Ca2 + Antworten Imaging während der Shigella Infektion von Epithelzellen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um Kalzium (Ca^{2 +}) Reaktionen hervorgerufen durch HeLa-Zellen infiziert durch Shigellazu visualisieren. Durch die Optimierung der Parameter der bakteriellen Infektion und Bildgebung mit Ca^{2 +} fluoreszierende Sonden, sind atypische globaler und lokaler Ca^{2 +} Signale über einen grossen Bereich der Infektion Kinetik durch Bakterien verursachten gekennzeichnet.

Zusammenfassung

Ca^{2 +} ist eine allgegenwärtige Ion alle bekannten zellulären Prozessen beteiligt. Während globale Ca^{2 +} Antworten Zelle Schicksal beeinträchtigen können, Regeln lokale Variationen in frei Ca^{2 +} cytosolischen Konzentrationen, verbunden zum lösen vom internen Speicher oder einen Zustrom durch Plasmamembran Kanäle, kortikale Zellprozesse. Krankheitserreger, die an oder dringen Host Zellen Trigger eine Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts zugrunde liegenden Host Plasmamembran, die wahrscheinlich sowohl auf globaler als auch auf lokalen Ca^{2 +} Signalisierung betrifft. Da diese Ereignisse bei niedrigen Frequenzen in einer Pseudo-stochastische Weise über erweiterte Kinetik auftreten können, wirft die Analyse von Ca^{2 +} Signale durch Krankheitserreger verursacht große technischen Herausforderungen, die angegangen werden müssen.

Hier berichten wir Protokolle zum Nachweis von globalen und lokalen Ca^{2 +} Signale auf eine Shigella Infektion der Epithelzellen. In diesen Protokollen Artefakten verknüpft zu einer längeren Exposition und lichtbedingten verbunden mit der Anregung von Ca^{2 +} fluoreszierende Sonden sind streng kontrollieren die Aufnahmeparameter über definierte Zeiträume während einer Fehlerbehebung Shigella Invasion. Verfahren werden implementiert, um konsequent die Amplitude und Frequenz der globalen cytosolischen Ca^{2 +} Signale analysieren während der ausgedehnten Infektion Kinetik mit der chemischen Sonde Fluo-4.

Einleitung

Ca^{2 +} regelt alle bekannten Zellprozesse, einschließlich Zellskelett Reorganisation, Entzündungsreaktionen und Zelle Tod Wege im Zusammenhang mit Wirt-Pathogen Interaktionen^1,2,3. Unter physiologischen Bedingungen basale cytosolische Ca^{2 +} Konzentrationen sind niedrig, in den Hunderten von nM-Bereich, aber können zu einem vorübergehenden Anstieg nach Agonist Stimulation unterzogen werden. Diese Variationen zeigen oft oszillierende Verhalten durch das Wirken von Pumpen und Kanäle im Plasma und endoplasmatische Retikulum Membranen. Das Muster dieser Schwingungen zeichnet sich durch die Zeit, Dauer und Amplitude der Ca^{2 +} erhöht und wird durch Zellen, die wiederum bestimmte Reaktionen lösen in, was als Ca^{2 +} Code^{4,5 bekannt entschlüsselt} . Eine nachhaltige Steigerung der cytosolischen Ca^{2 +} Konzentration unter pathologischen Bedingungen führen zum Zelltod führt die Permeabilisierung der mitochondrialen Membranen und die Freisetzung von Pro-apoptotische oder nekrotischen Faktoren^{6zugeordnet, 7}.

Shigella, dem Erreger der bazillendysenterie, dringt Epithelzellen durch Einspritzen von Effektoren in Wirtszellen mit einem Typ III-Sekretion System (T3SS)^8,9. Eine Shigella -Invasion von Wirtszellen ist verbunden mit lokalen und globalen Ca^{2 +} Signale ausgelöst durch die T3SS. Für Pore bilden Giftstoffe, die T3SS-Translocon, die fügt in Host Zellmembranen und ist erforderlich für die Injektion von T3SS Effektoren wahrscheinlich ist verantwortlich für die Aktivierung der SPS und der Inosit (1, 4, 5)-Trisphosphate (InsP3)-abhängige Ca^{2 +} lassen Sie los. Die Kombination aus der lokalisierten PLC-Stimulation und die Anhäufung von polymerisierten Aktin an Standorten eines Shigella Invasion führen eine untypisch lang andauernde InsP3-abhängige Ca^{2 +} release¹⁰. Der Typ-III-Effektor IpgD, ein Phosphatidyl 4,5-Bisphosphate (PIP2)-4-Phosphatase, beschränkt die lokalen PIP2, wodurch die Steuerung der Menge der verfügbaren Substrat für SPS, InsP3, generieren, die an die enge des lokalen Ca^{2 +} trägt Antworten bei bakteriellen Invasion Seiten^11,12. Diese lokalen Ca^{2 +} Antworten wahrscheinlich dazu beitragen, die Aktin-Polymerisation bei Shigella Invasion Websites¹⁰. Globalen Ca^{2 +} Antworten, die jedoch auch durch Shigella, ausgelöst werden sind entbehrlich für die bakterielle Invasion Prozess aber auslösen, die Öffnung der Connexin-Hemichannels an der Plasmamembran und die Freisetzung von ATP in der extrazellulären Fach. Freigesetzte ATP Parakrine handeln, stimuliert wiederum Ca^{2 +} oszillierende Reaktionen in den Zellen neben der infizierten Zelle. IpgD ist auch verantwortlich für die Gestaltung der globalen Ca^{2 +} Antworten zu unberechenbar isolierten Reaktionen mit langsamen Dynamik. IpgD führt schließlich, nach einer längeren bakterielle Infektion auf die Hemmung der InsP3-vermittelten Ca^{2 +} Signale. Durch seine Einmischung mit Ca^{2 +} Signalisierung IpgD verzögert eine Ca^{2 +}-abhängigen Calpain Aktivierung führt zu die Demontage der fokale Adhäsion Strukturen und die vorzeitige Ablösung von infizierten Zellen¹³.

Während Ca^{2 +} Signale wichtige Aspekte der Pathogenese beteiligt sind, wirft die Verwendung eines Mikroorganismus eine Reihe von technischen Herausforderungen, die nicht im klassischen Agonist Studien anzutreffen sind. Die Protokolle beschrieben verwenden Sie hier die häufigsten verwendeten fluoreszierenden Ca^{2 +} chemischen Indikator Fluo-4, die wir entwickelt, um lokale Ca^{2 +} Signale während einer Shigella Infektion zu charakterisieren. Schritte für die Erkennung dieser Signale werden erläutert, sowie Verfahren für die Quantitative Analyse, die erforderlich sind, um die Rolle der bakteriellen Effektoren in Ca^{2 +} Signalisierung zu charakterisieren.

Protokoll

1. Vorbereitungen

1. Bakterien-Vorbereitung
   1. Platte die Bakterien –Shigella Wildtyp Stamm mit dem Ausdruck der AfaE adhäsin (M90T-AfaE) – auf einem Trypticase Soja (TCS) Agar Platte mit 0,01 % Kongo-rot (CR) und inkubieren sie 18 h bei 37 ° C.
      Hinweis: Um ihre Reproduzierbarkeit zu erhöhen, die Shigella -Platten in Schritt 1.1.1 erhaltenen bei 4 ° C gelagert werden und sollte innerhalb einer Woche verwendet werden, da alle Kolonien auf CR-Medium im Laufe der Zeit schließlich rot angezeigt werden.
   2. TCS Pre bouillonkultur durch Abnehmen 3 rote Kolonien von den Streifen Platten zu impfen.
      Hinweis: Eine Impfung mit 3 Kolonien wird durchgeführt, um begrenzen die Wahrscheinlichkeit der Kommissionierung eines einzigen Klons, deren Virulenz Plasmid eine genetische Rekombination unterzogen wurde.
   3. Flüssige Bakterienkulturen in einem schütteln Inkubator für 16 h bei 37 ° C bei 200 u/min zu wachsen. Fügen Sie Ampicillin auf eine Endkonzentration von 75 mg/mL. Antibiotika-Konzentrationen sollte 3 x der minimalen inhibitorischen Konzentration nicht überschreiten, da ein Übermaß an Antibiotikum zum Verlust des großen Virulenz Plasmids führen kann.
      Hinweis: Die Wartung des Plasmids Shigella Virulenz sollte überprüft werden, durch Ausplattieren der Bakterienkulturen auf CR-Platten mit geeigneten Antibiotika-Konzentrationen ergänzt. Das Vorhandensein von weißen Kolonien zeigt Plasmid Verlust.
   4. Die TCS-Kultur mit der bakteriellen Vorkultur bei einer Verdünnung von 1: 100 zu impfen. Inkubieren Sie es bei 37 ° C in einem schütteln Inkubator für 2 h bei 200 u/min. Sicherstellen, dass die Extinktion bei 600 nm (OD_600nm) ist 0,2 - 0,4.
   5. Zentrifugieren Sie die Bakterienkultur für 2 min bei 13.000 x g bei 21 ° C und Aufschwemmen das Pellet in gleichwertigem Umfang der EM Medium (120 mM NaCl, KCl 7 mM, 1,8 mM CaCl₂, 0,8 mM MgCl₂, 5 mM Glukose und 25 mM HEPES pH = 7,3).
   6. Verdünnen Sie der Bakteriensuspension in einem EM-Puffer auf eine endgültige OD_600nm 0,1 und sofort einsetzen Sie oder bei 21 ° C lagern Sie und verwenden Sie es innerhalb der nächsten 60 Minuten.
2. Handy-Vorbereitung
   1. Kultur-HeLa-Zellen in DMEM mit 1 g/L Glukose mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS) ergänzt und bei 37 ° C mit 10 % CO₂zu wachsen. Wachsen Sie TC-7 gewachsen in DMEM mit 4,5 g/L Glukose, mit 10 % FCS und nicht-essentiellen Aminosäuren in einem 37 ° C Inkubator mit 10 % CO₂.
   2. Für Zelle verknüpft Wartung, teilen Sie die Zellen regelmäßig um eine Hemmung des Wachstums Kontakt zu vermeiden, konfluierende Staaten; Dies ist entscheidend für eine hohe Ca^{2 +} Sonde laden/Transfection Leistungsfähigkeit.
   3. HeLa-Zellen auf sterile 25-mm-Durchmesser kreisförmige Deckgläsern in 6-Well-Platten bei einer Dichte von 3 x 10⁵ Zellen/gut am Vortag das Experiment für die HeLa-Zellen-Platte.
   4. Für TC-7 Zellen trypsinize und Zellen zu zählen. Säen sie an 4 x 10⁵ Zellen/Brunnen und inkubieren sie 5-7 Tage bei 37 ° C in einer 10 % CO₂-Inkubator vor den versuchen, um eine Polarisierung zu ermöglichen.
      1. Aktualisieren Sie das Zellkulturmedium jeden Tag bis zum Tag des Experiments.
         Hinweis: Glasboden 35 mm Durchmesser Einweg-Kammern können auch als Alternative zu den Deckgläsern-haltigen Brunnen verwendet werden. Wenn letztere verwendet, Temperaturregelung durch einen beheizten Objekttisch oder Ziel nicht ausreichend ist und eine Thermostat Inkubation Kammer montiert auf ist der Mikroskoptisch erforderlich.
3. Am Tag des Experiments, das Medium zu entfernen und waschen Sie die Zellen 3 X mit 1 mL EM Medium bei 21 ° C.
4. Wägezellen Sie die mit 3 mM Fluo-4-AM¹⁴ in einem EM-Puffer für 30 min bei 21 ° C.
   Hinweis: Während das Laden der Sub konfluierende HeLa-Zellen keine große Probleme aufwirft, ist die Belastung des polarisierten TC-7 Zellen oft heterogenen und schlecht effizient. Für diese Zellen fanden wir, dass die laden-Effizienz durch die Zugabe von dem Dispergiermittel verstärkt wird – Pluronic Säure – auf eine Endkonzentration von 0,1 % und der Anionen-Transporter-Inhibitor Bromosulfophtalein auf eine Endkonzentration von 20 µM, die Fluo-4-Uhr-haltigen EM. Die Verwendung von chemischen ratiometrischen Sonden oder genetisch codiert-FRET Sonden, die erfordern Dual-Erwerb nicht kompatibel mit der Geschwindigkeit des Erwerbs für die Darstellung der lokalen Ca^{2 +} Antworten erforderlich ist.
5. Waschen Sie die Proben 3 X mit EM Puffern und inkubieren sie weiter in 1 mL EM Puffer bei 21 ° C für die Hydrolyse von AM Glyko-ermöglichen. Verwendung Fluo-4 geladen Zellen sofort oder innerhalb der nächsten 90 min (gepflegt bei 21 ° C).

(2) Infektion und Bildaufnahme der lokalen Ca^{2 +} Antworten

1. Ort das Deckglas mit Fluo-4 geladen Zellen in einer bildgebenden Kammer oder Glas-untere Kammer. Waschen Sie die Proben in der bildgebenden Kammer oder Glasboden Einweg Kammer 3 X mit EM Puffer, Verbindungen, die möglicherweise durch Lyse der Zelle zu entfernen. Fügen Sie 1 mL EM-Puffer.
2. Legen Sie die Kammer auf einer invertierten Fluoreszenz-Mikroskop-Bühne bei 33 ° c erwärmt
   Hinweis: Diese Temperatur ist als Kompromiss zwischen den optimalen Temperaturen kompatibel mit dem Shigella -Invasion-Prozess und die Verlangsamung des Ca^{2 +} Antworten ausgewählt, um lokale Lösungen zu visualisieren. Wir verwenden eine 63 X eintauchen Öl Ziel (NA = 1,25) mit Phase Kontrast Ringen ausgestattet.
3. Wählen Sie ein Feld der Mikroskopie und richten Sie Aufnahmeparameter, einschließlich der Belichtungszeit und binning, falls erforderlich, um das Fluoreszenzsignal Fluo-4 zu optimieren.
   Hinweis: Die großen Herausforderungen der lokalen Ca^{2 +} Bildgebung sind niedrige Amplitude und die kleinen Dauer der Antworten, erfordert den Erwerb mindestens alle 30 ms mehrere handelsübliche Rückseite beleuchtet EM-CCD- oder C-MOS Kameras präsentieren die erforderlichen Sensibilität zu lokalen Ca^{2 +} Antworten mit Fluo-4 zu erkennen. Empfindlichkeit ist auch ein wichtiges Thema, lichtbedingten oder Artefakte wie spontane Reaktionen verknüpft die fluoreszierenden Anregung der Fluo-4 mit einer hohen Frequenz zu begrenzen. Hier, eine LED-basierte Beleuchtung von 470 nm, mit einem 480 ± 40 nm Anregung Bandpaßfilter, 505 nm dichroitische Filter und eine 527 ± 30 nm Bandpass-Emission bei 5 % seiner maximalen Intensität kombiniert mit einem 1,0 Graufilter verwendet wurden verwendet, um diese Probleme zu minimieren unter dem Strahl des Übernahmen von begrenzter Dauer. Eine Analyse der lokalen Ca^{2 +} Signale von Chargen von 120 s-Streams wurde routinemäßig durchgeführt. Unter diesen Bedingungen geringer Beleuchtung wurde Fluorophor Immunofluoreszenz während 2 min-Stream Akquisitionen nicht beobachtet. Aufeinander folgende Akquisitionen an derselben Probe können durchgeführt werden, sofern verschiedene Felder verwendet werden. Als in der Regel erfolgt ein erste Akquisition Stream ein Kontrollfeld in der Abwesenheit von Bakterien Stimulation auf das Fehlen der spontanen Antworten zu gewährleisten. Wenn spontane Reaktionen beobachtet werden, werden die Proben mit EM-Puffer gewaschen, bis keine Reaktionen beobachtet werden.
4. Um Bakterien zum Beispiel hinzuzufügen, entfernen Sie 500 µL Puffer EM aus der Kammer zu, und fügen Sie 500 µL Bakteriensuspension, die in Schritt 1.1.6 vorbereitet, um eine endgültige OD_600nm von 0,05, mit der gebotenen Sorgfalt zu vermeiden, Verschieben der ausgewählten Mikroskopie-Bereich zu erhalten; die Bände sorgen für eine richtige Mischung von Bakterien und eine homogene Verteilung der Bakterien auf die Zellproben.
5. Führen Sie eine Übernahme auf die bakterielle Zugabe. Alternativ führen Sie eine Akquisition 10 min nach dem bakteriellen hinzufügen, das entspricht der zeitliche Aufwand für Bakterien zu sedimentieren auf Zellen unter Bedingungen verwendet. Am Ende des Datenstroms Erwerb erwerben Sie ein Phasenkontrast-Bild des ausgewählten Feldes, die Bakterien, die Kontaktaufnahme mit den Zellen und die Membran Rüschen bakteriellen Invasion Websites zugeordnet zu visualisieren.
6. Wiederholen der Erwerb wie in Schritt 2.5, in Abständen, die für die Dauer der Bild Akquisitionen, Dateien Einsparungen und Auswahl eines neuen Felds zur Deckung des gesamten Prozesses zugänglich sind.
   Hinweis: Für Shigellafanden wir, dass Erwerb streamt alle 5 min für 20 min, nach der 10 min bakterielle Sedimentation, erlaubt, den Großteil der Invasion Veranstaltungen zu decken.
7. Fügen Sie am Ende des Verfahrens Übernahme eine Endkonzentration von 2 µM der Ca^{2 +} Ionophore Ionomycin Proben zu bestimmen, die maximale Amplitude der Ca^{2 +} -Signale. Abrufen von Bildern jedes 3-5 s bis Signal Stabilisierung, in der Regel für weniger als 10 Minuten.
8. Folgen Sie durch Hinzufügen von Ca^{2 +} Chelator EGTA an eine Endkonzentration von 10 mM bis das Fluoreszenzsignal bei fehlender Ca^{2 +}zu bestimmen. Abrufen von Bildern jedes 3-5 s bis Signal Stabilisierung, in der Regel für weniger als 10 Minuten.
   Hinweis: Wegen der relativ langsame Dynamik der globalen Ca^{2 +} Variationen führen Sie diese übernahmen alle 3-5 s (nicht im Streaming-Modus), zulassend Ca^{2 +} imaging auf einem mikroskopischen Feld während der aufeinanderfolgenden Behandlungen.

3. Analyse

1. Express cytosolischen Ca^{2 +} Variationen im Laufe der Zeit als der Prozentsatz der ΔF/F₀, wo ΔF die Veränderung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität der Region of Interest (ROI stellt) und F₀ die Grundlinie Fluoreszenz im gleichen ROI, zu dem ein nicht relevante Region des Feldes frei von Zellen wird abgezogen.
   1. Entfernen Sie die basalen Fluoreszenz-Ebenen für jede Zelle in verschiedenen Bereichen, Ausgangswert entspricht; Diese Ebenen eindeutig ermittelt werden, aufgrund der niedrigen Frequenz und relativ kurze Dauer der lokalen Ca^{2 +} Antworten in einer angegebenen Stream-Akquisition.
      Hinweis: Quantifizieren Sie auffälligsten Merkmale der Antworten in Bezug auf die gestellten Fragen und die pathogenen Modell untersucht. Klassischerweise werden verschiedene Parameter berücksichtigt, Ca^{2 +} Signale, einschließlich der Häufigkeit der Zellen mit lokalen oder globalen Ca^{2 +} Antworten, sowie die Dauer, Amplitude und Frequenz dieser Antworten zu analysieren. Im Falle von Shigella und lokale Reaktionen ist ein weiterer wichtiger Aspekt der Analyse die räumliche Vereinigung der Antworten mit bakteriellen Invasion Websites.
2. Zur Quantifizierung des Anteil der reagieren Zellen zeigen globale oder lokale Reaktionen zeichnen ROIs in Zellen, in Zeitreihen, die Variationen der Fluo-4 Intensität entspricht.
   1. Stellen Sie strenge Parameter, lokale Ca^{2 +} Antworten, z. B. eine Amplitude von dreifache oben Hintergrund Variationen der durchschnittliche Fluoreszenz Intensität Zelle Baseline oder einer Dauer von mindestens 200 ms, zu identifizieren, um zu vermeiden, erzielte einen Fehlalarm.
      Hinweis: Als Faustregel, auch kleine lokale Ca^{2 +} Antworten von unterschieden werden störende Hintergrundgeräusche durch ihr Profil. ROIs sollte groß genug, um genügend Fluoreszenz-Signale, um die Erkennung von lokalen Variationen ermöglichen zu integrieren. Je nach Intensität der Fluo-4-Erkennung können diese ROIs Kreise mit Durchmessern von 2-5 mM entsprechen.
   2. Messen Sie die Variationen der durchschnittliche Fluo-4 Fluoreszenzintensität in 2 Regionen in einem eigenständigen Bereich der gleichen Zelle, um festzustellen, ob die Antworten lokal oder global sind.
      Hinweis: Die Analyse einer großen Anzahl von Zellen wird durch den Einsatz von imaging-Software ermöglicht die Online-Bildschirmanzeige der Variationen der durchschnittliche Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit für die ausgewählten Regionen erleichtert. Handelsüblicher imaging-Software hat eine solche Option, aber dies kann auch mit der Icy Freeware, mit dem ROI Intensität Evolution Plugin durchgeführt werden.
   3. Bestimmen Sie den Anteil der Zellen zeigt lokale Reaktionen.
      Hinweis: Dieser Prozentsatz errechnet sich aus der Gesamtzahl der Zellen im Bereich Mikroskopie, die in ausreichender Zahl zur Unterstützung sollte analysiert eine statistisch Bedeutung mit einem nicht-parametrischen Test.
   4. Bestimmen Sie die Dauer der lokalen Reaktionen.
      Hinweis: Lokale Ca^{2 +} Antworten weiter unterschieden werden nach ihrer Dauer reicht (d.h. weniger als 500 ms, zwischen 5 und 10 s oder über 10 s) und ihrer Verbindung mit Shigella Invasion Websites.
3. Die Amplitude der Antworten zu quantifizieren. Erstens kalibrieren Sie die maximalen Ca^{2 +} und Zelle Hintergrundwerten ermittelt wie in Schritt 2.1.7. Da die Fluo-4 Last für jede Zelle variieren kann, führen Sie diese Bestimmungen für einzelne Zellen im Feld.
   1. Drücken Sie die Amplitude der Antworten als relative Prozentsatz der maximalen Antwort.
   2. Durchzuführen Sie statistische Tests mit einem Normalität Test, gefolgt von einem parametrischen Test Potentialdifferenzen in der Amplitude der Reaktionen zwischen Proben analysieren.
   3. Bestimmen der Verein dieser Antworten Bezug zu der bakteriellen Invasion Websites durch ihre jeweiligen Lokalisation, die bakteriell bedingte Membran-Rüschen in der entsprechenden Phase kontrastreiche Bilder visualisiert.

Ergebnisse

Shigella Invasion ist atypisch lang anhaltende lokale Ca^{2 +} Antworten zugeordnet:

Nach dem oben genannten Protokoll Fluo-4 geladen HeLa-Zellen wurden mit WT Shigella herausgefordert und Stream Akquisitionen wurden durchgeführt, um Ca^{2 +} Signale analysieren. Abbildung 1zeigt eine repräsentative Experiment mit Zeitraffer-Bilder-Serie von der Fluoreszenzintensitä...

Diskussion

Dieses Manuskript beschreibt das Protokoll, das wir entwickelt, um lokale Ca^{2 +} Signale während der relativ kurzen Kinetik einer Shigella -Invasion, sowie globale Ca^{2 +} Antworten während der erweiterten Kinetik von Shigellazu folgen. Im folgenden Signale Schlüssel finden Sie Themen, die angesprochen werden, um die Erkennung von Ca^{2 +} optimieren müssen bei gleichzeitiger Minimierung der Interferenzen mit der biologischen Prozesse.

Chemischen <...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph version 7.7	Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2	Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high	IBIDI	81156
Trypticase Soy (TCS) broth	Thermofisher		B11768
TCS agar	Thermofisher		B11043
Congo red	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017	isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin