Optimisé de gratter Assay for In Vitro test de Migration cellulaire avec une caméra optique automatisée

Résumé

Ici, nous décrivons une procédure pour tester la cellule migration in vitro avec un microscope caméra optique automatisé. Le dosage zéro a été largement utilisé lorsque la fermeture de la rayure est suivie pour une période déterminée. Le microscope optique permet une détection fiable et bon marchée de la migration cellulaire.

Résumé

La migration cellulaire est un processus important qui influe sur les nombreux aspects de la santé, comme la cicatrisation et le cancer, et il est donc crucial pour le développement de méthodes pour étudier la migration. Le dosage zéro a longtemps été la méthode la plus courante en vitro pour tester des composés ayant des propriétés anti - et pro - migration en raison de son faible coût et simple procédure. Toutefois, un problème souvent signalé du dosage est l’accumulation de cellules sur le bord de la rayure. En outre, pour obtenir des données de l’essai, images d’expositions différentes il faut sur une période de temps à l’endroit exact même comparer les mouvements de la migration. Analyse de différents programmes peut être utilisés pour décrire la fermeture scratch, mais ils sont travail intensif, inexactes et les forces des cycles de changements de température. Dans cette étude, nous démontrons une méthode optimisée pour tester l’effet de la migration, par exemple avec les protéines d’origine naturelle homme et de la lactoferrine Bovine et leur peptide N-terminal lactoferricine sur la lignée cellulaire épithéliale HaCaT. Une optimisation cruciale consiste à laver et gratter dans du PBS, qui élimine l’accumulation susmentionnée de cellules le long du bord. Cela pourrait s’expliquer par la suppression des cations, qui auraient dû être divulgués à avoir un effet sur la connexion de cellules kératinocytes. Pour assurer la véritable détection des migrations, le prétraitement avec la mitomycine C, un inhibiteur de synthèse de l’ADN, a été ajouté au protocole. Finalement, nous démontrons l’automatisé caméra optique, ce qui élimine les cycles de température excessive, le travail manuel avec analyse de fermeture scratch, tout en améliorant le reproductibilité et assurant l’analyse des sections identiques du scratch au fil du temps.

Introduction

La migration est un processus important qui influe sur plusieurs aspects physiologiques. Dans la cicatrisation des plaies, migration facilite la re-epithelization de la peau. Dans les plaies non-guérison, telles que les plaies chroniques, bactéries opportunistes causent l’infection de la plaie, et plaies ouvertes sont idéales pour la croissance de bactéries et de la formation du biofilm^1,2. Le biofilm est une des causes du développement de bactéries résistantes, qui est l’une des menaces plus importantes de notre société moderne³. Dans la cicatrisation des plaies, les cellules immunitaires ne puissent pas pénétrer le biofilm. Dans le cancer, la migration des cellules cancéreuses est une étape charnière de métastases, qui est la principale cause de décès chez les patients atteints de tumeurs solides^4,5. Il est donc crucial de pouvoir étudier la migration.

Le dosage zéro est souvent utilisé pour tester la migration cellulaire, parce que c’est bon marché et facile à exécuter sur des lignées de cellules adhérentes, tels que les fibroblastes, endothélial et cellules épithéliales lignes^6,7. Aujourd'hui, plusieurs méthodes existent pour effectuer des rayures⁸et différents matériaux ont été signalés à utiliser, notamment des cure-dents⁹cellule grattoirs¹⁰, lasers¹¹et courants électriques¹². Toutes les méthodes ont des inconvénients et des avantages différents, et la méthode doit être décidée selon l’outil de type, budget et analyse cellulaire. Par exemple, si le type de cellule utilisée nécessite de revêtement, suppression de pression manuelle, par exemple avec une pointe d’un cure-dent ou d’une pipette, aura une influence sur les migrations au sein de la zone, une autre méthode doit être utilisée. Dans cette étude, nous nous concentrerons sur grattage manuel.

Un inconvénient de raclage manuel est la variation de la taille, les formes des rayures et l’accumulation de cellules sur les bords de la rayure. Nombreux protocoles existent, et un papier cité conseille une vitesse accrue et/ou lavage complet après grattage¹³. En outre, plusieurs méthodes ont été utilisées pour minimiser la prolifération, étant donné la prolifération des cellules ne peut pas être distinguée de la migration et par conséquent peut donner des résultats faussement positifs des migrations. Certains signalé des méthodes sont la privation de sérum précédant le scratch¹⁴ et en diminuant la quantité de sérum¹⁵. Toutefois, aucune de ces méthodes peut s’assurer qu’il n’y a aucune prolifération. Par conséquent, nous présentons un prétraitement des cellules avec la mitomycine C pour s’assurer que les résultats réels de la migration. La mitomycine C est un antibiotique qui inhibe la synthèse de l’ADN en formant une liaison covalente avec l’ADN, ce qui empêche l’ADN de séparation¹⁶. Par prétraitement avec la mitomycine C et se laver avec du PBS avant de se gratter, la fermeture détectée de l’écart illustre la véritable migration des cellules (Figure 1).

Une caractéristique de toutes les méthodes est la nécessité d’un système analyser le processus de migration¹⁷. Une méthode peu coûteuse pour analyser l’état d’avancement et une commune consiste à utiliser un microscope à lumière-champ de prendre des images de la rayure à des moments prédéterminés, suivies d’une analyse de la fermeture de l’espace dans une image logiciel^18,19. Cette méthode est longue et peu fiable en ce qui concerne la prise de photos au même endroit et à la mise au point et le mouvement de l’incubateur à caméra forces cycles de changements de température, tandis que les photos ont été prises. Autres méthodes ont été développées pour détecter des migrations en mesurant le débit de courant. Les changements en cours, sous forme de cellules couvrent plus d’espace sur la plaque, qui se lit comme une augmentation de l' impédance²⁰. En mesurant l’impédance, l’environnement des cellules n’est pas affectée, et la méthode est donc considéré comme non invasif. Cette méthode s’appuie sur des plaques spécialisées avec électrodes en or, qui sont chers, mais ils permettent la détection de nombreux processus, tels que l’adhésion cellulaire, la prolifération, la migration et la mort cellulaire. Un gros inconvénient de cette méthode est que la mesure d’impédance n’indique pas directement la migration, comme les facteurs comme la température ont un impact considérable sur l’impédance. Changement de l’impédance peut être causée par plusieurs facteurs qui ne sont pas examinés par le logiciel, complique l’analyse des données. Par conséquent, l’absence de visualisation nécessite un microscope optique classique pour vérifier la migration.

Pour surmonter plusieurs des inconvénients des techniques disponibles, nous utilisons une caméra optique automatisée en temps réel. La caméra optique est un système de détection avec un microscope de haut-débit dans une petite plateforme avec une lentille, dispositif d’éclairage et un appareil photo numérique. Il a un logiciel intégré, qui permet de tester migration et prolifération entre autres choses. Pour détecter les migrations, les deux algorithmes sont utilisés pour analyser la croissance et la cinétique de la migration des cellules qui s’appellent la prolifération et la cicatrisation de l’analyse, respectivement. L’analyse de prolifération est basé sur un algorithme de segmentation d’image en deux étapes qui applique l’analyse de texture pour détecter la différence entre les zones couvertes de cellule (indiqué en jaune) et vide zones de base établi par l’analyse avancée d’histogramme. L’analyse de cicatrisation est basée sur un algorithme Triple qui détecte la monocouche cellulaire, localise l’écart de la plaie et détermine la largeur de la fente. Ces étapes sont effectuées aux moments déterminés par l’utilisateur et les données sont présentées en zone couverte, largeur de la fente et zone d’écart. Un des grands avantages de cette machine est qu’il permet l’imagerie de cellules adhérentes à travers liquide à cause de l’angle de la caméra²¹. Les caméra lenstakes incliné images projetées à une pile d’un seul plan z z génèrent pour s’assurer que les images sont en discussion (Figure 2). z-piles sont générées par la fusion de la série de photos (par exemple 40) prises perpendiculaires au bord de la plaie et à travers la plaie ensemble. Les z-piles permet de capturer de la profondeur de la couche de cellules, mais aussi un plan de mise au point dans l’ensemble de la plaie. En outre, la série d’images peut être Assemblée pour une collection de vidéos des images, avec le clic d’un bouton.

Nous démontrons un protocole optimisé pour la détection de la migration dans la lignée de cellules kératinocytes HaCaT. Nous avons testé la lactoferrine et son peptide N-terminal, lactoferricine, chez l’homme et des vaches, d’analyser leurs effets sur les migrations, comme scientifiques ont révélé que ces molécules ont de nombreuses applications comme antimicrobien et immunitaire modulant molécules^{22 , 23}. les quatre composés ont été comparées aux cellules HaCaT non traitées et de facteur de croissance épidermique (EGF) a été utilisé comme témoin positif.

Protocole

Le montage expérimental n’a aucune restriction éthique et juridique et a été menée en accord avec Université de Roskilde. Un aperçu de la mise en place expérimentale peut être vu dans la Figure 1 et les mécanismes de la caméra optique dans la Figure 2.

1. préparation

1. Exécutez toutes les étapes dans un stérile à flux laminaire-banc en nettoyant le banc et tous les équipements avec l’éthanol à 70 % avant le début de l’expérience.
2. Placez la caméra optique dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ pour s’assurer des conditions optimales pour les cellules à classique.
3. La croissance de cellules HaCaT en milieu DMEM avec 10 % de SVF et 1 x antibiotiques (pénicilline et streptomycine) dans une fiole de T75.
4. Trypsine 1 x 1 mL permet de détacher les cellules et les cultivent tous les 3-4 jours, par disperser au-dessus de la couche cellulaire. Préchauffer à température ambiante avant utilisation.

2. générer une monocouche de HaCaT des cellules dans une plaque de microtitration 48-puits

1. Retirez le support de la fiole T75 avec une pipette Pasteur.
2. Laver les cellules adhérentes dans la fiole en ajoutant 5 mL 1 x PBS stérile à la fiole T75.
   Remarque : Assurez-vous que le PBS est exempt de calcium et de magnésium.
3. Faire circuler les PBS et enlevez-le avec une pipette Pasteur.
4. Répétez l’étape 2.2-2.3.
5. Ajouter trypsine 1 x 1 mL dans le ballon et il disperse à travers la couche de cellules.
6. Incuber le ballon à 37 ° C dans une étuve classique jusqu'à ce que les cellules sont détachent (5-8 min est suffisant pour la plupart des lignées de cellules).
7. Voir sous le microscope si les cellules sont individuelles. Une fois que les cellules sont individuelles, ajouter 9 mL des milieux de culture ordinaire avec 10 % FBS pour inactiver la trypsine 1 x.
8. Compter les cellules avec soit un hémocytomètre, un compteur coulter ou similaire.
   Remarque : Le bleu trypan peut être utilisé pour afficher des cellules mortes. Cependant, en trypsine 1 x HaCaT, les cellules sont parfaitement ronde quand vivant.
9. Transférer 7,5 x 10⁴ cellules/puits dans les médias de SBF 250 µL 10 % sur une plaque de culture de tissus 48 puits à fond rond (plaque standard).
   Note: dosage réglable vers le haut en 6, 12, 24 ou des plaques de 96 puits, qui toutes peuvent être analysés au microscope optique.
10. Déplacez doucement la plaque de côté à l’autre pour s’assurer que les cellules sont également répartis dans les puits ou les cellules seront réuniront au centre du puits. Inspecter sous un microscope optique pour s’assurer que la cellule est répartie dans les médias
11. Mettre la plaque dans un conventionnel CO₂ incubateur à 37 ° C pendant la nuit ou jusqu'à ce que les cellules ont adhéré au fond des puits.

3. Ajout de Stimuli pour les effets de la Migration

1. Vérifier si les puits sont confluents de 90 à 95 % sous un microscope optique.
2. Préparer 10 µg/mL de la mitomycine C dans une quantité appropriée du milieu.
   Remarque : Dans cette étude, la mitomycine C est maintenue à 4 ° C dans une solution-mère à 1 mg/mL. La mitomycine C dans une solution peut être conservée jusqu'à une semaine dans l’obscurité entre 2 et 8 ° C.
3. Retirez le support usé avec une pipette Pasteur de chaque puits.
4. Ajouter 250 µL de 5 µg/mL de la mitomycine C dans chaque puits.
5. Incuber la plaque pendant 2 h à 37 ° C et 5 % de CO₂.
6. Préparer des stimuli de peptides en diluant dans une quantité appropriée de la moyenne.
   Remarque : Dans cette étude, humain et bovin lactoferrine tant lactoferricine ont été testés à 25 µg/mL pour un volume de 250 µL
7. Enlever le support avec la mitomycine C, avec une pipette Pasteur.
8. Laver les puits Pipetter 1 x 250 µL de 1 x PBS (température ambiante) et enlever le lavage avec un Pasteur.
9. Ajouter 250 µL de solution 1 PBS x et gratter manuellement les puits verticalement avec une pointe de pipette 200 µL. Utiliser un nouvel embout de la pipette pour chaque puits.
10. Supprimez les PBS et stimuli de peptide 250 µL.
11. Monter le système de caméra optique en ajustant les vis des deux côtés de la plaque. Laissez le couvercle sur la plaque de microtitration.
    Remarque : La caméra peut fonctionner avec le couvercle ouvert si nécessaire.

4. configurer le programme pour la caméra optique sur l’ordinateur

1. Cliquez sur acquérir dans la barre d’outils sur la gauche.
2. Choisissez la fonction la cicatrisation dans la barre d’outils sur la gauche.
3. Choisissez le type de plaque en cliquant sous l' illustration de la plaque.
4. Désactiver l’option puits, ne l’utilisez, en les marquant et cliquez sur activer en haut à gauche sur l’écran.
   Remarque : Tous les puits sont sélectionnés par défaut.
5. Régler la netteté de la lentille sur les puits pour s’adapter à la position des cellules par un clic droit sur l’un des puits.
   Remarque : Mise au point automatique peut également être ajusté manuellement en déplaçant la barre à droite de l’illustration de la plaque.
6. Définissez le délai prévu pour donner des images dans l’Intervalle (par exemple (00:30:00)).
7. Définir le nombre de répétition pour s’adapter à la période souhaitée (par exemple 97 répétitions).
8. Lancer l’exécution en cliquant sur le bouton Démarrer dans le coin inférieur droit.

Résultats

HaCaT est une lignée de cellules kératinocytes, un des types de cellules plus abondantes dans la peau. En cas d’une plaie, les cellules de la peau commencent à proliférer et à migrer vers le lit de la plaie pour refermer la plaie (Figure 3). Les deux processus sont donc d’une importance capitale pour la bonne cicatrisation.

La caméra optique peut suivre les deux processus en temps réel. P...

Discussion

L’importance de la migration dans les études de développement, la cicatrisation des plaies, immunologie et le cancer a conduit à plusieurs méthodes différentes pour étudier les migrations. Migration peut être une expression de l’expansion ou la fermeture de l’écart par les cellules. Plus souvent la fermeture de la rayure est testée, comme il est plus facile à cultiver des cellules en une monocouche et ensuite faire une égratignure à la croissance des cellules dans une formule spécifique

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
oCelloScope	BioSense Solution ApS		Optical camera
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell			Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medium for HaCaT
FBS	Gibco	10270	Fetal bovine serum
PBS	Gibco	D837	Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibiotics
Trypsin (10x)	Sigma	T3924
Mitomycin C	Tocris	3258	Inhibits proliferation
Microtiter plate	Greiner Bio-one	677 180
Incubator	Panasonic		37°C, 5% CO2
Hemocytometer	Assistent		Türk (0.1 mm)
Pipet boy	Accu-Jet pro