Imágenes de Ca2 + respuestas durante la infección de Shigella de células epiteliales

Resumen

Aquí, presentamos protocolos para visualizar las respuestas de calcio (Ca^{2 +}) provocadas por las células HeLa infectadas por Shigella. Optimización de los parámetros de infección bacteriana y la proyección de imagen con sondas fluorescentes de Ca^{2 +} , se caracterizan atípicos globales y locales Ca^{2 +} señales inducidas por bacterias sobre una amplia gama de cinética de la infección.

Resumen

CA^{2 +} es un ion omnipresente en todos los procesos celulares conocidos. Aunque global Ca^{2 +} respuestas pueden afectar el destino de la célula, variaciones locales en libre Ca^{2 +} citosólicas concentraciones, ligadas a la liberación de tiendas interiores o un flujo a través de canales de la membrana plasmática, regulan procesos celulares corticales. Patógenos se adhieren a o invadir el huésped células gatillo una reorganización del citoesqueleto de actina subyacente a la membrana plasmática de host, que probablemente afecta a nivel global y local de Ca^{2 +} señalización. Porque estos eventos pueden ocurrir en frecuencias bajas de manera pseudo-estocástica sobre cinética extendida, el análisis de Ca^{2 +} señales inducidas por patógenos plantea importantes desafíos técnicos que deben abordarse.

Aquí, Divulgamos los protocolos para la detección de Ca^{2 +} señales globales y locales en una Shigella infección de células epiteliales. En estos protocolos, artefactos vinculados a una exposición prolongada y fotoenvejecimiento asociado con la excitación de Ca^{2 +} fluorescentes puntas de prueba se removio controlando estrictamente los parámetros de adquisición durante períodos de tiempo definidos durante un Shigella invasión. Procedimientos se implementan para analizar rigurosamente la amplitud y la frecuencia de Ca^{2 +} señales citosólicas globales durante la cinética de la infección extendida usando la sonda química Fluo-4.

Introducción

CA^{2 +} regula todos los procesos de células conocidas, incluyendo la reorganización del citoesqueleto, las respuestas inflamatorias y vías de muerte celular relacionadas con las interacciones huésped-patógeno^1,2,3. En condiciones fisiológicas, basal Ca^{2 +} las concentraciones citosólicas son bajas, en los cientos de rango nM, pero pueden ser sometidas a aumentos transitorios sobre el estímulo del agonista. Estas variaciones demuestran a menudo comportamiento oscilatorio a través de la acción de las bombas y canales en las membranas del retículo endoplásmico y plasma. El patrón de estas oscilaciones se caracteriza por el período de duración y amplitud de Ca^{2 +} aumenta y es desencriptado por las células que, a su vez, desencadenan respuestas específicas en lo que se conoce como el Ca^{2 +} código^4,5 . Un aumento sostenido en la citosólica Ca^{2 +} concentración en condiciones patológicas puede conducir a la muerte celular asociada a la permeabilización de las membranas mitocondriales y la liberación de pro-apoptóticos o necróticos factores^{6, 7}.

Shigella, el agente causal de la disentería bacilar, invade las células epiteliales mediante la inyección de efectores en las células del huésped utilizando un tipo III secreción sistema (T3SS)^8,9. Una invasión de Shigella de las células huésped se asocia a locales y globales Ca^{2 +} señales sacadas por el T3SS. En cuanto a la formación de poro las toxinas, el translocon T3SS que inserta en las membranas de la célula huésped y es necesario para la inyección de T3SS efectores es probable responsable de la activación de PLC y el trifosfato de inositol (1, 4, 5) (InsP3)-dependiente de Ca^{2 +} lanzamiento. La combinación de la estimulación localizada del PLC y la acumulación de actina polimerizada en los sitios de un resultado de la invasión de Shigella en una anormalmente larga duración InsP3 dependiente de Ca^{2 +} liberación¹⁰. Tipo III generador de efectos IpgD, una fosfatidil 4,5 bifosfato (PIP2) -4-fosfatasa, limita la cantidad local de PIP2, controlando así la cantidad de sustrato disponible para el PLC generar InsP3, que contribuye a la reclusión de local Ca^{2 +} respuestas en los sitios de invasión bacteriana^11,12. Estos Ca^{2 +} respuestas locales probablemente contribuyen a la polimerización de la actina en la invasión de Shigella sitios¹⁰. Ca^{2 +} respuestas globales que también son sacadas por Shigella, sin embargo, son prescindibles para el proceso de invasión bacteriana sino desencadenar la apertura de connexin hemichannels en la membrana plasmática y la liberación de ATP en el medio extracelular compartimiento. Lanzado ATP actúan de manera paracrina, a su vez, estimula la Ca^{2 +} oscilatorias respuestas en las células al lado de la célula infectada. También es responsable de formar global Ca^{2 +} respuestas erráticas respuestas aisladas con dinámica lenta IpgD. Finalmente, a una infección bacteriana prolongada, IpgD lleva a la inhibición de señales de InsP3 mediada por Ca^{2 +} . A través de su interferencia con la Ca^{2 +} señalización IpgD retrasa un Ca^{2 +}-activación de calpaínas dependiente hacia el desmontaje de estructuras de adhesión focal y la separación prematura de infectado las células¹³.

Mientras que el Ca^{2 +} señales están implicadas en aspectos críticos de la patogénesis, el uso de un microorganismo plantea una serie de desafíos técnicos que no se encuentran en estudios clásicos agonista. Los protocolos descritos aquí usan el utilizados fluorescente Ca^{2 +} químico indicador Fluo-4 que hemos diseñados para caracterizar señales de Ca^{2 +} locales durante una infección por Shigella . Pasos críticos para la detección de estas señales se discuten, así como procedimientos para su análisis cuantitativo que es necesaria para caracterizar el papel de efectores bacterianas en la señalización de Ca^{2 +} .

Protocolo

1. preparaciones

1. Preparación de bacterias
   1. Las bacterias de la placa: cepa de tipo salvaje deShigella expresando la adhesina de AfaE (M90T-AfaE) — en un tripticasa agar de soja (TCS) placa que contiene 0.01% Congo rojo (CR) e incubar de 18 h a 37 ° C.
      Nota: Para aumentar su reproducibilidad, las placas de Shigella obtenidas en el paso 1.1.1 se almacenan a 4 ° C y deben ser usadas dentro de una semana, porque todas las colonias en medio de CR se pondrá rojas eventualmente con el tiempo.
   2. Inocular el TCS caldo de cultivo previo escogiendo 3 colonias rojo de las placas de la raya.
      Nota: Se realiza una inoculación con 3 colonias para limitar la probabilidad de escoger una sola copia cuyo plásmido de virulencia ha sufrido una recombinación genética.
   3. Crecen cultivos bacterianos líquidos en un incubador de agitación por 16 h a 37 ° C a 200 rpm. Añadir ampicilina a una concentración final de 75 mg/mL. Las concentraciones de antibióticas no deben exceder 3 x la concentración inhibitoria mínima, como un exceso de antibiótico puede llevar a la pérdida del plásmido de virulencia grande.
      Nota: El mantenimiento del plásmido de virulencia de Shigella debe verificarse por los cultivos bacterianos sobre placas CR suplementados con concentraciones adecuadas del antibióticas de la galjanoplastia. La presencia de colonias blancas indica pérdida de plásmidos.
   4. Inocular el cultivo TCS con el cultivo bacteriano previo a la dilución 1: 100. Incubar a 37 ° C en un incubador de agitación durante 2 horas a 200 rpm. Asegúrese de que la densidad óptica a 600 nm (OD_{600 nm}) es de 0.2 - 0.4.
   5. Centrifugar el cultivo bacteriano por 2 min a 13.000 x g a 21 ° C y resuspender el precipitado en un volumen equivalente de EM medio (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0.8 mM MgCl₂, 5 mM de glucosa y 25 mM HEPES pH = 7.3).
   6. Diluir la suspensión bacteriana en un búfer de EM en un final de OD_{600 nm} de 0,1 y usarlo inmediatamente o guarde a 21 ° C y usar dentro de los próximos 60 minutos.
2. Preparación de la célula
   1. Las células HeLa cultura en DMEM con 1 g/L de glucosa suplementado con 10% de suero fetal de ternero (FCS) y crecen a 37 ° C con 10% CO₂. Crecer TC-7 cultivadas en DMEM con 4,5 g/L de glucosa, que contiene 10% de FCS y aminoácidos no esenciales en una incubadora de 37 ° C que contenga 10% CO₂.
   2. Para el mantenimiento celular, dividir las celdas con regularidad para evitar una inhibición de crecimiento contacto vinculada a Estados confluentes; Esto es crítico para una Ca^{2 +} sonda carga/transfección eficacia alta.
   3. Placa de células HeLa en cubreobjetos circulares estériles de 25 mm de diámetro en las placas de 6 pozos a una densidad de 3 x 10⁵ células/pozo el día antes del experimento de las células HeLa.
   4. Las células TC-7, trypsinize y contar las células. Semilla en 4 x 10⁵ células/pozo e incúbelos a 37 ° C en un 10% de CO₂de 5-7 días-incubadora antes los experimentos para permitir una polarización.
      1. Actualizar el medio de cultivo celular todos los días hasta el día del experimento.
         Nota: Cámaras desechables de 35 mm de diámetro de fondo de cristal pueden usarse como alternativa a los pocillos que contienen el cubreobjetos. Si esta última se utiliza, control de temperatura a través de una platina calefactada u objetivo no es suficiente, y una cámara de incubación termostato montado en la platina del microscopio es necesaria.
3. El día del experimento, quitarlo del medio y lavar las células 3 x medio de 1 mL EM a 21 ° C.
4. Carga las células con 3 mM Fluo-4-AM¹⁴ en un búfer de EM durante 30 min a 21 ° C.
   Nota: Mientras que la carga de células HeLa el confluentes no plantea grandes problemas, la carga de polarizado células TC-7 suele ser heterogénea y poco eficiente. Para estas células, se encontró que la adición del agente dispersante es aumentar la eficiencia de carga: pluronic ácido — a una concentración final de 0.1% y el transportador de aniones inhibidores bromosulfophtalein en una concentración final de 20 μm a las EM de fluo-4-AM-que contiene. El uso de químico radiométrica sondas o codificado-FRET genéticamente sondas que requieren adquisición de doble no es compatible con la velocidad de adquisición necesario para la proyección de imagen de locales Ca^{2 +} respuestas.
5. Lavar las muestras 3 x con EM tampón y además les Incube en 1 mL de tampón de EM a 21 ° C para permitir que la hidrólisis de la molécula de AM. Uso Fluo-4 cargado células inmediatamente o en el siguiente minuto 90 (mantenida a 21 ° C).

2. infección y adquisición de imagen de locales Ca^{2 +} respuestas

1. Coloque el cubreobjetos que contiene las células Fluo-4 cargado en una proyección de imagen de cámara o cámara de fondo de cristal. Lavar las muestras en la sala de proyección de imagen o desechables de fondo de cristal de cámara x 3 con tampón de EM para separar compuestos potencialmente resultante de la lisis celular. Añadir 1 mL de tampón de EM.
2. Coloque la cámara en un escenario de microscopio de fluorescencia invertido calentado a 33 º C.
   Nota: Esta temperatura es seleccionada como un compromiso entre la temperatura óptima compatible con el proceso de invasión de Shigella y la disminución de Ca^{2 +} las respuestas para visualizar respuestas locales. Utilizamos un 63 X objetivo de aceite de inmersión (NA = 1.25) equipado con anillos de contraste de fase.
3. Seleccione el campo de la microscopía y configurar los parámetros de adquisición, incluyendo el tiempo de exposición y binning si es necesario, para optimizar la señal fluorescente Fluo-4.
   Nota: Los principales desafíos de local Ca^{2 +} proyección de imagen son la amplitud baja y la pequeña duración de las respuestas, que requieren la adquisición de por lo menos cada 30 ms. EM-CCD o CMOS retroiluminado disponibles comercialmente varios de la cámaras presente la necesaria sensibilidad para detectar locales Ca^{2 +} respuestas utilizando Fluo-4. Sensibilidad de detección es también un tema importante para limitar el fotoenvejecimiento o artefactos como respuesta espontánea ligada a la excitación fluorescente de Fluo-4 en una frecuencia alta. Aquí, una iluminación basada en LED de 470 nm, con un filtro de excitación de 480 ± 40 nm band-pass, un filtro dicroico de 505 nm y un 527 ± 30 nm paso banda de emisiones en 5% de su máxima intensidad combinado con un filtro de densidad neutra 1,0 fueron utilizados para reducir al mínimo estos problemas bajo un chorro de adquisiciones de duración limitada. Habitualmente se realiza un análisis de Ca^{2 +} señales locales por lotes de los arroyos s 120. En estas condiciones de baja iluminación, photobleaching fluoróforo no se observó durante las adquisiciones flujo min 2. Adquisiciones sucesivas sobre la misma muestra se pueden realizar, siempre y cuando se utilizan diferentes campos. Como regla general, una primera secuencia de adquisición se realiza en un campo de control en ausencia de estimulación de bacterias para asegurar la ausencia de respuestas espontáneas. Si se observan las respuestas espontáneas, las muestras se lavan con buffer EM hasta que no hay respuestas se observan.
4. Para agregar las bacterias en la muestra, retire 500 μl de tampón de EM de la cámara y agregar 500 μl de la suspensión bacteriana preparada en el paso 1.1.6 para obtener un final OD_{600 nm} de 0.05, con el cuidado adecuado para evitar mover el campo seleccionado de la microscopia; los volúmenes de aseguran una mezcla adecuada de las bacterias y una distribución homogénea de las bacterias en las muestras de células.
5. Llevar a cabo una adquisición a la adición de bacteria. Como alternativa, realizar una adquisición 10 min después de la adición de bacteria, que se corresponde con el tiempo necesario para las bacterias al sedimento en las células bajo las condiciones. Al final de la secuencia de adquisición, adquirir una imagen de contraste de fase del campo seleccionado para visualizar la bacteria en contacto con las células y los volantes de membrana asociados a sitios de invasión bacteriana.
6. Repita el procedimiento de adquisición como en el paso 2.5, a intervalos que son susceptibles a la duración de la adquisición de imagen, ahorro de archivos y selección de un nuevo campo para cubrir todo el proceso.
   Nota: Para Shigella, encontramos que la adquisición de secuencias cada 5 min por 20 min, después de la sedimentación bacteriana de 10 minutos, permitida cubrir la mayoría de los acontecimientos de la invasión.
7. Al final del procedimiento de adquisición, añadir una concentración final de 2 μm de las Ca^{2 +} ionóforo ionomycin muestras para determinar la amplitud máxima de las señales de Ca^{2 +} . Adquirir imágenes cada 3-5 s hasta estabilización de la señal, generalmente de menos de 10 minutos.
8. Seguir añadiendo una concentración final de 10 mM para determinar la señal de fluorescencia en ausencia de Ca^{2 +}Ca^{2 +} quelante EGTA. Adquirir imágenes cada 3-5 s hasta estabilización de la señal, generalmente de menos de 10 minutos.
   Nota: Debido a la dinámica relativamente lenta de las global Ca^{2 +} variaciones, realizar estas adquisiciones cada 3-5 s (no en modo streaming), permitiendo para el Ca^{2 +} la proyección de imagen en el mismo campo microscópico durante los tratamientos sucesivos.

3. Análisis

1. Expresar variaciones de Ca^{2 +} citosólicas en el tiempo como el porcentaje de ΔF/F₀, donde ΔF representa la variación de la intensidad de fluorescencia media de la región de interés (ROI) y F₀ la fluorescencia basal en el mismo ROI, a la que un región no relevantes del campo desprovisto de células se resta.
   1. Eliminar los niveles de fluorescencia basal de cada célula en diferentes campos, correspondientes a los niveles de línea base; Estos niveles se pueden determinar sin ambigüedades debido a la baja frecuencia y relativamente corta duración de local Ca^{2 +} respuestas en la adquisición de una secuencia dada.
      Nota: Cuantificar características llamativas de las respuestas relacionadas con las preguntas y el modelo patógeno estudiados. Clásico, varios parámetros se tienen en cuenta para analizar el Ca^{2 +} señales, incluyendo la frecuencia de células que tengan locales o globales Ca^{2 +} las respuestas, así como la duración, amplitud y frecuencia de estas respuestas. En el caso de Shigella y respuestas locales, otro aspecto importante del análisis es la Asociación espacial de las respuestas con los sitios de invasión bacteriana.
2. Para cuantificar el porcentaje de células sensibles mostrando respuestas globales o locales, dibujar ROIs en células, en series de tiempo correspondiente a las variaciones de intensidad de Fluo-4.
   1. Establecer parámetros estrictos para identificar locales Ca^{2 +} respuestas, como una amplitud de tres variaciones de fondo arriba de la línea de base de celular de intensidad de fluorescencia media y una duración de al menos 200 ms, para evitar marcar un falso positivo.
      Nota: Como regla general, incluso los pequeños locales Ca^{2 +} respuestas pueden distinguirse de cualquier ruido de fondo por su perfil. El ROI debe ser lo bastante grande como para integrar suficientes señales de fluorescencia para la detección de variaciones locales. Dependiendo de la intensidad de la detección de Fluo-4, estos ROIs pueden corresponder a los círculos con diámetros desde 2-5 mM.
   2. Medir las variaciones de la intensidad media de fluorescencia de Fluo-4 en 2 regiones en una zona distinta de la misma célula, para determinar si las respuestas son locales o globales.
      Nota: El análisis de un gran número de células es facilitado por el uso de software que permite la visualización en pantalla en línea de las variaciones de la intensidad de fluorescencia media en el tiempo para las regiones seleccionadas de imágenes. Software de proyección de imagen disponible en el mercado tiene esa opción, pero esto también se puede realizar usando el freeware de Icy , usando el plugin de Evolución de intensidad de ROI .
   3. Determinar el porcentaje de células que muestran respuestas locales.
      Nota: Este porcentaje se calcula a partir del número total de células analizadas en el campo de la microscopía, que debe ser en número suficiente para apoyar una significación estadísticamente mediante una prueba no paramétrica.
   4. Determinar la duración de las respuestas locales.
      Nota: Local de Ca^{2 +} las respuestas pueden distinguirse más lejos según sus rangos de duración (es decir, menos de 500 ms, entre 5 y 10 s, o superiores a 10 s) y su asociación con los sitios de invasión de Shigella .
3. Cuantificar la amplitud de las respuestas. En primer lugar, calibrar las máxima Ca^{2 +} y la célula niveles de fondo determinados como en el paso 2.1.7. Puesto que la carga de Fluo-4 puede variar para cada celda, realizar estas determinaciones para las células individuales en el campo.
   1. Expresa la amplitud de las respuestas como un porcentaje relativo de la respuesta máxima.
   2. Realizar las pruebas estadísticas utilizando una prueba de normalidad, seguida por una prueba paramétrica para analizar posibles diferencias en la amplitud de las respuestas entre las muestras.
   3. Determinar la Asociación de estas respuestas en relación con los sitios de invasión bacteriana por su respectiva localización en las membrana bacteriana inducida por de volantes visualizados en las correspondientes imágenes de contraste de fase.

Resultados

Invasión de Shigella se asocia con anormal duradero Ca^{2 +} respuestas locales:

Siguiendo el protocolo mencionado anteriormente, las células HeLa Fluo-4-cargado se desafiaron con WT Shigella y se realizaron adquisiciones de secuencia para analizar señales de Ca^{2 +} . En figura 1, se muestra un experimento representativo con serie de Time-lapse de imágenes de la ...

Discusión

Este manuscrito describe el protocolo que hemos diseñados para seguir Ca^{2 +} señales locales durante las cinéticas relativamente corto de una invasión de Shigella , así como Ca^{2 +} respuestas globales durante la cinética extendida de Shigella. A continuación, clave se encuentran cuestiones que deben abordarse para optimizar la detección de Ca^{2 +} señales y reducir al mínimo cualquier interferencia con los procesos biológicos.

Química

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph version 7.7	Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2	Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high	IBIDI	81156
Trypticase Soy (TCS) broth	Thermofisher		B11768
TCS agar	Thermofisher		B11043
Congo red	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017	isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin