Ex Vivo Imagerie calcique pour visualiser le cerveau réponses à signalisation endocrinienne chez la drosophile

Résumé

Cet article décrit un protocole pour ex vivo imagerie calcique du cerveau drosophile . Dans cette méthode, des composés naturels ou synthétiques peuvent être appliqués à la mémoire tampon pour tester leur capacité à activer les neurones particulières dans le cerveau.

Résumé

Orgue-de communication par la signalisation endocrinienne, par exemple, de la périphérie vers le cerveau, est essentielle au maintien de l’homéostasie. Comme un animal modèle pour la recherche endocrinienne, Drosophila melanogaster, qui a sophistiqué outils génétiques et l’information de génome, est plus en plus utilisé. Cet article décrit une méthode pour l’imagerie calcique des explants de cerveau de drosophile . Cette méthode permet la détection de la signalisation directe d’une hormone dans le cerveau. Il est bien connu que beaucoup d’hormones peptidiques agissent par l’intermédiaire de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), dont l’activation entraîne une augmentation de la concentration intracellulaire du Ca^{2 +}. Activation neurale élève aussi^{Ca 2 +} intracellulaire, de l’influx de Ca^{2 +} et de la libération de Ca^{2 +} stocké dans le réticulum endoplasmique (re). Un capteur de calcium, GCaMP, permet de surveiller ces changements de Ca^{2 +} . Dans cette méthode, GCaMP est exprimé dans les neurones d’intérêt, et le cerveau larvaire exprimant le GCaMP est disséqué et cultivé ex vivo. Le peptide de test est ensuite appliqué à l’explant de cerveau, et les changements fluorescents dans GCaMP sont détectés à l’aide d’un microscope confocal de rotation disque équipé d’une caméra CCD. En utilisant cette méthode, n’importe quelle molécule soluble dans l’eau peut être testée, et divers événements cellulaires associés à l’activation neuronale peuvent être photographiées en utilisant les indicateurs fluorescents appropriés. En outre, en modifiant la chambre d’imagerie, cette méthode peut servir à l’image des autres organes de la drosophile ou les organes d’autres animaux.

Introduction

Orgue-de communication est une stratégie évolutivement conservée pour le maintien de l’homéostasie pour faire face aux changements environnementaux. Chez l’homme, une variété d’arereleased hormones des glandes endocrines dans la circulation. Beaucoup de ces hormones ciblent l’hypothalamus du cerveau, qui régit les processus métaboliques et des comportements fondamentaux tels que l’alimentation^1,2. Beaucoup d’hormones ont été découverts à l’aide de modèles mammifères. Cependant, les mécanismes de leur action, en particulier les réseaux proposé auxquelles ils participent, demeurent en grande partie incertains.

Drosophila melanogaster est devenue un modèle utile pour étudier l’orgue au grand orgue communication. Chez les insectes, de nombreux processus physiologiques sont contrôlés par les hormones. Les premières études axées sur la croissance et métamorphose utilisé de gros insectes. Dans ces études, l’enlèvement ou la transplantation d’organes spécifiques avait prédit l’existence de molécules de signalisation inter orgues ; plus tard, l’hormone juvénile (JH), prothoracicotropique hormone (PTTH) et Ecdysone sont biochimiquement purifiée^3,4,5. Une grande famille de peptides de signalisation intercellulaires est censée participer à diverses manifestations physiologiques durant le cycle de vie insectes^6,7. La plupart de ces peptides agit sur les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), bien que les RCPG spécifiques ont été initialement difficile à identifier à l’aide de méthodes conventionnelles. La publication de la drosophile de séquence du génome entier⁸ a été la percée qui a permis l’identification de peptides bioactifs de Drosophila basé sur leur homologie à celles retrouvées chez d’autres insectes. En outre, les récepteurs de plusieurs peptides ont été identifiés des RCPG prévues dans le génome à l’aide de la culture-RCPG-ligand binding analyses cellulaires. Ensuite, analyses d’expression prédit les voies à-orgue induites par ces peptides et récepteurs. En particulier, beaucoup des récepteurs putatifs de peptide sont exprimés dans le cerveau, ce qui suggère que le cerveau est une cible majeure du peptide hormones⁹. En outre, les outils avancés de génétiques chez la drosophile ont contribué à l’identification des rôles physiologiques de combinaisons de peptide-RCPG. Par exemple, les systèmes transcriptionnelles binaires LexA et GAL4 permettent de gène ou la surexpression d’une manière contrôlée dans le temps et l’espace. GAL4, un facteur de transcription identifié chez la levure, se lie à une séquence de cis-réglementation spécifique appelée séquence d’Activation en amont (SAMU). Dans le système de GAL4/UAS, la ligne pilote fournit des tissus-spécifiques ou expression de GAL4 stade spécifique et la ligne de répondeur porte SAMU en amont du gène d’intérêt ou de la construction à l’expression de shARN en voiture. LexA/LexAop système repose sur un mécanisme similaire. Analyse phénotypique des animaux de tissu-spécifique tissu-spécifique et de peptide-choc de GPCR-knockdown peut révéler des informations sur le mode de signalisation le peptide-RCPG et site d’action. Toutefois, les conclusions qui sont accessibles uniquement par les données génétiques sont limitées. En revanche, une fois que la cible présumée d’une hormone peptidique particulière est réduite à un type de cellule ou de tissu, ex vivo calcium d’imagerie des explants orgue peut servir à élucider l’orgue-à communication médiée par le peptide-GPCR signalisation. Moment de l’activation d’un RCPG Gq couplées, la concentration intracellulaire de Ca^{2 +} est augmentée en raison de la libération de Ca^{2 +} de l' ER¹⁰. Dans le cerveau, activation neurale augmente également le taux intracellulaire de Ca^{2 +} . Ces augmentations de Ca^{2 +} peuvent être détectées par un capteur de calcium, GCaMP, qui subit des changements conformationnels en présence de Ca^{2 +} résultant en fluorescence d’émission¹¹.

Dans cet article, un méthode d’imagerie à l’aide de Drosophila cerveau des explants de calcium est décrite. Pour tester la capacité d’un peptide à activer les neurones spécifiques, un peptide de test est appliqué à l’explant exprimant le GCaMP de cerveau, et les changements de fluorescence sont surveillés par microscopie confocale. L’implication de la GRCP est ensuite confirmée en effectuant la même épreuve en utilisant un mutant cerveau manque le RCPG. Cette combinaison de génétique et d’imagerie fournit des informations précises sur l’orgue au grand orgue communication en peptides-RCPG. Possible modifications et les applications du présent protocole sont également discutées.

Protocole

1. préparation des Explants de cerveau larvaire

1. Faire une salle d’imagerie.
   NOTE : Enregistrement Stable exige que les explants de cerveau être attaché. Ici, une chambre d’imagerie artisanaux, de faible coût est utilisée dans le Ca^{2 +} système d’imagerie.
   1. À l’aide de pinces, gratter le bas au centre d’un plat de culture en plastique (35 x 10 mm) pour créer une brèche pour le ganglion ventral du cerveau larvaire rendre le montage plus facile (étape 1.3, Figure 1).
   2. Avec un cure-dent, placez une petite goutte de colle de chaque côté de la dent et fixer une tige de tungstène (0,125 mm de diamètre, 6 à 7 mm de longueur) à la colle.
   3. À l’aide d’un petit morceau de mastic adhésif réutilisable, faire un mur circulaire (10 mm de diamètre et 3 mm de hauteur) entourant la dent (Figure 1).
      Remarque : L’espace à l’intérieur de la paroi sera plus tard rempli de solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 0,14 M NaCl, KCl, 0,0027 M 0,01 M PO₄^{3 -}, pH 7,4 ± 0,05 à 25 ° C).
2. Préparation animaux
   Remarque : Pour l’imagerie calcique, un indicateur de calcium, GCaMP6s, s’exprime dans le type de cellule d’intérêt, ce qui est couramment réalisée en utilisant des combinaisons de GAL4 tissu-spécifique et de SAMU-GCaMP6s. Pour vous assurer que le signal est médié par les récepteurs de candidat, GCaMP6s s’exprime également dans un mutant déficient dans le récepteur.
   1. Lorsque des comparaisons expérimentales pour des génotypes différents tels que le type sauvage et mutants sont nécessaires, âge des larves test match pour éviter les variations de niveau expression GCaMP6 et différences physiologiques en raison des stades de développement.
   2. Garder les mouches parentales (30 mouches pour chaque sexe) dans un flacon de culture contenant alimentaire mouche standard pendant 8 h permettre à Ponte sur la surface de l’aliment. Larves de culture en masse sous un cycle lumière-obscurité de 12 h à 25 ° C et 60 à 70 % d’humidité relative.
3. Dissection du cerveau larvaire
   1. 90-120 heures après la ponte (AEL), recueillir les larves et les laver au moins 3 fois avec de l’eau distillée pour enlever les débris alimentaires adhérentes.
   2. Place une larve sur un verre de montre carré 1,5 pouces bac à glace froide.
      Remarque : Les deux étapes suivantes sont effectuées dans ce verre de montre sous le microscope à dissection.
   3. Pince permet de saisir délicatement la partie médiane de la larve. Utiliser une autre pince pour saisir les crochets de la bouche et retirer les crochets de bouche doucement pour séparer la partie antérieure de la larve contenant le cerveau du reste du corps.
      Remarque : Vous pouvez également ciseaux chirurgicaux peut être utilisé.
   4. Tenez l’extrémité antérieure par forceps et mettez la larve à l’envers. Enlever les tissus étrangers rattachés au cerveau, tels que les disques imaginaux, corps gras et glande de l’anneau. Doucement le cerveau séparer les pièces buccales.
   5. Appliquer 200 µL de PBS à l’intérieur de l’anneau de l’adhésif réutilisable de mastic dans la salle d’imagerie. Aspirer doucement le cerveau disséqué avec PBS dans une pipette Pasteur et puis transférez-le dans la chambre d’imagerie.
4. Affectant le cerveau dans la chambre d’imagerie
   1. Pince permet de saisir des fibres musculaires qui s’étend des ganglions ventrales. Insérez doucement le cerveau dans la dent sous le fil de tungstène.
   2. Une autre pince, tirez le fil de tungstène légèrement jusqu'à placer le cerveau à l’emplacement correct pour l’imagerie (Figure 1).

2. l’acquisition des Images de Ca^{2 +} Fluorescence

Remarque : Les explants de cerveau plongés dans du PBS sont imagés à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un 20 X objectif à immersion dans l’eau (N.A. = 0,5). PBS n’active pas les cellules du cerveau. Si les images de l’axe z sont nécessaires, l’objectif est monté avec un moteur de lentille piézoélectrique activé. Une tête confocal de rotation disque est utilisée pour améliorer la résolution temporelle. Pour l’imagerie de la pénombre, un électron multipliant dispositif à couplage de charge caméra est monté sur le microscope. L’imagerie de fluorescence GCaMP6s (excitation/émission : 488/509 nm) nécessite un laser 488 nm pour l’excitation avec un séparateur de faisceau dichroïque et un filtre d’émission (p. ex.., 528 filtre passe-bande de ± 38 nm bande).

1. Placez la chambre d’imagerie contenant l’explant cerveau sous le microscope.
2. Abaisser l’objectif jusqu'à ce qu’il touche le PBS. Sous un éclairement lumineux-zone, placez le cerveau et l’amener dans le foyer. Basculez vers la lumière fluorescente et ajuster le focus sur les cellules marquées GCaMP6s.
   Remarque : La fluorescence verte basale de la GCaMP6s doit être visible.
3. Démarrer l’acquisition à 250 ms/cadre avec une résolution de 512 × 512 pixels en mode refroidi à l’eau en utilisant le logiciel d’acquisition appropriée (p. ex.., µManager). Ajuster la durée d’exposition pour obtenir les valeurs de la fluorescence au sein de la gamme dynamique de la caméra CCD, sans être inférieur à 1000 (unités arbitraires), avec les images 16 bits (plage dynamique 0-65 535).
   NOTE : Un temps d’exposition faible devrait servir à minimiser les photo-blanchiment de la GCaMP6s. Temps d’exposition doit être optimisé pour chaque expérience, puisqu’elle dépend des niveaux d’expression de la GCaMP6 et la sensibilité du système de détection. C’était 100 ms dans notre expérience, en utilisant dilp2 > GCaMP6s. Lorsque les profilés en z sont requises pour une profondeur donnée d’imagerie, plusieurs images de profilé en z peuvent être acquises selon les intervalles de temps et cadre de l’exposition. Si la caméra a une résolution spatiale suffisante, la taille binning (nombre de registres sur la puce qui va être mis en cellule dans un pixel numérique) doit être augmentée afin de réduire le temps d’exposition.
4. Une fois que les paramètres d’imagerie sont déterminés, prendre des photos pendant 1 min avant l’administration de peptides pour détecter l’intensité de signal de référence (F₀).
5. Appliquer le peptide de test ; pour ce faire, dissoudre 100 µL de solution de peptide dans du PBS et il Pipetter directement dans le bain de larve pour obtenir une concentration optimale.
   Remarque : La solution de peptide doit être injectée lentement (p. ex., débit débit 20 µL/s) dans la solution de bain à l’aide d’une pipette. Peptide synthétique non apparenté, dissoute dans du PBS est utilisée comme contrôle négatif.
6. Enregistrement de l’émission de GCaMP6s pendant quelques minutes.

3. analyse des données

Remarque : Données d’imagerie sont analysées en mode hors connexion avec le ImageJ. Au cours de l’imagerie Time-lapse, pipetage provoque le cerveau larvaire pour se déplacer. Par conséquent, aberrations positionnelles des série images doivent être corrigées avant l’analyse. La correction peut être effectuée à l’aide d’un plug-in, d’ImageJ TurboReg comme suit.

1. Ouvrez le logiciel d’analyse et d’utiliser la première image (avant application du peptide) comme une image de référence.
2. Sélectionnez Plugins | Inscription | TurboReg.
3. Choisissez le fichier image série comme la Source et l’image de référence comme la cible.
4. Recherchez les Corps rigide (déplacement parallèle et la rotation des images) et précis (« Rapide » est grossier mais analyse rapide au lieu de cela) la méthode de traitement et de la qualité, respectivement.
5. Cliquez sur lot pour commencer le traitement de l’image.
6. Sélectionner plusieurs régions d’intérêt (ROIs) en utilisant Analyze | Outils | Gestionnaire de ROI dans ImageJ.
7. Mesurer l’intensité du pixel en cliquant sur plus | Mesure multi | OK dans la fenêtre Gestionnaire de ROI.
8. Calculer ΔF/F₀ = (F - F,₀) / f₀, où F est l’intensité ROI au moment de la relance et F₀ est l’intensité à une fenêtre de temps précédant un événement expérimental particulier (p. ex. 30 cadres précédant le apparition de stimulation).
9. Répéter l’expérience à l’aide de plusieurs échantillons de cerveau, effectuant un traitement statistique pour obtenir la moyenne et l’écart-type de la moyenne (SEM) à chaque point dans le temps.

Résultats

Utilisant ce protocole, l’activation des cellules productrices d’insuline du cerveau (IPCs) de l’hormone peptidique, CCHa2, a été examinée. PISC du cerveau sauvage ont été marquées avec GCaMP6s à l’aide d’une combinaison de dilp2 -GAL4¹² (un don de Dr. Rulifson) et SAMU-GCaMP6s¹³ (Don de m. Kim). Explants de cerveau larvaires ont été traitées avec un peptide synthétique de CCHa2, et la fluorescence de G...

Discussion

Le Ca^{2 +} imagerie méthode décrite ici est un système utile pour tester le fonctionnement des hormones dans le cerveau. In vivo, le cerveau reçoit des hormones de divers organes endocriniens. En outre, le cerveau perçoit sans cesse croissant d’informations sensorielles, qui entraîne l’activation neuronale spontanée. Ce système ex vivo élimine ces bruits et donne un meilleur rapport signal/bruit que l’imagerie in vivo . Dans ce système, les molécules peuvent être test...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tungsten rod	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, Paris, France	3049100	putty-like reusable adhesives
Watch glass, square, 1 5/8 in	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	T900	Phosphated buffered salts
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japan		Custum-synthesized peptide
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	fluorescence microscope
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	420957-9900-000	water-immersion objective lens
P-725 PIFOC objective scanner with long travel range	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	N/A	piezoelectric-activated lens mover
Confocal Scanner Unit CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan	CSU-W1	spinning disc confocal head
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD camera
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	dichroic beam splitter
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	emission filter
µManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org
ImageJ	U. S. National Institutes of Health	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg	Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne	N/A	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/