로 화합물을 테스트 하. 그러나, 분석 결과의 자주 보고 하는 문제는 처음의 가장자리에 걸쳐 세포의 축적을 이다. 또한, 분석 결과에서 데이터를 얻기 위해 다른 노출의 이미지 이동 해야 시간의 기간 동안 정확한 같은 자리에는 이동의 움직임을 비교 하. 다른 분석 프로그램 스크래치 폐쇄를 설명 하기 위해 사용할 수 있습니다 하지만 그들은 노동 집약, 부정확 한, 및 온도 변화에의 힘 주기. 이 연구에서는 마이그레이션 효과, 예를 들면 자연스럽 게 발생 단백질 인간 및 소 Lactoferrin 및 그들의 N 맨끝 펩 티 드 Lactoferricin HaCaT 상피 세포 선에 대 한 최적화 된 방법을 설명 합니다. 중요 한 최적화는 세척 하 고 가장자리를 따라 셀의 상기 축적을 제거 하는 PBS에 스크래치 이다. 이 keratinocyte-셀 연결에 영향을 보여왔다 양이온의 제거에 의해 설명 될 수 있습니다. 이동의 진정한 검출을 보장 하기 위해, 미리 미토마이신 C, DNA 합성 억제제로 치료 프로토콜에 추가 되었습니다. 마지막으로, 우리는 재현성에 개선 하 고 시간이 지남에 스크래치의 동일한 섹션의 분석을 보장 하면서 자동된 광학 카메라, 과도 한 온도 사이클 제거 스크래치 폐쇄 분석, 육체 노동 방법을 보여 줍니다.

서문

마이그레이션 여러 생리 적 측면을 영향을 미치는 중요 한 과정 이다. 상처 치유, 마이그레이션 용이 피부 다시 epithelization. 치유 되지 않은 상처, 만성 상처 등에서 기회 주의 박테리아 상처의 감염 원인과 오픈 상처 박테리아 성장과 biofilm^1,2의 형성에 이상적입니다. Biofilm 내성 박테리아의 개발의 원인 중 하나는 우리의 현대 사회³에 가장 큰 위협 중 하나입니다. 상처 치유, 면역 세포는 biofilm을 침투 수 없습니다. 암, 암 세포의 전이의 중추적인 단계는 단단한 종양^4,5환자에 대 한 죽음의 주요 원인입니다. 따라서, 그것은 마이그레이션 공부 수 중요 합니다.

스크래치 분석 결과 종종 저렴 하 고 쉽게 부착 셀 라인, 섬유 아 세포, 내 피, 상피 세포 라인^6,7등에서 수행 하는 때문에 셀 마이그레이션 테스트 하는 데 사용 됩니다. 오늘, 흠집⁸, 수행 하기 위한 여러 가지 방법이 존재 하 고 다른 물자 보고 되었습니다 사용 되, 이쑤시개⁹, 셀 기구¹⁰, 레이저¹¹및 전기 전류¹²를 포함 하 여. 모든 방법은 장단점이 서로 다른, 그리고 방법을 따라 셀 유형, 예산 및 분석 도구에 따라 결정 되어야 한다. 예를 들어, 사용한 셀 유형 코팅, 수동 압력 제거 해야 하는 경우 예: 이 쑤 시 게 또는 피 펫 팁, 영역 내에서 마이그레이션 영향, 다른 메서드를 사용 해야 합니다. 이 연구에서 우리는 수동 근 근이 살아가고에 집중할 것 이다.

수동 스크에 대 한 단점은 크기의 변형, 긁힘, 모양 및 스크래치의 가장자리에서 셀의 축적. 많은 프로토콜 존재 하는, 그리고 높게 인용 된 종이 조언 증가 속도 및/또는 긁 적¹³후 철저 한 세척. 또한, 여러 가지 방법은 세포의 확산 마이그레이션 구별 수 없습니다 있기 때문에 따라서 이동의 허위-긍정적인 결과 줄 수 있습니다 확산을 최소화 하기 위해 사용 되었습니다. 일부 메서드는 혈 청 기아 스크래치¹⁴ 이전 및 감소 하는 혈 청¹⁵의 양을 보고. 그러나,이 방법의 어느 쪽도 아니 확산은 보장할 수 있습니다. 따라서, 우리는 마이그레이션의 진정한 결과 미토마이신 C와 셀의 전처리를 보고 합니다. 미토마이신 C¹⁶분리에서 DNA를 방지 DNA와 공유 결합을 형성 하 여 DNA 합성을 억제 하는 항생제 이다. 미토마이신 C와 미리 치료 하 여 긁 기 전에 PBS로 세척 간격의 감지 된 폐쇄 세포 (그림 1)의 진정한 마이그레이션 방법을 보여 줍니다.

모든 방법의 특성은 마이그레이션¹⁷의 프로세스를 분석 하는 시스템에 대 한 필요 이다. 일반적인 진행 상황을 분석 하는 싼 방법 빛 필드 현미경 이미지 소프트웨어^18,19에 간격의 폐쇄의 분석 이어서 미리 정해진된 시간 지점에서 스크래치의 이미지를 사용 하 여 것입니다. 이 방법은 시간이 많이 걸리는, 같은 자리에서 초점, 사진 촬영에 관해서 신뢰할 수 없는 고 사진을 촬영 하는 동안 카메라를 인큐베이터에서 운동 사이클의 온도 변화를 강제로 합니다. 다른 방법은 마이그레이션 전류 흐름을 측정 하 여 검출 하기 위하여 개발 되었습니다. 현재 변경 셀 임피던스²⁰증가 읽기는 접시에 더 많은 공간을 커버. 임피던스를 측정 하 여 세포의 환경 영향을 받지 않습니다, 그리고 방법을 따라서 비-침략 적으로 간주 됩니다. 이 방법은 비싸다, 골드 전극 전문된 접시에 의존 하지만 그들은 세포 부착, 확산, 마이그레이션, 세포 죽음 등 많은 프로세스 검색 사용. 이 방법의 큰 단점은 임피던스에 큰 영향을 미칠 온도 등의 요인으로 임피던스 측정 직접 마이그레이션, 표시 하지 않습니다 것입니다. 임피던스의 변화는 데이터의 분석을 더 어렵게 만드는 소프트웨어에 의해 검토 되지 여러 요인에 의해 발생할 수 있습니다. 따라서, 시각화의 마이그레이션을 확인 하려면 기존의 가벼운 현미경이 필요 합니다.

많은 사용 가능한 기술의 단점을 극복 하기 위해 우리는 실시간 자동된 광학 카메라를 사용 합니다. 광학 카메라는 렌즈, 조명 장치, 그리고 디지털 카메라와 함께 작은 플랫폼에서 높은 처리량 현미경 탐지 시스템입니다. 그것은 내장 소프트웨어를 마이그레이션 및 다른 것 들 사이에서 확산을 테스트할 수 있습니다. 마이그레이션 감지, 두 알고리즘은 성장과 확산 및 각각 분석, 치유 하는 상처 라고 하는 셀의 마이그레이션 활동을 분석 하는 데 사용 됩니다. 확산 분석은 적용 되는 텍스처 분석 셀 적용 영역 (노란색에서 표시) 간의 차이 감지 하는 2 단계 이미지 세분화 알고리즘에 따라 및 빈 고급 히스토그램 분석 영역 배경. 상처 치유 분석 셀 단층을 감지 하 고, 상처 간격을 찾습니다 하 고 간격 너비를 결정 하는 3 단계 알고리즘을 기반으로 합니다. 다음이 단계는 사용자가 지정한 시간-점에서 실시 하 고 데이터 적용된 지역, 간격 폭 및 간격 영역으로 제공 됩니다. 이 컴퓨터의 큰 장점 중 하나 이다 그 액체를 통해 부착 세포 이미징 카메라²¹의 각도 때문에. 하나의 z-비행기의 z 스택 예상 카메라 lenstakes 기울이면 이미지 사진 초점 (그림 2)을 생성 합니다. z-스택 상처 가장자리에 그리고 전체 상처에 걸쳐 수직 촬영 사진 (예: 40)의 시리즈를 병합 하 여 생성 됩니다. Z-스택 셀 계층에 초점 비행기의 깊이의 상처에서 캡처 수 있습니다. 또한, 이미지의 시리즈는 버튼의 클릭으로 이미지의 비디오 컬렉션을 함께 넣어 수 있습니다.

마이그레이션 keratinocyte 셀 라인 HaCaT에서의 검색을 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 우리 테스트 Lactoferrin 및 그것의 N 맨끝 펩 티 드, Lactoferricin, 인간과 소,이 분자 항균 및 면역 조절 분자²² 수많은 응용 프로그램을가지고 입증 되었습니다 마이그레이션에 미치는 영향 분석에서 ^{, 23}. 4 개의 화합물 치료 HaCaT 세포에 비교 했다와 표 피 성장 인자 (EGF) 긍정적인 제어로 사용 되었다.

프로토콜

실험적인 체제 윤리적 및 법적 제한이 있으며 로스킬레 대학 계약 실시 했다. 실험 설정에 대 한 개요는 그림 1 과 그림 2에 광학 카메라의 메커니즘에서 볼 수 있습니다.

1입니다. 준비

1. 벤치 및 실험의 시작 이전에 70% 에탄올과 모든 장비를 청소 하 여 살 균 층 류 벤치에서 모든 단계를 수행 합니다.
2. 셀에 대 한 최적의 조건을 보장 하기 위해 5% CO₂ 와 37 ° C에서 기존의 인큐베이터에 광학 카메라를 배치 합니다.
3. 10 %FBS T75 플라스 크에서 1 x 항생제 (페니실린과 스) DMEM 미디어에서 HaCaT 세포 성장.
4. 1 mL 1 x 트립 신을 사용 하 여 셀을 분리 하 고 하위 그들 매 3-4 일 함으로써 배양 세포 층에 분산. 사용 하기 전에 실내 온도에 열 중.

2. 48-웰 스 결정 플레이트에 셀 생성 HaCaT의 단층

1. 파스퇴르 피 펫과 T75 플라스 크에서 매체를 제거 합니다.
2. T75 플라스 크에 5 mL 1 x 살 균 PBS를 추가 하 여 플라스 크에 부착 세포를 씻어.
   참고: PBS 칼슘과 마그네슘의 무료 인지 확인 합니다.
3. PBS를 순환 하 고 파스퇴르 피 펫과 그것을 제거 합니다.
4. 2.2-2.3 단계를 반복 합니다.
5. 플라스 크를 1 mL 1 x 트립 신을 추가 하 고 셀 계층에 걸쳐 분산.
6. 세포 분리 될 때까지 기존의 인큐베이터에서 37 ° C에서 플라스 크를 품 어 (5-8 분은 대부분 셀 라인에 대 한 충분 한).
7. 보기는 현미경에서 세포를 분리 하는 경우 일단 셀을 분리 하는 추가 10% 일반 문화 미디어의 9 mL 1 x 트립 신을 비활성화 하는 FBS.
8. 어느 hemocytometer와 셀 계산 coulter 카운터 또는 유사한.
   참고: Trypan 블루 볼 죽은 세포를 사용할 수 있습니다. 그러나,에서 1 x trypsin HaCaT 세포는 완벽 하 게 라운드 때 살아.
9. 48-잘 조직 문화 라운드 바닥 플레이트 (표준 접시)에 250 µ L 10 %FBS 미디어에서 10⁴ 셀/잘 x 7.5를 전송 합니다.
   참고: 분석 결과 또한 설정할 수 있습니다 6, 12, 24, 나는 모든 광학 현미경 분석 수 96 잘 접시에.
10. 부드럽게 접시 측면에서 세포는 동등 하 게 우물, 확산 되도록 좌우로 움직이거나 셀 우물의 센터에 모여 것입니다. 셀은 균등 하 게 언론에 확산 되도록 가벼운 현미경 검사
11. 하룻밤 또는 우물의 바닥에 셀은 준수 때까지 37 ° C에서 기존의 CO₂ 인큐베이터에 접시를 넣어.

3입니다. 마이그레이션 효과 대 한 자극의 추가

1. 우물은 90-95%는 가벼운 현미경 합칠 경우 확인 하십시오.
2. 미토마이신 C는 매체의 적절 한 금액에서의 10 µ g/mL를 준비 합니다.
   참고: 이 연구에서는 미토마이신 C는 1 mg/mL에서 재고 솔루션에 4 ° C에서 유지 됩니다. 미토마이신 C 솔루션에서 2-8 ° c.에 어둠 속에서 1 주일에 저장 될 수 있다
3. 각 우물에서 파스퇴르 피 펫을 보낸된 미디어를 제거 합니다.
4. 각 우물에 미토마이신 C의 5 µ g/mL의 250 µ L를 추가 합니다.
5. 2 h 37 ° C, 5% CO₂접시를 품 어.
6. 그들은 매체의 적절 한 금액에서을 diluting 하 여 펩 티 드의 자극을 준비 합니다.
   참고: 이 연구에서는 인간과 소 Lactoferrin와 Lactoferricin 250 µ L의 볼륨에서 25 µ g/mL에서 테스트 되었습니다.
7. 미토마이신 C 파스퇴르 피 펫과 함께 매체를 제거 합니다.
8. 1 x 1 x PBS (실내 온도) 및 제거는 파스퇴르와 세척의 250 µ L 플라스틱 웰 스 워시.
9. 1 x PBS의 250 µ L을 추가 하 고 수동으로 200 µ L 피 펫 팁과 수직 우물 스크래치. 각 잘 새로운 피 펫 팁을 사용 합니다.
10. PBS를 제거 하 고 250 µ L 펩 티 드 자극을 추가.
11. 접시의 양쪽에 나사를 조정 하 여 광학 카메라 시스템에 접시를 탑재 합니다. 결정에 뚜껑을 두고.
    참고: 카메라 뚜껑을 열고 필요한 경우 작동할 수 있습니다.

4. 프로그램을 컴퓨터에 광학 카메라에 대 한 설정

1. 왼쪽에 작업 표시줄에서 취득 을 클릭 합니다.
2. 왼쪽에 작업 표시줄에서 상처 치유 기능을 선택 합니다.
3. 플레이트 타입 플레이트 그림아래를 클릭 하 여 선택 합니다.
4. 그들을 표시 하 여 웰 스, 사용, 선택을 취소 하 고 화면에 왼쪽 상단에 사용 을 클릭 합니다.
   참고: 모든 우물은 기본적으로 선택 됩니다.
5. 우물 우물 중 하나에 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 셀의 위치에 맞게에 렌즈의 초점을 조정 합니다.
   참고: 자동 초점 또한 접시 그림의 오른쪽에 막대를 이동 하 여 수동으로 조정할 수 있습니다.
6. 사진 간격 에서 이미지에 대 한 기간을 설정 (예: (00: 30:00)).
7. 원하는 기간 (예: 97 반복)에 맞게 반복의 수를 설정 합니다.
8. 오른쪽 아래 모서리에 있는 시작 버튼을 클릭 하 여 실행을 시작 합니다.

결과

HaCaT은 keratinocyte 셀 라인, 피부에서 가장 풍부한 셀 형식 중 하나입니다. 상처 발생, 피부 세포 증식 및 상처 침대를 닫습니다 (그림 3) 상처를 통해 마이그레이션 시작 합니다. 두 프로세스는, 그러므로, 적절 한 치료에 매우 중요.

광학 카메라는 실시간으로 두 프로세스를 따를 수 있습니다. 마이그레이션,...

토론

개발, 상처 치유, 면역학, 및 암 연구에 이동의 중요성 여러 다른 방법 마이그레이션 연구를 주도하 고 있다. 마이그레이션 확장의 표현 또는 셀에 의해 간격의 폐쇄 수 있습니다. 그것은 쉽게 하는 단층 세포 성장 이며 성장 하는 특정 폼⁸셀 보다 스크래치 스크래치의 가장 자주 폐쇄 테스트 됩니다. 우리의 연구는 기술 마스터 하기 쉽고 저렴 한 비용으로 수동 긁힘에 대 한 최적?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
oCelloScope	BioSense Solution ApS		Optical camera
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell			Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medium for HaCaT
FBS	Gibco	10270	Fetal bovine serum
PBS	Gibco	D837	Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibiotics
Trypsin (10x)	Sigma	T3924
Mitomycin C	Tocris	3258	Inhibits proliferation
Microtiter plate	Greiner Bio-one	677 180
Incubator	Panasonic		37°C, 5% CO2
Hemocytometer	Assistent		Türk (0.1 mm)
Pipet boy	Accu-Jet pro