التصوير Ca2 + الردود خلال العدوى دوسنتاريا الخلايا الظهارية

Summary

نقدم هنا، البروتوكولات تصور ردود الكالسيوم (Ca^{2 +}) أثارت هيلا الخلايا المصابة دوسنتاريا. عن طريق تحسين معلمات العدوى البكتيرية والتصوير مع Ca^{2 +} نيون تحقيقات، تتميز شاذة العالمية والمحلية Ca^{2 +} إشارات الناجم عن البكتيريا على نطاق كبير من حركية العدوى.

Abstract

Ca^{2 +} أيون في كل مكان في جميع العمليات الخلوية المعروفة. بينما Ca^{2 +} الردود العالمية قد تؤثر على مصير الخلية، الاختلافات المحلية في الحرة Ca^{2 +} سيتوسوليك التركيزات، مرتبطة بإطلاق سراح من المخازن الداخلية أو تدفق من خلال قنوات غشاء البلازما، وتنظم عمليات الخلية القشرية. مسببات الأمراض التي تلتزم أو غزو الخلايا المضيفة الزناد إعادة تنظيم cytoskeleton أكتين الكامنة وراء غشاء البلازما المضيف، الذي يحتمل يؤثر على العالمية والمحلية على السواء Ca^{2 +} إشارات. نظراً لأن هذه الأحداث قد يحدث في الترددات المنخفضة بطريقة عشوائية الزائفة عبر حركية الموسعة، وتحليل Ca^{2 +} إشارات الناجمة عن مسببات الأمراض يثير التحديات التقنية الرئيسية التي يتعين معالجتها.

هنا، نحن تقرير البروتوكولات للكشف عن العالمية والمحلية Ca^{2 +} إشارات عند مرض دوسنتاريا الخلايا الظهارية. في هذه البروتوكولات، والتحف الفنية المرتبطة بتعرض لفترة طويلة ويتم troubleshot د المرتبطة بالإثارة من Ca^{2 +} نيون المسابير بصرامة مراقبة لبارامترات على مدى فترات زمنية محددة خلال دوسنتاريا الغزو. وتنفذ إجراءات لدقة تحليل السعة والتردد العالمي سيتوسوليك Ca^{2 +} إشارات خلال حركية العدوى الموسعة باستخدام مسبار الكيميائية فلوو-4.

Introduction

Ca^{2 +} وينظم جميع عمليات الخلية المعروفة، بما في ذلك إعادة تنظيم سيتوسكيليتال والردود التحريضية ومسارات موت الخلية تتصل بالمضيف الممرض التفاعلات^1،،من²³. في ظل الظروف الفسيولوجية، القاعدية سيتوسوليك Ca^{2 +} تركيزات متدنية، ومئات من شمال البحر الأبيض المتوسط المدى، ولكن يمكن إخضاعها للزيادات عابرة على تحفيز مؤثر. غالباً ما تظهر هذه الاختلافات السلوك متذبذبة من خلال عمل المضخات وقنوات في أغشية البلازما وهيولي. نمط هذه التذبذبات تتميز بهذه الفترة، والمدة، والسعة من Ca^{2 +} الزيادات، ويتم فك تشفيرها بواسطة الخلايا التي، بدورها، تؤدي إلى استجابات محددة في ما يعرف باسم ال Ca^{2 +} رمز^4،5 . زيادة مطردة في Ca^{2 +} تركيز سيتوسوليك في ظل الظروف المرضية قد تؤدي إلى موت الخلايا المرتبطة permeabilization أغشية الميتوكوندريا وإطلاق سراح برو--أبوبتوتيك أو^{، عوامل نخرية6 7}.

دوسنتاريا، المسبّب للزحار العصوي، يغزو الخلايا الظهارية عن طريق حقن المستجيبة في الخلايا المضيفة باستخدام نوع الثالث إفراز نظام (T3SS)^8،9. ويرتبط غزو دوسنتاريا بالخلايا المضيفة مع المحلية والعالمية Ca^{2 +} إشارات T3SS. أما بالنسبة لتشكيل المسام السموم، ترانسلوكون T3SS أن يدخل في أغشية الخلايا المضيفة ومطلوب لحقن المستجيبة T3SS من المرجح المسؤولة عن تفعيل المجلس التشريعي الفلسطيني وتريسفوسفاتي inositol (1، 4، 5) (InsP3)--كاليفورنيا تعتمد^{2 +} الإصدار. المزيج من تنشيط المجلس التشريعي المترجمة وتراكم أكتين مبلمرة في مواقع نتيجة غزو دوسنتاريا في يظهر طويلة الأمد تعتمد على InsP3 Ca^{2 +} الإصدار¹⁰. المستجيب الثالث نوع إيبجد، بيسفوسفاتي الفوسفاتيديل 4، 5 (PIP2)-4-الفوسفاتيز، يحد من مقدار المحلية PIP2، وبالتالي السيطرة على كمية الركازة المتاحة للمجلس التشريعي الفلسطيني لتوليد InsP3، مما يسهم في حبس Ca المحلية^{2 +} الردود على الغزو الجرثومي مواقع^11،12. تسهم هذه Ca^{2 +} الاستجابات المحلية المحتمل بلمرة الأكتين في دوسنتاريا غزو مواقع¹⁰. Ca^{2 +} الردود العالمية التي أثارت أيضا دوسنتاريا, ومع ذلك، يمكن الاستغناء عنها لعملية الغزو البكتيري ولكن تؤدي إلى فتح هيميتشاننيلس كونيكسين في غشاء البلازما والإفراج عن ATP في الخلية حجرة. صدر ATP يتصرفون بطريقة paracrine، يحفز بدوره، Ca^{2 +} متذبذبة الردود في الخلايا المجاورة للخلية المصابة. إيبجد أيضا المسؤولة عن تشكيل Ca^{2 +} الردود العالمية إلى عدم انتظام الردود معزولة مع ديناميات بطيئة. في نهاية المطاف، على عدوى بكتيرية مطول، إيبجد يؤدي إلى تثبيط InsP3 بوساطة Ca^{2 +} إشارات. من خلال تدخلها مع Ca^{2 +} إشارات، يؤخر إيبجد Ca^{2 +}-كالباين يعتمد التنشيط مما يؤدي إلى تفكيك هياكل التصاق المحورية والمفرزة سابقا لأوانه لإصابة خلايا¹³.

في حين تشارك Ca^{2 +} إشارات في الجوانب الحرجة المرضية، استخدام الكائنات الدقيقة يثير عددا من التحديات التقنية التي لم تصادف في الدراسات الكلاسيكية مؤثر. استخدام البروتوكولات المذكورة هنا استخداماً الفلورسنت Ca^{2 +} الكيميائية المؤشر فلوو-4 أن علينا إجراء هندسة عكسية لتوصيف Ca^{2 +} إشارات المحلية أثناء مرض دوسنتاريا . وتناقش الخطوات الحاسمة للكشف عن هذه الإشارات، فضلا عن الإجراءات المنفذة للتحليل الكمي بما هو مطلوب لتوصيف دور المستجيبة البكتيرية في Ca^{2 +} إشارات.

Protocol

1-الأعمال التحضيرية

1. إعداد البكتيريا
   1. لوحة البكتيريا-دوسنتاريا السلالة البرية من نوع التعبير عن أدهيسين أف (M90T-أف) – على تريبتيكاسي أجار فول الصويا (TCS) لوحة تحتوي على أحمر الكونغو 0.01 ٪ (CR) واحتضانها لهم ح 18 عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: لزيادة إمكانية تكرار نتائج بهم، لوحات دوسنتاريا التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.1.1 مخزنة في 4 درجات مئوية وينبغي أن تستخدم في غضون أسبوع، نظراً لأن جميع المستعمرات في متوسطة الجمهورية التشيكية سوف تتحول في نهاية المطاف الحمراء على مر الزمن.
   2. تطعيم TCS مرق ما قبل الثقافة بانتقاء المستعمرات الأحمر 3 من لوحات متتالية.
      ملاحظة: يتم تطعيم مع المستعمرات 3 للحد من احتمال التقاط استنساخ واحدة بلازميد الفوعة التي مرت جزئ وراثية.
   3. تنمو الثقافات البكتيرية السائلة في حاضنة تهتز ح 16 في 37 درجة مئوية 200 لفة في الدقيقة. إضافة الأمبيسلّين بتركيز نهائي 75 ملغ/مل. تركيزات المضادات الحيوية يجب أن لا تتجاوز 3 × تركيز الحد الأدنى المثبطة، وجود فائض من المضادات الحيوية قد تؤدي إلى فقدان بلازميد فوعة كبيرة.
      ملاحظة: ينبغي التحقق من الحفاظ على بلازميد الفوعة دوسنتاريا بطلاء الثقافات البكتيرية في لوحات CR تستكمل مع تركيزات المضادات الحيوية المناسبة. وجود مستعمرات بيضاء تشير إلى فقدان بلازميد.
   4. تلقيح ثقافة TCS مع ثقافة ما قبل البكتيرية في إضعاف 1: 100. احتضان أنه عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز ح 2 200 لفة في الدقيقة. التأكد من أن الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD_600nm) هو 0.2-0.4.
   5. الطرد المركزي ثقافة البكتيرية لمدة 2 دقيقة في 13,000 س ز على 21 درجة مئوية وريسوسبيند بيليه في وحدة تخزين ما يعادل متوسطة م (120 ملم كلوريد الصوديوم، 7 مم بوكل، 1.8 مم كاكل₂، مجكل 0.8 ملم₂، الجلوكوز 5 مم و 25 مم حبيس ، pH = 7، 3).
   6. تمييع تعليق البكتيرية في مخزن مؤقت م في التطوير التنظيمي نهائي_600nm من 0.1 واستخدامه على الفور أو تخزينها في 21 درجة مئوية واستخدامه داخل 60 دقيقة القادمة.
2. إعداد الخلية
   1. تستكمل مع 10% مصل العجل الجنين (FCS) خلايا هيلا الثقافة في دميم مع 1 غرام/لتر السكر وتنمو لهم في 37 درجة مئوية مع 10% CO₂. تنمو TC-7 تزرع في دميم مع 4.5 غ/لتر السكر، تحتوي على السفح 10% والأحماض الأمينية غير الضرورية في حاضنة 37 درجة مئوية التي تحتوي على 10% CO₂.
   2. لصيانة الخلية، وانقسام الخلايا بشكل منتظم لتجنب تثبيط النمو-اتصل مرتبطة بالدول المتلاقية؛ هذا أمر بالغ الأهمية Ca^{2 +} مسبار تحميل/تعداء كفاءة عالية.
   3. لوحة خلايا هيلا على كوفيرسليبس دائرية قطرها 25 ملم معقمة في لوحات 6-جيدا في كثافة 3 × 10⁵ خلايا/جيدا اليوم قبل التجربة لخلايا هيلا.
   4. للخلايا TC-7، تريبسينيزي، وحساب عدد الخلايا. البذور منها في 4 × 10⁵ خلايا/حسنا واحتضانها لهم 5-7 أيام عند 37 درجة مئوية في شركة 10%₂-حاضنة قبل التجارب للسماح لاستقطاب.
      1. تحديث مستنبت الخلية كل يوم حتى اليوم من هذه التجربة.
         ملاحظة: كما يمكن استخدام الزجاج السفلي قطرها 35 ملم الدوائر المتاح كبديل للآبار التي تحتوي على كوفيرسليبس. إذا استخدمت هذه الأخيرة، التحكم في درجة الحرارة خلال مرحلة ساخنة أو الهدف ليس كافياً، وغرفة حضانة للحرارة التي شنت على مرحلة مجهر مطلوب.
3. يوم التجربة، إزالة المتوسطة وتغسل الخلايا 3 x مع 1 مل م المتوسطة عند 21 درجة مئوية.
4. تحميل الخلايا مع 3 مم فلوو-4-ص¹⁴ في مخزن مؤقت م لمدة 30 دقيقة عند 21 درجة مئوية.
   ملاحظة: أثناء تحميل خلايا هيلا المتلاقية الفرعي لا تثير مشاكل كبيرة، تحميل خلايا TC-7 الاستقطاب غالباً غير متجانسة وضعف كفاءة. لهذه الخلايا، وجدنا أن يعزز كفاءة التحميل بإضافة عامل تفريق – حمض بلورونيك – بتركيز نهائي 0.1% ومن بروموسولفوفتالين المانع شاردة-الناقل بتركيز 20 ميكرومتر إلى نهائي فلوو-4-صباحا-تتضمن م. استخدام راتيوميتريك الكيميائية تحقيقات أو ترميز وراثيا-الحنق المسابير التي تتطلب المزدوج-اقتناء غير متوافق مع سرعة اقتناء المطلوبة للتصوير من Ca^{2 +} الاستجابات المحلية.
5. تغسل العينات 3 x مع م المخزن المؤقت وكذلك احتضان لهم في 1 مل م المخزن المؤقت في 21 درجة مئوية للسماح للتحلل المائي للنصف صباحا. استخدام فلوو-4 تحميل خلايا فورا أو في غضون القادم 90 دقيقة (الحفاظ على 21 درجة مئوية).

2-العدوى والحصول على الصور من كاليفورنيا المحلية^{2 +} الردود

1. ضع ساترة تحتوي على خلايا فلوو-4 تحميل في غرفة التصوير أو الدائرة أسفل الزجاج. تغسل العينات في قاعة التصوير أو المتاح أسفل الزجاج الدائرة x 3 مع المخزن المؤقت م لإزالة مركبات يحتمل أن تكون الناتجة عن تحلل الخلية. أضف 1 مل م المخزن المؤقت.
2. ضع الدائرة على مرحلة مجهر مقلوب fluorescence ساخنة في 33 درجة مئوية.
   ملاحظة: يتم تحديد درجة الحرارة هذه كحل وسط بين درجات الحرارة المثلى متوافقة مع عملية غزو دوسنتاريا وتباطؤ Ca^{2 +} الردود تصور الاستجابات المحلية. نستخدم 63 × الهدف النفط الغمر (NA = 1.25) مجهزة بمرحلة التباين الخواتم.
3. حدد حقل مجهرية وإعداد المعلمات الحصول، بما في ذلك وقت التعرض و binning إذا لزم الأمر، لتحسين إشارة الفلورسنت فلوو-4.
   ملاحظة: التحديات الرئيسية للمحلية Ca^{2 +} تصوير السعة منخفضة ومدة صغيرة من الردود، التي تتطلب حيازة السيدة 30 مرة على الأقل كل المتاحة تجارياً مضيئة في الظهر م-اتفاقية مكافحة التصحر أو C-موس كاميرات عدة الوقت الحاضر المطلوبة حساسية للكشف عن Ca^{2 +} الاستجابات المحلية استخدام فلوو-4. الكشف عن حساسية مسألة هامة أيضا للحد من د أو المصنوعات اليدوية مثل الردود العفوية المرتبطة بالإثارة الفلورسنت فلوو-4 على تردد عالي. هنا، إضاءة LED-على أساس من 470 استخدمت شمال البحر الأبيض المتوسط، مع عامل تصفية إثارة فرقة-تمرير شمال البحر الأبيض المتوسط 480 ± 40 ومرشح مزدوج اللون 505 نانومتر 527 ± 30 نانومتر فرقة-تمرير انبعاثات المستخدمة في 5% شدته القصوى جنبا إلى جنب مع مرشح كثافة محايدة 1.0 للتقليل من هذه المشاكل تحت تيار مقتنيات لمدد محدودة. تحليل Ca^{2 +} إشارات المحلية بدفعات من 120 s تيارات أنجز بشكل روتيني. في ظل هذه الظروف منخفضة الإضاءة، لم يلاحظ فوتوبليتشينج فلوروفوري خلال عمليات الشراء 2 دقيقة-تيار. يمكن إجراء عمليات الشراء المتتالية على نفس العينة، شريطة أن تستخدم حقول مختلفة. كقاعدة عامة، يتم تنفيذ دفق اقتناء أولى في حقل تحكم في غياب التحفيز البكتيريا لضمان عدم وجود ردود تلقائية. إذا لوحظت استجابات عفوية، تغسل العينات مع م المخزن المؤقت حتى يتم ملاحظة أي ردود.
4. لإضافة البكتيريا بالعينة، إزالة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت م من الدائرة وإضافة 500 ميليلتر من تعليق البكتيرية أعد الخطوة 1.1.6 للحصول على التطوير التنظيمي نهائي_600nm 0.05، مع العناية الملائمة لتجنب نقل الحقل المحدد المجهري؛ تضمن وحدات التخزين خلط السليم للبكتيريا وتوزيعا متجانساً للبكتيريا على عينات الخلايا.
5. إجراء شراء عند إضافة البكتيرية. بدلاً من ذلك، القيام اقتناء 10 دقيقة بعد إضافة البكتيرية، التي تتوافق مع الوقت المطلوب للبكتيريا للرواسب على الخلايا تحت ظروف استخدامها. في نهاية الدفق اقتناء، الحصول على صورة مرحلة-على النقيض من الحقل المحدد لتصور البكتيريا الاتصال بالخلايا والكشكشة غشاء المرتبطة بمواقع الغزو الجرثومي.
6. كرر الإجراء اقتناء كما في الخطوة 2، 5، على فترات قابلة لمدة الحيازة الصورة وملفات تحقيق وفورات، واختيار حقل جديد لتغطية العملية برمتها.
   ملاحظة: دوسنتاريا، وجدنا أن اقتناء تيارات كل 5 دقائق لمدة 20 دقيقة، بعد الترسيب البكتيرية 10 دقيقة، يسمح بتغطية معظم أحداث الغزو.
7. في نهاية عملية اقتناء، إضافة بتركيز نهائي 2 ميكرومتر من Ca^{2 +} إيونوفوري إيونوميسين العينات لتحديد السعة القصوى من Ca^{2 +} الإشارات. الحصول على الصور كل 3-5 ق حتى إشارة الاستقرار، عادة لمدة أقل من 10 دقيقة.
8. اتبع بإضافة Ca^{2 +} تشيلاتور عطا بتركيز نهائي 10 ملم لتحديد إشارة fluorescence في غياب Ca^{2 +}. الحصول على الصور كل 3-5 ق حتى إشارة الاستقرار، عادة لمدة أقل من 10 دقيقة.
   ملاحظة: بسبب ديناميات بطيئة نسبيا من Ca^{2 +} التغيرات العالمية، تنفيذ هذه المقتنيات كل 3-5 ق (وليس في وضع الدفق)، السماح ل Ca^{2 +} التصوير في نفس الحقل المجهري خلال العلاجات المتتالية.

3-تحليل

1. التعبير عن سيتوسوليك Ca^{2 +} التغيرات مع مرور الوقت كنسبة مئوية من ΔF/و₀، حيث يمثل ΔF الاختلاف من الأسفار متوسط كثافة منطقة الفائدة (ROI) وو₀ fluorescence الأساس في نفس العائد على الاستثمار، الذي يتم طرح المنطقة غير ذات الصلة بالحقل خاليا من الخلايا.
   1. إزالة المستويات القاعدية الأسفار لكل خلية في مختلف الميادين، والمقابلة لمستويات خط الأساس؛ هذه المستويات يمكن تحديده من دون لبس بسبب التردد المنخفض ومدة من Ca^{2 +} الاستجابات المحلية في عملية شراء تيار معين قصيرة نسبيا.
      ملاحظة: قياس السمات البارزة للإجابات المتعلقة بالأسئلة ونموذج الممرضة درس. كلاسيكي، تؤخذ في الاعتبار مختلف المعالم لتحليل Ca^{2 +} الإشارات، بما في ذلك تواتر الخلايا تظهر Ca^{2 +} الردود المحلية أو العالمية، فضلا عن المدة والسعة، وتواتر هذه الردود. في حالة دوسنتاريا والاستجابات المحلية، هو جانب هام آخر للتحليل الرابطة المكانية للردود مع مواقع الغزو الجرثومي.
2. لتحديد النسبة المئوية للخلايا استجابة عرض الاستجابات العالمية أو المحلية، رسم رويس في الخلايا، وفي السلسلة الزمنية المقابلة لاختلافات كثافة فلوو-4.
   1. تعيين معلمات صارمة لتحديد Ca^{2 +} الاستجابات المحلية، مثل سعة ثلاثة إضعاف الاختلافات الخلفية أعلاه fluorescence متوسط كثافة الخلية خط الأساس، أو مدة على الأقل في 200 من مرض التصلب العصبي المتعدد، لتجنب النقاط إيجابية كاذبة.
      ملاحظة: كقاعدة عامة، يمكن تمييز Ca^{2 +} الاستجابات المحلية الصغيرة حتى من أي ضجيج الخلفية بتلك الشخصية. رويس ينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي إدراج إشارات الأسفار ما يكفي للسماح للكشف عن الاختلافات المحلية. اعتماداً على كثافة كشف فلوو-4، قد تتوافق مع هذه رويس إلى دوائر بأقطار تتراوح ما بين 2-5 مم.
   2. قياس اختلافات كثافة fluorescence فلوو-4 متوسط في المناطق 2 في منطقة متميزة من نفس الخلية، تحديد ما إذا كانت الردود المحلية أو العالمية.
      ملاحظة: هو تيسير تحليل عدد كبير من الخلايا باستخدام التصوير البرمجيات تسمح بعرض الشاشة على الخط لاختلافات كثافة fluorescence متوسط على مر الزمن لمناطق مختارة. البرمجيات المتاحة تجارياً والتصوير هذا خيار، ولكن هذا يمكن أيضا إجراء استخدام مجانية الجليدية ، باستخدام البرنامج المساعد تطور كثافة العائد على الاستثمار .
   3. تحديد النسبة المئوية للخلايا تظهر الاستجابات المحلية.
      ملاحظة: يتم حساب هذه النسبة المئوية من العدد الإجمالي للخلايا التي تم تحليلها في مجال الفحص المجهري، التي ينبغي أن تكون بإعداد كافية لدعم أهمية إحصائيا باستخدام اختبار غير حدودي.
   4. تحديد المدة للاستجابات المحلية.
      ملاحظة: المحلية Ca^{2 +} الردود يمكن كذلك التمييز وفقا نطاقاتها المدة (أي أقل من 500 مللي، بين 5 و 10 s، أو فوق 10 s) وارتباطها بمواقع الغزو دوسنتاريا .
3. قياس السعة للردود. أولاً، قم بمعايرة القصوى Ca^{2 +} وخلية خلفية مستويات العزم كما هو الحال في الخطوة 2.1.7. منذ الحمل فلوو-4 قد تختلف لكل خلية، تنفيذ هذه القرارات لخلايا فردية في الحقل.
   1. التعبير عن السعة للردود كنسبة مئوية نسبية من الاستجابة القصوى.
   2. قم بإجراء اختبار الإحصائية باستخدام اختبار الحياة الطبيعية، متبوعاً باختبار حدودي لتحليل الاختلافات المحتملة في السعة للردود بين العينات.
   3. تحديد الرابطة من هذه الردود بالنسبة لمواقع الغزو الجرثومي بهم التعريب كل منهما الكشكشة الغشاء الجرثومي الناجم عن تصور في الصور التباين مرحلة المقابلة.

النتائج

غزو دوسنتاريا يرتبط شاذة طويلة الأمد Ca^{2 +} الاستجابات المحلية:

وبعد البروتوكول المذكور أعلاه، طعن خلايا هيلا فلوو-4-تحميل مع WT دوسنتاريا والمقتنيات تيار أجريت لتحليل Ca^{2 +} إشارات. تجربة ممثل ويرد في الشكل 1...

Discussion

ويصف هذه المخطوطة البروتوكول الذي نحن هندسيا لمتابعة Ca^{2 +} إشارات المحلية خلال حركية قصيرة نسبيا من غزو دوسنتاريا ، فضلا عن Ca^{2 +} الردود العالمية خلال حركية موسعة من دوسنتاريا. أدناه، إشارات يمكن وجدت القضايا التي يلزم التصدي لها لتحسين الكشف عن Ca^{2 +} المفتاح مع التق?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph version 7.7	Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2	Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high	IBIDI	81156
Trypticase Soy (TCS) broth	Thermofisher		B11768
TCS agar	Thermofisher		B11043
Congo red	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017	isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin