Ex Vivo Calcio Imaging per visualizzare le risposte del cervello alla segnalazione endocrina in Drosophila

Riepilogo

Questo articolo descrive un protocollo per l'ex vivo imaging del calcio del cervello di Drosophila . In questo metodo, composti naturali o sintetiche possono essere applicati il buffer per testare la loro capacità di attivare particolari neuroni nel cervello.

Abstract

Organo per organo comunicazione mediante la segnalazione endocrina, ad esempio, dalla periferia al cervello, è essenziale per il mantenimento dell'omeostasi. Come un animale di modello per ricerca endocrina, Drosophila melanogaster, che dispone di sofisticati strumenti genetici e informazioni sul genoma, è sempre più utilizzato. Questo articolo viene descritto un metodo per l'imaging del calcio degli espianti del cervello di Drosophila . Questo metodo consente il rilevamento del segnale diretto di un ormone al cervello. È noto che molti ormoni peptidici agiscono attraverso i recettori accoppiati a proteine G (GPCR), cui attivazione provoca un aumento della concentrazione intracellulare di Ca^{2 +}. Attivazione neurale anche eleva i livelli intracellulari di Ca^{2 +} , da afflusso di Ca^{2 +} e il rilascio di Ca^{2 +} memorizzati nel reticolo endoplasmico (ER). Un sensore di calcio, GCaMP, può monitorare queste Ca^{2 +} modifiche. In questo metodo, GCaMP è espresso nei neuroni di interesse, e il cervello larvale che esprimono GCaMP è dissecato e coltivato ex vivo. Il peptide di prova viene quindi applicato per l'espianto di cervello, e vengono rilevate le modifiche fluorescenti in GCaMP utilizzando un microscopio confocale di filatura disco equipaggiato con una camera CCD. Utilizzando questo metodo, qualsiasi molecola solubile in acqua possa essere testato, e vari eventi cellulari associati con attivazione neurale possono essere imaged utilizzando gli opportuni indicatori fluorescenti. Inoltre, modificando la camera imaging, questo metodo può essere utilizzato per l'immagine di altri organi di Drosophila o degli organi di altri animali.

Introduzione

Comunicazione dell'organo--organo è una strategia evolutivamente conservata per il mantenimento dell'omeostasi per far fronte a cambiamenti ambientali. In esseri umani, una varietà di ormoni arereleased da ghiandole endocrine nella circolazione. Molti di questi ormoni come destinazione l'ipotalamo del cervello, che regola i processi metabolici e comportamenti fondamentali come l'alimentazione^1,2. Molti ormoni sono stati scoperti utilizzando modelli mammiferi. Tuttavia, i meccanismi della loro azione, soprattutto le reti interorgan a cui essi partecipano, rimangono in gran parte poco chiari.

Drosophila melanogaster è emerso come un utile modello per lo studio della comunicazione dell'organo--organo. In insetti, molti processi fisiologici sono controllati dagli ormoni. I primi studi sulla crescita e metamorfosi di messa a fuoco utilizzato grossi insetti. In questi studi, la rimozione o il trapianto di organi specifici predisse l'esistenza Inter-dell'organo molecole di segnalazione; più tardi, ormone giovanile (JH), ormone protoracicotropo (PTTH) ed ecdisone erano biochimicamente purificata^3,4,5. Una grande famiglia di peptidi segnalazione intercellulare è pensata per essere coinvolti in vari eventi fisiologici durante il ciclo di vita dell'insetto^6,7. La maggior parte di questi peptidi agiscono su recettori accoppiati a proteine G (GPCR), anche se i GPCR specifici erano inizialmente difficili da identificare mediante approcci convenzionali. La pubblicazione dell'intero genoma della drosofila sequenza⁸ è stata la svolta che ha permesso l'identificazione di peptidi bioattivi di Drosophila basato su loro omologia a quelli trovati in altri insetti. Inoltre, i recettori per i peptidi diversi sono stati identificati da GPCR preveduto nel genoma usando analisi di associazione GPCR-ligando cell-cultura-based. Successivamente, analisi di espressione predetto le vie dell'organo--organo suscitate da questi peptidi e recettori. In particolare, molti dei ricevitori del peptide putativo sono espressi nel cervello, suggerendo che il cervello è un obiettivo importante di peptide ormoni⁹. Inoltre, gli strumenti genetici avanzati in Drosophila hanno contribuito all'identificazione di ruoli fisiologici di combinazioni peptide-GPCR. Ad esempio, i sistemi trascrizionale binari LexA e GAL4 abilitare gene atterramento o sovraespressione in maniera controllata spazialmente e temporalmente. Gal4, un fattore di trascrizione identificato in lievito, si lega a una specifica sequenza di cis-regolatori chiamata sequenza di attivazione a Monte (UAS). Nel sistema GAL4/UAS, la riga di driver fornisce tessuto-specifica o espressione GAL4 fase-specifici e la linea di risponditore trasporta UAS a Monte del gene di interesse o il costrutto all'espressione di shRNA in auto. LexA/LexAop sistema è basato su un meccanismo simile. Analisi fenotipiche di animali di GPCR-atterramento di peptide-atterramento e tessuto-specifico tessuto-specifici possono rivelare informazioni sulla modalità di segnalazione di peptide-GPCR e sito di azione. Tuttavia, le conclusioni che possono essere raggiunto esclusivamente da dati genetici sono limitate. D'altra parte, una volta che il bersaglio putativo di un ormone peptidico particolare viene ristretto a un tipo di tessuti o cellule, ex vivo calcio imaging in espianti di organo utilizzabile per delucidare la comunicazione dell'organo--organo mediata dalla segnalazione del peptide-GPCR. Al momento dell'attivazione di un GPCR accoppiati a Gq, concentrazione intracellulare di Ca^{2 +} è aumentata a causa del rilascio di Ca^{2 +} dal ER¹⁰. Nel cervello, attivazione neurale anche eleva i livelli di Ca^{2 +} intracellulari. Tali aumenti di Ca^{2 +} possono essere rilevati da un sensore di calcio, GCaMP, che subisce cambiamenti conformazionali in presenza di Ca^{2 +} con conseguente emissione di fluorescenza¹¹.

In questo articolo, viene descritto un metodo di imaging utilizzando il cervello di Drosophila espianti di calcio. Per testare la capacità di un peptide di attivare specifici neuroni, un peptide di prova viene applicato per l'espianto di cervello GCaMP-esprimendo, e cambiamenti di fluorescenza sono controllati mediante microscopia confocale. Il coinvolgimento dei GPCR viene confermato eseguendo la stessa analisi utilizzando un mutante cervello manca il GPCR. Questa combinazione di immagine e genetica fornisce informazioni precise sulla comunicazione dell'organo--organo di peptidi-GPCR. eventuali modifiche e applicazioni del presente protocollo inoltre sono discussi.

Protocollo

1. preparazione del cervello larvale espianti

1. Prenotare una camera di imaging.
   Nota: La registrazione stabile richiede che i cervello espianti essere legati. Qui, una camera di imaging a basso costo, fatto a mano è usata nel Ca^{2 +} sistema di imaging.
   1. Usando il forcipe, graffiare il basso al centro di un piatto di plastica cultura (35 x 10 mm) per creare un'ammaccatura per il ganglio ventrale del cervello larvale rendendo il montaggio più facile (passaggio 1.3, Figura 1).
   2. Con uno stuzzicadenti, mettere una piccola goccia di colla su entrambi i lati dell'ammaccatura e allegare un'asta di tungsteno (0,125 mm di diametro, 6-7 mm di lunghezza) per la colla.
   3. Con un piccolo pezzo di adesivo riutilizzabile pastoso, fare un muro circolare (10 mm di diametro e 3 mm di altezza) che circondano l'ammaccatura (Figura 1).
      Nota: Lo spazio all'interno della parete sarà successivamente riempito di tampone fosfato salino (PBS; 0,14 M NaCl, KCl, M 0,0027 0,01 M PO₄^{3 -}, pH 7,4 ± 0.05 a 25 ° C).
2. Preparazione degli animali
   Nota: Per l'imaging del calcio, un indicatore del calcio, GCaMP6s, è espresso nel tipo cella di interesse, che è comunemente ottenuto utilizzando combinazioni di GAL4 UAS-GCaMP6se tessuto-specifici. Per garantire che il segnale è mediato attraverso il recettore di candidato, GCaMP6s si esprime anche in un mutante difettoso nel ricevitore.
   1. Quando sono richiesti confronti sperimentali per i diversi genotipi come wild-type e mutanti, età larve test match per evitare variazioni di livello di espressione GCaMP6 e differenze fisiologiche a causa di fasi inerenti allo sviluppo.
   2. Tenere mosche parentale (30 mosche per ciascun sesso) in un flacone di coltura contenenti cibo standard volo per 8 h consentire la deposizione delle uova sulla superficie del cibo. Larve di cultura in massa nell'ambito di un ciclo luce-buio di 12 h a 25 ° C e 60-70% di umidità relativa.
3. Dissezione del cervello larvale
   1. A 90-120 h dopo (AEL) la deposizione delle uova, le larve di raccogliere e lavarli almeno 3 volte con acqua distillata per rimuovere i residui di cibo aderente.
   2. Posto una larva su un vetro da orologio quadrato 1,5 pollici riempito con PBS freddo ghiaccio.
      Nota: I due passaggi successivi sono effettuati in questo vetro d'orologio sotto il microscopio per dissezione.
   3. Utilizzare pinze per afferrare delicatamente la parte centrale della larva. Utilizzare un'altra pinza per afferrare i ganci di bocca e tirare i ganci di bocca delicatamente per separare la parte anteriore della larva contenente il cervello dal resto del corpo.
      Nota: In alternativa, possono essere utilizzate forbici chirurgiche.
   4. Tenere la punta anteriore dal forcipe e girare la larva dentro e fuori. Rimuovere il tessuto estraneo attaccato al cervello, come i dischi immaginali, corpi grassi e anello della ghiandola. Separare delicatamente il cervello dall'apparato boccale.
   5. Applicare 200 µ l di PBS all'interno dell'anello composto l'adesivo riutilizzabile e mastice-come nella camera di imaging. Succhiare delicatamente il cervello sezionato con PBS in una pipetta Pasteur e poi trasferirlo nella camera di imaging.
4. Impostazione del cervello nella camera di imaging
   1. Utilizzare pinze per afferrare le fibre muscolari che si estende dai gangli ventrali. Inserire delicatamente il cervello l'ammaccatura sotto il filo di tungsteno.
   2. Utilizzando un altro forcipe, tirare il filo di tungsteno leggermente fino a posizionare il cervello alla posizione corretta per l'imaging (Figura 1).

2. acquisizione di Ca^{2 +} fluorescenza immagini

Nota: Espianti di cervello immersi in PBS sono Imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza equipaggiato con un 20x obiettivo di immersione in acqua (N.A. = 0.5). PBS non attiva le cellule del cervello. Se sono necessarie immagini asse z, l'obiettivo è montato con un motore piezoelettrico-attivata lente. Una testa confocal di filatura del disco viene utilizzata per migliorare la risoluzione di tempo. Per l'imaging di scarsa illuminazione, un elettrone moltiplicando charge coupled device fotocamera è montato sul microscopio. La formazione immagine di fluorescenza GCaMP6s (eccitazione/emissione: 488/509 nm) richiede un laser di 488 nm per l'eccitazione con un divisore di fascio dicroici e un filtro di emissione (ad es., 528 filtro passa-banda banda di ± 38 nm).

1. Posizionare la camera imaging contenente l'espianto di cervello al microscopio.
2. Abbassare la lente dell'obiettivo fino a che tocca il PBS. Sotto illuminazione in campo chiaro, posizionare il cervello e portare a fuoco. Passare a luce fluorescente e regolare la messa a fuoco sulle cellule GCaMP6s-labeled.
   Nota: La fluorescenza verde basale il GCaMP6s dovrebbe essere visibile.
3. Avvia acquisizione a 250 ms/frame con una risoluzione di 512 × 512 pixel in modalità raffreddato ad acqua, utilizzando il software di acquisizione appropriato (ad es., µManager). Regolare il tempo di esposizione per ottenere i valori di fluorescenza all'interno della gamma dinamica della fotocamera CCD, ma non inferiori a 1000 (unità arbitrarie), con immagini a 16 bit (gamma dinamica 0-65.535).
   Nota: Un tempo di esposizione basso dovrebbe essere utilizzato per ridurre al minimo i foto-candeggio della GCaMP6s. Tempo di esposizione dovrebbe essere ottimizzata in ogni esperimento dipende i livelli di espressione di GCaMP6 e la sensibilità del sistema di rilevamento. E ' stato 100 ms nel nostro esperimento utilizzando dilp2 > GCaMP6s. Quando z-sezioni sono necessari per una data profondità imaging, diverse immagini di z-sezione possono essere acquisite a seconda gli intervalli di tempo e cornice di esposizione. Se la fotocamera dispone di sufficiente risoluzione spaziale, la dimensione binning (numero di registri sul chip che verrà essere cestinate in un pixel digitale) dovrebbe essere aumentata per ridurre il tempo di esposizione.
4. Una volta determinati parametri di imaging, prendere le immagini per 1 min prima della somministrazione del peptide per rilevare l'intensità del segnale di linea di base (F₀).
5. Applicare il peptide di prova; per questo, sciogliere 100 µ l di soluzione di peptide in PBS e pipettare esso direttamente nella vasca larvale per produrre una concentrazione ottimale.
   Nota: La soluzione di peptide deve essere iniettata lentamente (ad es., flusso tariffa 20 µ l/s) nella soluzione vasca utilizzando una pipetta. Peptide sintetico estranei disciolti in PBS viene utilizzato come controllo negativo.
6. Registrare l'emissione di GCaMP6s per pochi minuti.

3. analisi dei dati

Nota: Dati di Imaging sono analizzati non in linea con il ImageJ. Durante l'imaging time-lapse, pipettaggio induce il cervello larvale spostare. Di conseguenza, posizionali aberrazioni delle immagini seriale devono essere corretto prima dell'analisi. La correzione può essere eseguita utilizzando un plug-in, di ImageJ TurboReg come segue.

1. Aprire il software di analisi e utilizzare il primo fotogramma (prima dell'applicazione del peptide) come immagine di riferimento.
2. Selezionare plug- | Registrazione | TurboReg.
3. Scegliere il file di immagine seriale come l' origine e l'immagine di riferimento come destinazione.
4. Verifica Corpo rigido (parallelo spostamento e rotazione delle immagini) e preciso ("Veloce" è grossa ma veloce analisi invece) per il metodo di lavorazione e qualità, rispettivamente.
5. Fare clic su Batch per avviare l'elaborazione di immagini.
6. Selezionare più aree di interesse (ROI) utilizzando Analyze | Strumenti | Manager di ROI in ImageJ.
7. Misurare l'intensità di pixel cliccando più | Multi misura | OK nella finestra Gestione ROI.
8. Calcolare ΔF/F₀ = (F - F₀) / f₀, dove F è l'intensità ROI al momento dello stimolo, e F₀ è l'intensità a una finestra di tempo immediatamente prima di un determinato evento sperimentale (ad esempio, 30 fotogrammi precedenti la insorgenza di stimolo).
9. Ripetere l'esperimento utilizzando campioni multipli del cervello, lo svolgimento di elaborazioni statistiche per ottenere la media e l'errore standard della media (SEM) in ogni momento.

Risultati

Usando questo protocollo, l'attivazione delle cellule cerebrali che producono insulina (IPCs) dall'ormone peptide, CCHa2, è stato esaminato. IPC del selvaggio-tipo cervello sono stati etichettati con GCaMP6s usando una combinazione di dilp2 -GAL4¹² (un regalo da Dr. Rulifson) e UAS-GCaMP6s¹³ (un regalo da Dr. Kim). Cervello larvale espianti sono stati trattati con un peptide sintetico di CCHa2, e la fluorescenza da GCaMP6s...

Discussione

Il Ca^{2 +} imaging metodo qui descritto è un sistema utile per testare la funzione degli ormoni nel cervello. In vivo, il cervello riceve gli ormoni dai vari organi endocrini. Inoltre, il cervello percepisce costantemente crescente di informazioni sensoriali, che provoca l'attivazione neuronale spontanea. Questo sistema ex vivo elimina tale rumore e produce un migliore rapporto segnale/rumore rispetto all'imaging in vivo . In questo sistema, le molecole possono essere testati singolar...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tungsten rod	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, Paris, France	3049100	putty-like reusable adhesives
Watch glass, square, 1 5/8 in	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	T900	Phosphated buffered salts
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japan		Custum-synthesized peptide
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	fluorescence microscope
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	420957-9900-000	water-immersion objective lens
P-725 PIFOC objective scanner with long travel range	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	N/A	piezoelectric-activated lens mover
Confocal Scanner Unit CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan	CSU-W1	spinning disc confocal head
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD camera
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	dichroic beam splitter
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	emission filter
µManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org
ImageJ	U. S. National Institutes of Health	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg	Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne	N/A	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/