السابقين فيفو تصوير الكالسيوم لتصور استجابات الدماغ للإشارات الغدد الصماء في المورفولوجية

Summary

وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول السابقين فيفو تصوير الكالسيوم الدماغ المورفولوجية . باستخدام هذا الأسلوب، يمكن تطبيق المركبات الطبيعية أو الاصطناعية إلى المخزن المؤقت لاختبار قدرتها على تنشيط معينة من الخلايا العصبية في الدماغ.

Abstract

الجهاز على الجهاز الاتصال بالإشارات الغدد الصماء، على سبيل المثال، من العالم الخارجي إلى الدماغ، ضروري للحفاظ على التوازن. كحيوان نموذج لأبحاث الغدد الصماء، يتزايد استخدام melanogaster المورفولوجية، الذي قد متطورة أدوات الجينية ومعلومات الجينوم،. توضح هذه المقالة طريقة لتصوير الكالسيوم explants الدماغ المورفولوجية . هذا الأسلوب يتيح الكشف عن الإشارات المباشرة هرمون في الدماغ. فمن المعروف جيدا أن العديد من الببتيد الهرمونات تعمل عن طريق مستقبلات إلى جانب البروتين G (جبكرس)، التنشيط الذي يؤدي إلى زيادة تركيز Ca^{2 +}داخل الخلايا. كما يرفع التنشيط العصبية داخل الخلايا Ca^{2 +} مستويات، من Ca^{2 +} تدفق وإصدار Ca^{2 +} مخزنة في هيولى (ER). جهاز استشعار كالسيوم، جكامب، ويمكن رصد هذه Ca^{2 +} التغييرات. في هذا الأسلوب، يتم التعبير عن جكامب في الخلايا العصبية للفائدة، وتشريح الدماغ اليرقات الإعراب عن جكامب ومثقف السابقين فيفو. ثم يتم تطبيق اختبار الببتيد ل explant الدماغ، وتم الكشف عن التغييرات الفلورسنت في جكامب استخدام مجهر [كنفوكل] قرص غزل مزودة بكاميرا CCD. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن أن يكون اختبار أي جزيء للذوبان في الماء، ومختلف الأحداث الخلوية المرتبطة بالتنشيط العصبية يمكن تصويرها باستخدام المؤشرات المناسبة الفلورسنت. وعلاوة على ذلك، عن طريق تعديل قاعة التصوير، يمكن استخدام هذا الأسلوب الصورة المورفولوجية الأجهزة الأخرى أو أجهزة الحيوانات الأخرى.

Introduction

الاتصالات الجهاز للجهاز استراتيجية تقحم مصانة للحفاظ على التوازن التأقلم مع التغيرات البيئية. في البشر، ومجموعة متنوعة من أريريلياسيد الهرمونات من الغدد الصماء إلى الدورة الدموية. العديد من هذه الهرمونات المستهدفة تحت المهاد الدماغ، والذي ينظم عمليات الأيض والسلوكيات الأساسية مثل التغذية^1،2. تم اكتشاف العديد من الهرمونات باستخدام نماذج الثدييات. ومع ذلك، آليات عملها، لا سيما شبكات إينتيرورجان التي تشارك فيها، لا تزال غير واضحة إلى حد كبير.

وبرز melanogaster المورفولوجية نموذجا مفيداً لدراسة الاتصالات الجهاز إلى الجهاز. في الحشرات، يتم التحكم في العديد من العمليات الفسيولوجية بالهرمونات. أوائل الدراسات التي تركز على النمو والتحول تستخدم الحشرات الكبيرة. في هذه الدراسات، لإزالة أو زرع الأعضاء محددة وتوقع وجود جزيئات إشارات الجهاز بين الوكالات؛ في وقت لاحق، كانت الأحداث هرمون (جون) وهرمون بروثوراسيكوتروبيك (بتث) و Ecdysone المتحلل المنقي^3،،من⁴⁵. ويعتقد عائلة كبيرة من الببتيدات إرسال الإشارات بين الخلايا للمشاركة في مختلف الأحداث الفسيولوجية أثناء دورة حياة الحشرات^6،7. معظم هذه الببتيدات قانون إلى جانب البروتين ز مستقبلات (جبكرس)، على الرغم من أن جبكرس محددة كانت صعبة في البداية لتحديد استخدام النهج التقليدية. وكان المنشور المورفولوجية لتسلسل الجينوم كله⁸ الانطلاقة التي مكنت من تحديد هوية الببتيدات النشطة بيولوجيا المورفولوجية استناداً على التماثل لتلك الموجودة في غيرها من الحشرات. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحديد المستقبلات لعدة الببتيدات من جبكرس وتوقع في الجينوم باستخدام فحوصات ملزمة GPCR-يجند خلية-المستندة إلى الثقافة. المقبل، وتعبير تحاليل توقع مسارات الجهاز إلى الجهاز وأثارت هذه الببتيدات والمستقبلات. جدير بالذكر أن العديد من مستقبلات الببتيد المفترضة مبينة في الدماغ، مما يدل على أن الدماغ هدفا رئيسيا ل الهرمونات الببتيد⁹. وعلاوة على ذلك، أسهمت الأدوات الوراثية المتقدمة في المورفولوجية لتحديد الأدوار الفيزيولوجية لتركيبات GPCR الببتيد. على سبيل المثال، GAL4، ونظم النسخي ثنائي المستندة إلى ليزا تمكين الجينات ضربة قاضية أو overexpression بطريقة منضبطة مكانياً وزمنياً. GAL4، عامل نسخ المحددة في الخميرة، ربط تسلسل رابطة الدول المستقلة-تنظيمية محددة تسمى التسلسل التنشيط المنبع (UAS). في النظام GAL4/UAS، يوفر سطر برنامج التشغيل الخاصة بالانسجة أو الخاصة بمرحلة GAL4 التعبير والخط المستجيب يحمل UAS المنبع من الجينات من الفائدة أو البناء على محرك الأقراص شرنا التعبير. ويستند نظام ليزا/ليكساوب إليه مماثلة. تحليلات المظهرية الخاصة بالانسجة الببتيد-ضربة قاضية والأنسجة على حدة ضربة قاضية GPCR الحيوانات يمكن أن تكشف عن معلومات حول وضع إشارات GPCR الببتيد وموقع العمل. ومع ذلك، تقتصر الاستنتاجات التي يمكن الوصول إليها فقط عن طريق البيانات الوراثية. من ناحية أخرى، مرة واحدة هو تضييق نطاق الهدف المفترضة لهرمون الببتيد خاصة لنوع النسيج أو الخلية، يمكن استخدام السابقين فيفو الكالسيوم التصوير في اكسبلانتس الجهاز لتوضيح الاتصالات الجهاز إلى الجهاز بإشارة هضميد-GPCR وساطة. عند التنشيط هذه العملية إلى جانب Gq، هو زيادة Ca^{2 +} تركيز داخل الخلايا نتيجة إطلاق Ca^{2 +} من أية¹⁰. في الدماغ، ويرفع التنشيط العصبية أيضا Ca^{2 +} مستويات داخل الخلايا. ويمكن الكشف عن هذه Ca^{2 +} الزيادات بجهاز استشعار كالسيوم، جكامب، الذي يخضع لتغيرات conformational حضور Ca^{2 +} الناتج في الأسفار الانبعاثات¹¹.

في هذه المقالة، يتم وصف كالسيوم طريقة التصوير باستخدام الدماغ المورفولوجية explants. لاختبار قدرة الببتيد لتنشيط الخلايا العصبية المحددة، يتم تطبيق ببتيد اختبار explant الدماغ معربا عن جكامب، والأسفار التغييرات تتم مراقبتها بواسطة الفحص المجهري [كنفوكل]. وتؤكد مشاركة هذه العملية ثم إجراء المقايسة نفس دماغ المسخ التي تفتقر إلى هذه العملية استخدام. هذا المزيج من التصوير وعلم الوراثة يوفر معلومات دقيقة عن الجهاز لجهاز الاتصالات من الببتيدات-جبكرس-إمكانية إجراء تعديلات وتطبيقات لهذا البروتوكول وتناقش أيضا.

Protocol

1-إعداد Explants الدماغ اليرقات

1. جعل دائرة لتصوير.
   ملاحظة: تسجيل مستقر يتطلب أن تكون مربوطة اكسبلانتس الدماغ. هنا، يستخدم دائرة تصوير منخفضة التكلفة ويدوية الصنع Ca^{2 +} نظام التصوير.
   1. استخدام الملقط، خدش أسفل وسط صحن الثقافة البلاستيكية (35 مم × 10 مم) لإنشاء دنت للعقدة البطني للدماغ اليرقات مما يجعل تركيب أسهل (الخطوة 1-3، الشكل 1).
   2. مع مسواك، ضع قطره صغيرة من superglue على جانبي دنت وإرفاق قضيب تنغستن (0.125 مم، وطول 6 إلى 7 ملم) الغراء.
   3. باستخدام قطعة صغيرة من المعجون مثل لاصقة قابلة لإعادة الاستخدام، جعل جدار دائري (10 ملم وقطرها 3 مم ارتفاع) المحيطة دنت (الشكل 1).
      ملاحظة: المساحة داخل الجدار ستكون في وقت لاحق مليئة الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني؛ 0.14 "م كلوريد الصوديوم"، 0.0027 م بوكل، 0.01 M PO₄^3-, درجة الحموضة 7.4 ± 0.05 عند 25 درجة مئوية).
2. إعداد الحيوانات
   ملاحظة: لتصوير الكالسيوم، أعرب مؤشر كالسيوم، GCaMP6s، في الخلية نوع من الفائدة، الذي يتحقق عادة باستخدام تركيبات من GAL4 و UAS GCaMP6sالخاصة بالانسجة. للتأكد من أن الإشارة هي وساطة عن طريق مستقبلات المرشح، هو أعرب أيضا عن GCaMP6s في متحولة معيبة في المستقبلات.
   1. عندما يتطلب الأمر المقارنات التجريبية للأنماط الجينية المختلفة مثل نوع البرية وطفرات، اليرقات اختبار مباراة العمر لتجنب التعبير GCaMP6 مستوى التباينات والاختلافات الفسيولوجية نتيجة لمراحل النمو.
   2. يبقى الذباب الأبوية (الذباب 30 لكل جنس من الجنسين) في قنينة ثقافة التي تحتوي على الأغذية يطير القياسية من أجل ح 8 للسماح بوضع البيض على سطح الطعام. الثقافة اليرقات في كتلة تحت دائرة الضوء الظلام 12-ح في 25 درجة مئوية و 60-70% رطوبة نسبية.
3. تشريح الدماغ اليرقات
   1. 90-120 ح بعد بيضة زرع (AEL)، جمع اليرقات وغسلها على الأقل 3 مرات بالماء المقطر لإزالة بقايا الطعام ملتصقة.
   2. مكان يرقة على زجاج يشاهد 1.5 بوصة مربعة مليئة بالجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: تنفذ الخطوات التالية اثنين في هذا الزجاج يشاهد تحت مجهر تشريح.
   3. استخدام الملقط بلطف الاستيلاء على الجزء الأوسط من اليرقة. استخدام الملقط آخر لانتزاع هوكس الفم وسحب خطاطيف الفم بلطف لفصل الجزء الأمامي من اليرقة التي تحتوي على الدماغ من بقية الجسم.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، المقص الجراحي يمكن استخدامها.
   4. اضغط الحافة الأمامية بالملقط وتتحول اليرقة الداخل إلى الخارج. إزالة أنسجة دخيلة يعلق على الدماغ، مثل أقراص إيماجينال والهيئات الدهون والغدة الدائري. بلطف منفصلاً في الدماغ فمها.
   5. تطبيق 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني إلى داخل الحلبة من مثل المعجون لاصقة قابلة لإعادة الاستخدام في قاعة التصوير. تمتص بلطف تشريح الدماغ مع برنامج تلفزيوني في ماصة باستور، وثم نقلها إلى غرفة التصوير.
4. وضع الدماغ في غرفة التصوير
   1. استخدام الملقط للاستيلاء على ألياف العضلات التي تمتد من ganglia البطني. إدراج الدماغ بلطف إلى دنت تحت سلك التنغستن.
   2. استخدام الملقط آخر، مكان سحب سلك التنغستن طفيفة تصل إلى الدماغ في الموضع الصحيح للتصوير (الشكل 1).

2-الحصول على صور Ca^{2 +} الأسفار

ملاحظة: explants الدماغ منغمسين في برنامج تلفزيوني يتم تصويرها باستخدام مجهر الأسفار مجهزة من 20 X عدسة الهدف غمر المياه (N.A. = 0.5). برنامج تلفزيوني لم بتنشيط الخلايا في الدماغ. إذا كانت هناك حاجة إلى محور ع الصور، هي التي شنت عدسة الهدف مع محرك كهرضغطية المنشط عدسة. رأس [كنفوكل] قرص غزل يستخدم لتعزيز القرار الوقت. للتصوير بالإضاءة المنخفضة، شنت إلكترون ضرب جهاز الكاميرا على المجهر. تصوير GCaMP6s الفلورية (الإثارة/الانبعاثات: 488/509 نانومتر) يتطلب ليزر 488 نانومتر للإثارة مع مقسم شعاع مزدوج اللون وعامل تصفية انبعاثات (مثلاً.، 528 ± 38 نانومتر باند ممر الموجه مرشح).

1. المكان قاعة التصوير التي تحتوي على explant الدماغ تحت المجهر.
2. أقل عدسة الهدف حتى أنه يمس برنامج تلفزيوني. تحت إضاءة ساطعة الميدانية، ضع الدماغ ووضعها موضع التركيز. قم بالتبديل إلى ضوء الفلورسنت وضبط التركيز على الخلايا المسماة GCaMP6s.
   ملاحظة: يجب أن تكون مرئية الفلورية الخضراء القاعدية GCaMP6s.
3. بدء الحصول على 250 ms/الإطار بدقة 512 × 512 بكسل في وضع المياه المبردة باستخدام البرمجيات المناسبة اقتناء (مثلاً., µManager). ضبط وقت التعرض الحصول على قيم الأسفار داخل النطاق الديناميكي للكاميرا CCD، ولكن ليس أقل من 1000 (وحدات التعسفي)، مع الصور 16-بت (النطاق الديناميكي 0-65,535).
   ملاحظة: يجب استخدام وقت تعرض منخفضة للتقليل من تبييض الصورة من GCaMP6s. ينبغي أن يكون الأمثل وقت التعرض في كل التجربة كما أنه يعتمد على مستويات التعبير GCaMP6 وحساسية نظام الكشف. كان 100 مللي ثانية في لنا التجربة باستخدام dilp2 > GCaMP6s- عندما يتطلب الأمر لعمق تصوير معطى z-المقاطع، يمكن الحصول على عدة z-قسم الصور اعتماداً على الفواصل الزمنية والإطار التعرض. إذا كانت الكاميرا قد يكفي القرار المكانية، ينبغي زيادة حجم بينينج (عدد السجلات على الرقاقة التي سيتم إهمال في واحد بكسل الرقمية) لتقليل زمن التعرض.
4. حالما يتم تحديد معلمات التصوير، تلتقط صوراً لمدة 1 دقيقة قبل الإدارة الببتيد للكشف عن كثافة إشارة خط الأساس (و₀).
5. تطبيق الببتيد الاختبار؛ لهذا، حل 100 ميليلتر من الببتيد الحل في برنامج تلفزيوني و "الماصة؛" فإنه مباشرة في حمام اليرقات تؤتي بتركيز أمثل.
   ملاحظة: ينبغي حقن محلول الببتيد ببطء (مثلاً، تدفق معدل 20 ميليلتر/s) في حمام الحل باستخدام ماصة. الببتيد الاصطناعية لا علاقة لها حل في برنامج تلفزيوني كعنصر سلبي.
6. سجل انبعاث GCaMP6s لبضع دقائق.

3-بيانات التحليل

ملاحظة: يتم تحليل بيانات التصوير بدون اتصال مع إيماجيج. خلال الوقت الفاصل بين التصوير، يسبب بيبيتينج الدماغ اليرقات للتحرك. ولذلك، ينبغي تصحيح الانحرافات الموضعية للصور المسلسل قبل التحليل. يمكن إجراء التصحيح باستخدام المكونات الإضافية، إيماجيج توربوريج كما يلي.

1. فتح برنامج تحليل واستخدام الإطار الأول (قبل تطبيق الببتيد) كصورة مرجعية.
2. حدد الإضافات | التسجيل | توربوريج.
3. اختر ملف الصورة المسلسل مصدر ومرجع الصورة هدف.
4. تحقق هيئة جامدة (التشريد موازية وتناوب الصور) و دقيقة ("سريع" وخشن لكن تحليل سريع بدلاً من ذلك) على أسلوب المعالجة ونوعيتها، على التوالي.
5. انقر فوق دفعة البدء في معالجة الصور.
6. حدد مناطق متعددة للفائدة (رويس) باستخدام تحليل | أدوات | مدير دوروا في إيماجيج.
7. قياس كثافة بكسل بواسطة النقر فوق أكثر | مقياس متعدد | موافق في إطار إدارة العائد على الاستثمار.
8. حساب ΔF/و₀ = (F-و₀)/F₀، و هو شدة دوروا في وقت التحفيز، حيث و₀ هو الكثافة في إطار زمني فورا قبل حدث تجريبي معين (مثلاً 30 الإطارات السابقة بداية التحفيز).
9. كرر التجربة باستخدام عينات متعددة في الدماغ، وإجراء المعالجة الإحصائية للحصول على متوسط والخطأ المعياري للوسط (SEM) عند كل نقطة في الوقت.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول، تم بحث تفعيل المنتجة للأنسولين من خلايا المخ (IPCs) من هرمون الببتيد، CCHa2،. تم تسمية IPCs الدماغ البرية من نوع مع GCaMP6s باستخدام مزيج من dilp2-GAL4¹² (هدية من الدكتور روليفسون) و UAS GCaMP6s¹³ (هدية من الدكتور كيم). Explants الدماغ الي?...

Discussion

Ca^{2 +} التصوير الأسلوب الموصوفة هنا نظام مفيد لاختبار وظيفة الهرمونات في الدماغ. ويتلقى المجراة، الدماغ الهرمونات من مختلف أجهزة الغدد الصماء. وبالإضافة إلى ذلك، يدرك الدماغ باستمرار تصاعدي المعلومات الحسية، مما يسبب تنشيط الخلايا العصبية التلقائية. هذا النظام السابقين فيفو

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tungsten rod	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, Paris, France	3049100	putty-like reusable adhesives
Watch glass, square, 1 5/8 in	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	T900	Phosphated buffered salts
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japan		Custum-synthesized peptide
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	fluorescence microscope
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	420957-9900-000	water-immersion objective lens
P-725 PIFOC objective scanner with long travel range	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	N/A	piezoelectric-activated lens mover
Confocal Scanner Unit CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan	CSU-W1	spinning disc confocal head
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD camera
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	dichroic beam splitter
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	emission filter
µManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org
ImageJ	U. S. National Institutes of Health	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg	Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne	N/A	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/