לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור ex-vivo סידן הדמיה של המוח דרוזופילה . בשיטה זו, תרכובות טבעי או סינתטי ניתן להחיל את המאגר כדי לבחון את היכולת שלהם להפעיל את המסוים הנוירונים במוח.

Abstract

עוגב-כדי-איבר תקשורת על-ידי איתות האנדוקרינית, לדוגמה, מהפריפריה למוח חיונית על שמירה על הומאוסטזיס. כחיה דגם למחקר האנדוקרינית, דרוזופילה melanogaster, אשר מורכבת גנטי כלים ומידע הגנום, משמשת יותר ויותר. מאמר זה מתאר שיטת ההדמיה סידן של explants המוח דרוזופילה . שיטה זו מאפשרת זיהוי ישיר באיתות של הורמון במוח. זה ידוע כי רבים פפטיד ההורמונים לפעול דרך G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), הפעלת אשר גורמת לעלייה בריכוז^{2 +}Ca תאיים. הפעלה עצבית גם מגביה תאיים Ca^{2 +} רמות, Ca^{2 +} זרם והן על שחרורו של Ca^{2 +} המאוחסן תוך-פלזמית (ER). חיישן סידן, GCaMP, באפשרותך לפקח על Ca^{2 +} שינויים אלה. בשיטה זו, GCaMP מתבטאת הנוירונים עניין, וה -המוח זחל GCaMP-לבטא ביתר תרבותי ex-vivo. מבחן פפטיד מחילה על explant המוח, שינויים פלורסנט GCaMP מזוהים באמצעות ספינינג דיסק מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד with a מצלמה CCD. באמצעות שיטה זו, ניתן לבחון את כל מולקולה מסיסים במים, הסלולר אירועים שונים הקשורים עם הפעלה עצבית יכולה לדימות באמצעות האינדיקטורים פלורסנט המתאים. יתר על כן, על-ידי שינוי התא הדמיה, ניתן בשיטה זו לשיקוף איברים דרוזופילה אחרים או האברים של בעלי חיים אחרים.

Introduction

עוגב-כדי-איבר תקשורת היא אסטרטגיית אבולוציונית שנשמרת על שמירה על הומאוסטזיס להתמודד עם שינויים סביבתיים. בבני אדם, מגוון רחב של הורמונים arereleased של בלוטות אנדוקריניות למחזור. רבים של הורמונים אלה יעד ההיפותלמוס במוח, אשר מווסת תהליכים מטבוליים והתנהגויות יסוד כגון האכלה^1,2. הורמונים רבים כבר גילו באמצעות מודלים בתרבית. עם זאת, מנגנוני הפעולה שלהם, במיוחד הרשתות interorgan בהם הם משתתפים, נותרו בלתי ברורים במידה רבה.

דרוזופילה melanogaster התפתחה מודל שימושי עבור לימוד אורגן-כדי-איבר תקשורת. בחרקים, תהליכים פיזיולוגיים רבים נשלטים על ידי הורמונים. לימודי התמקדות צמיחה ושינוי צורה להשתמש חרקים גדולים. במחקרים אלה, הסרה או השתלת איברים ספציפיים ניבא את קיומו של מולקולות איתות בין איברים; מאוחר יותר, הורמון נעורים (JH), הורמון Prothoracicotropic (PTTH) Ecdysone היו מבחינה ביוכימית מטוהרים^3,4,5. משפחה גדולה של פפטידים איתות המערכת נחשב להיות מעורבים באירועים פיזיולוגיים שונים במהלך מחזור חיי חרק^6,7. רוב פפטידים אלה פועלים על G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), למרות GPCRs ספציפי היו בתחילה קשה לזהות באמצעות גישות קונבנציונליות. הפרסום של רצף הגנום כולו דרוזופילה ⁸ היה פריצת הדרך שאיפשר את הזיהוי של פפטידים ביו דרוזופילה בהתבסס על שלהם הומולוגיה לאלה שנמצאו ושאר חרקים. בנוסף, קולטני עבור מספר פפטידים אותרו מ GPCRs חזה הגנום באמצעות מבחני הכריכה GPCR-ליגנד המבוססות על התא-תרבות. בשלב הבא, ביטוי ניתוח חזה המסלולים איברים-כדי-איבר שהפיק אלה פפטידים, קולטנים. ראוי לציין, רבים של קולטני פפטיד בשם באים לידי ביטוי במוח, רומז המוח הוא יעד מרכזי של פפטיד ההורמונים⁹. יתר על כן, כלים גנטיים מתקדמים בדרוזופילה תרמו זיהוי תפקידים פיזיולוגיים של שילובים פפטיד-GPCR. למשל, GAL4 ואת לקסה בינארי תעתיק מערכות מבוססות להפעיל גנים או ביטוי בצורה מבוקרת במרחב של חנותם. GAL4, גורם שעתוק שזוהתה שמרים, נקשר לרצף cis-רגולציה ספציפי שנקרא רצף ההפעלה נגד הזרם (UAS). במערכת GAL4/UAS, הקו מנהל התקן מספק רקמות ספציפיות או ביטוי GAL4 שלב ספציפי לבין הקו המשיב נושא UAS במעלה הזרם של הגן מעניינים או הבונה לביטוי shRNA נסיעה. לקסה/LexAop מערכת מבוססת על מנגנון דומה. ניתוחים פנוטיפי של פפטיד-נוקאאוט רקמות ספציפיות ובעלי GPCR-נוקאאוט רקמות ספציפיות יכול לחשוף מידע אודות מצב של פפטיד-GPCR באיתות האתר של פעילות. אולם, המסקנות כי ניתן להגיע אך ורק על ידי מידע גנטי מוגבלים. מצד שני, ברגע בשם היעד של הורמון מסוים הוא צימצמת לסוג הרקמה או תא, שמחוץ סידן דימות in איברים explants ניתן להבהיר את התקשורת איברים-כדי-איבר מתווכת על-ידי איתות פפטיד-GPCR. בעת ההפעלה של GPCR מצמידים Gq, הריכוז^{2 +} Ca תאיים גדל בשל שחרורו של Ca^{2 +} מ ה ER¹⁰. במוח, הפעלה עצבית גם מעלה רמות^{2 +} Ca תאיים. Ca^{2 +} עליות כאלה ניתן להבחין באמצעות חיישן סידן, GCaMP, אשר עובר שינויים הסתגלותי בנוכחות Ca^{2 +} וכתוצאה מכך פליטת קרינה פלואורסצנטית¹¹.

במאמר זה מתואר של סידן שיטת הדמיה באמצעות המוח דרוזופילה explants. כדי לבדוק את היכולת של פפטיד להפעלת נוירונים ספציפיים, פפטיד המבחן חל את explant המוח לבטא GCaMP, שינויים פלורסצנטיות המפוקחים על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. המעורבות של GPCR אז אושר על ידי ביצוע וזמינותו אותו באמצעות מוח מוטציה חסר את GPCR. שילוב זה של הדמיה וגנטיקה מספק מידע מדויק על איבר-כדי-איבר תקשורת על-ידי פפטידים-GPCRs. האפשר שינויים ויישומים של פרוטוקול זה נדונות גם.

Protocol

1. הכנת המוח זחל Explants

1. להפוך חדר הדמיה.
   הערה: הקלטה יציבה מחייבת explants המוח להיות קשורה. . הנה, תא הדמיה נמוכים, בעבודת יד משמש את Ca^{2 +} מערכת הדמיה.
   1. באמצעות מלקחיים, לגרד במרכז תחתית לצלחת פלסטיק תרבות (35 מ"מ x 10 מ"מ) כדי ליצור גומה עבור גנגליון הגחוני של המוח זחל שהופך הרכבה קלה יותר (שלב 1.3, איור 1).
   2. עם קיסם, במקום טיפה קטנה של דבק מגע על צדי השקע וחבר מוט טונגסטן (0.125 מ"מ קוטר, 6-7 מ מ אורך) הדבק.
   3. באמצעות פיסה קטנה של דבק לשימוש חוזר, כמו מרק, יצירת קיר עגול (10 מ מ בקוטר של 3 מ מ) סביב השקע שנוצר (איור 1).
      הערה: החלל בתוך הקיר אחר כך יתמלא buffered פוספט תמיסת מלח (PBS; 0.14 M NaCl, 0.0027 M אשלגן כלורי, פו₄0.01 M^{3 -}, pH 7.4 ± 0.05 25 ° c).
2. הכנת בעלי חיים
   הערה: עבור הדמיה סידן, מחוון סידן, GCaMP6s, מתבטאת בסוג התא של עניין, אשר בדרך כלל מושגת באמצעות שילובים של רקמות ספציפיות GAL4 ו UAS-GCaMP6s. כדי להבטיח כי האות מתווך באמצעות הקולטן המועמד, GCaMP6s מתבטאת גם מוטציה פגומה של הקולטן.
   1. כאשר השוואות ניסיוני עבור אחרים שונים כגון סוג הפרוע מוטציות נדרשים, הזחלים מבחן התאמה גיל כדי להימנע GCaMP6 ביטוי ברמה וריאציות, הבדלים פיזיולוגיים עקב שלבים התפתחותיים.
   2. שמור הורים זבובים (30 זבובים לסקס כל) מבחנה אחת תרבות המכיל מזון לטוס סטנדרטי עבור 8 שעות לאפשר הטלת ביצים על פני השטח של המזון. הזחלים תרבות המונית תחת מחזור בהירה-כהה 12-h ב- 25 ° C ו- 60-70% לחות יחסית.
3. דיסקציה של המוח זחל
   1. 90-120 h לאחר ביצה הנחת (AEL), לאסוף את הזחלים, לשטוף אותם לפחות 3 פעמים עם מים מזוקקים להסרת פסולת מזון חסיד.
   2. המקום זחל על זכוכית השעון סקוור 1.5 אינץ מלא PBS קר קרח.
      הערה: השלבים שני הבא מתבצעות בכוס הזו לצפות במיקרוסקופ ויבתר.
   3. להשתמש מלקחיים לאחוז בעדינות את החלק האמצעי של הזחל. להשתמש מלקחיים אחר כדי לתפוס את הווים הפה ומשוך את הווים הפה בעדינות כדי להפריד בין החלק הקדמי של הזחל המכיל את המוח משאר חלקי הגוף.
      הערה: לחלופין, מספריים כירורגיים יכול לשמש.
   4. להחזיק את הקצה הקדמי על ידי מלקחיים ופנו הזחל מבפנים החוצה. הסרת רקמת חיצוני המחובר אל המוח, כגון דיסקים דמותי, שומן הגוף ובלוטת טבעת. בעדינות להפריד בין המוח לבין mouthparts.
   5. µL 200 ל- PBS חלות על החלק הפנימי של הטבעת עשוי דבק לשימוש חוזר דבק שפכטל דמוי בבית הבליעה הדמיה. למצוץ בעדינות את המוח ביתור עם PBS לתוך פיפטה פסטר, ולאחר מכן להעביר אותו לחדר ההדמיה.
4. הגדרת המוח לחדר ההדמיה
   1. להשתמש מלקחיים לתפוס סיבי השריר המשתרעת הגרעינים הגחון. הכנס המוח בעדינות לתוך השקע שנוצר מתחת לגדר טונגסטן.
   2. באמצעות מלקחיים אחר, משוך החוט טונגסטן מעט עד מקום המוח במיקום הנכון הדמיה (איור 1).

2. רכישת Ca^{2 +} זריחה תמונות

הערה: המוח explants שקוע PBS הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד 20 X עדשה המטרה טבילה במי (נ. א = 0.5). PBS אינו מפעיל תאים במוח. אם ציר z תמונות נדרשים, העדשה המטרה נטענה עם mover עדשה פיזואלקטריים מופעל. ראש ספינינג דיסק קונאפוקלית משמש כדי לשפר את הרזולוציה זמן. עבור תאורה הדמיה, אלקטרון הכפלת תשלום מצמידים מכשיר המצלמה נטענה על המיקרוסקופ. ההדמיה של זריחה GCaMP6s (עירור/פליטה: 488/509 ננומטר) דורש 488 ננומטר לייזר עבור עירור עם מפצל קרן ודיקרואיק זוהר, מסנן פליטה (למשל., 528 ± 38 nm הלהקה bandpass מסנן).

1. המקום תא הדמיה המכיל את explant המוח מתחת למיקרוסקופ.
2. . תוריד את העדשה המטרה עד שייגע מגניב. תחת תאורה בהירים-שדה, מקם את המוח ולהביא אותה לידי המוקד. לעבור אור ניאון והתאימו את המוקד על תאים התווית על-ידי GCaMP6s.
   הערה: קרינה פלואורסצנטית ירוק הבזליים של GCaMP6s צריכים להיות גלויים.
3. התחלה רכישה ב 250 ms/מסגרת ברזולוציה של 512 × 512 פיקסלים במצב water-cooled באמצעות התוכנה רכישת המתאים (למשל., µManager). להתאים את זמן החשיפה להשיג ערכי פלורסצנטיות בתוך הטווח הדינמי של מצלמה CCD, אבל לא נמוכה יותר 1000 (יחידות שרירותיות), עם תמונות 16 סיביות (טווח דינמי 0-65,535).
   הערה: זמן חשיפה נמוכה אמור לשמש כדי למזער את הלבנת לצילום של GCaMP6s. זמן החשיפה צריך להיות מוטבת ניסוי זה תלוי רמות הביטוי של GCaMP6 ואת הרגישות של מערכת זיהוי. . זה היה 100 ms שלנו באמצעות ניסוי dilp2 > GCaMP6s. כאשר z-סעיפים הנדרשים עבור עומק הדמיה נתון, ניתן לרכוש מספר תמונות z-סעיף בהתאם מרווחי הזמן ומסגרת של חשיפה. אם המצלמה יש מספיק רזולוציה מרחבית, גודל binning (מספר הקופות על השבב זה להיות מנופה לתוך פיקסל דיגיטלית אחד) צריך להיות מוגברת כדי לצמצם את זמן החשיפה.
4. ברגע דימות פרמטרים נקבעים, לקחת את תמונות עבור 1 דקות לפני פפטיד המינהל כדי לזהות עוצמות האות הבסיסית (F₀).
5. להחיל את מבחן פפטיד; בשביל זה, להמיס 100 µL של פתרון פפטיד PBS, pipette זה ישירות לתוך האמבט זחל להניב תשואה של ריכוז אופטימלי.
   הערה: הפתרון פפטיד צריך להיות מוזרק לאט (למשל, תזרים שיעור 20 µL/s) בתוך תמיסת אמבט באמצעות פיפטה של. לא קשורים פפטיד סינתטי מומס PBS משמש פקד שלילי.
6. להקליט את פליטת GCaMP6s לכמה דקות.

3. ניתוח נתונים

הערה: הדמיה הנתונים מנותחים במצב לא מקוון עם ImageJ. במהלך ההדמיה זמן לשגות, pipetting גורמת למוח זחל להזיז. לכן, יש לתקן סטיות לפי מיקום של תמונות טורי לפני ניתוח. התיקון יכול להתבצע באמצעות ImageJ של התוספת, TurboReg כפי שמוצג להלן.

1. פתח את תוכנת ניתוח ועושים שימוש המסגרת הראשונה (לפני יישום פפטיד) תמונת ייחוס.
2. בחר תוספים | רישום | TurboReg.
3. לבחור את קובץ התמונה טורי מקור התמונה התייחסות היעד.
4. בדוק אם גוף קשיח (מקביל הזחה וסיבוב של תמונות), מדויקות ("מהיר" הוא גס אבל ניתוח מהיר במקום) שיטת העיבוד ואת איכות, בהתאמה.
5. לחץ על אצווה כדי להפעיל את העיבוד תמונה.
6. בחר אזורים מרובים עניין (ROIs) באמצעות נתח | כלים | רועי מנהל ב ImageJ.
7. למדוד את עוצמת פיקסל על ידי לחיצה על יותר | ריבוי אמצעי | טוב בחלון מנהל רועי.
8. חישוב ΔF/F₀ = (F - F₀) /F₀, כאשר F הוא עוצמת ROI בזמן הגירוי ו- F₀ היא עוצמת-חלון זמן מיד לפני אירוע מסוים ניסיוני (למשל, 30 מסגרות מקדים תחילת גירוי).
9. חזור על הניסוי באמצעות דגימות מוח מרובים, בניהול עיבוד סטטיסטי של הנתונים כדי לקבל ממוצע של שגיאת התקן של הממוצע (SEM) בכל נקודה בזמן.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול זה, נבחן את ההפעלה של מייצרי אינסולין תאי המוח (IPCs) על ידי הורמון פפטידי, CCHa2. IPCs של המוח פראי-סוג הודבקו תוויות עם GCaMP6s באמצעות שילוב של dilp2 -GAL4¹² (מתנה רוליפסון ד ר), UAS-GCaMP6s¹³ (מתנה ד ר קים). Explants המוח זחל שטופלו פפטיד CCHa2 סינתט...

Discussion

Ca^{2 +} הדמיה בשיטה המתוארת כאן היא מערכת שימושית לבדיקה את הפונקציה של הורמונים במוח. אין ויוו, המוח מקבל הורמונים של האורגנים האנדוקרינית. בנוסף, המוח רואה כל הזמן עולה המידע החושי, הגורמת הפעלה עצביים ספונטנית. מערכת זו שמחוץ מבטל רעש נורא ותשואות יחס אות/רעש טוב יותר מאשר ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tungsten rod	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, Paris, France	3049100	putty-like reusable adhesives
Watch glass, square, 1 5/8 in	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	T900	Phosphated buffered salts
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japan		Custum-synthesized peptide
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	fluorescence microscope
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	420957-9900-000	water-immersion objective lens
P-725 PIFOC objective scanner with long travel range	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	N/A	piezoelectric-activated lens mover
Confocal Scanner Unit CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan	CSU-W1	spinning disc confocal head
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD camera
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	dichroic beam splitter
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	emission filter
µManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org
ImageJ	U. S. National Institutes of Health	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg	Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne	N/A	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/