הדמיה Ca2 + תגובות במהלך זיהום שיגלה תאי אפיתל

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להמחיש תגובות סידן (Ca^{2 +}) שהפיק הלה תאים נגועים על ידי שיגלה. על ידי אופטימיזציה של הפרמטרים של זיהום חיידקי, הדמיה עם Ca^{2 +} רגשים פלורסנט, מאופיינים טיפוסיות גלובאליים ומקומיים Ca^{2 +} אותות הנגרמת על ידי חיידקים על פני מגוון רחב של קינטיקה זיהום.

Abstract

Ca^{2 +} הוא יון נמצא בכל מקום המעורבים בתהליכים כל הסלולר מוכרות. בעוד Ca העולמית^{2 +} תגובות עשוי להשפיע על גורל, וריאציות מקומיות בריכוזים חינם Ca^{2 +} cytosolic, מקושר לשחרר מן החנויות פנימי או זרם דרך קרום פלזמה ערוצים, לווסת תהליכים סלולרי קורטיקלית. פתוגנים לדבוק או לפלוש מארח תאי מפעיל ארגון מחדש של שלד התא אקטין שבבסיס קרום פלזמה המארח, אשר סביר משפיע הן גלובליות ומקומיות Ca^{2 +} מערכת אזעקה. כי אירועים אלה עשויים להתרחש בתדרים נמוכים באופן מדומים סטוכסטי מעל קינטיקה מורחבת, הניתוח של Ca^{2 +} אותות המושרה על ידי פתוגנים מעלה האתגרים הטכניים העיקריים שצריך להתייחס.

כאן, אנו מדווחים פרוטוקולים עבור הגילוי של Ca גלובאליים ומקומיים^{2 +} אותות על זיהום שיגלה של תאים אפיתל. פרוטוקולים אלה, חפצי אמנות מקושר חשיפה ממושכת, נזקי המשויך את עירור של Ca^{2 +} רגשים פלורסנט הן troubleshot על ידי והטכני שליטה הפרמטרים רכישה דרך פרקי זמן מוגדרים בזמן שיגלה הפלישה. נהלים מיושמים בקפדנות ולנתח את משרעת ואת התדירות של Ca העולמית cytosolic^{2 +} אותות במהלך זיהום המורחבת קינטיקה באמצעות המכשיר כימי Fluo-4.

Introduction

Ca^{2 +} מסדיר את כל התהליכים תא ידועים, כולל cytoskeletal רה-ארגון, תגובות דלקתיות של מוות התא מסלולים הקשורים פתוגן-פונדקאי אינטראקציות^1,2,3. בתנאים פיזיולוגיים, הבסיס cytosolic Ca^{2 +} ריכוזים נמוכים, של מאות ננומטר טווח, אבל יכולה להיות נתונה מגביר ארעי על גירוי אגוניסט. לווריאציות אלה לעתים קרובות להציג התנהגות מתנדנדות דרך הפעולה של משאבות וערוצי בקרום פלאזמה ורשתית תוך-פלזמית. הדפוס של תנודות אלה מתאפיינת התקופה, משך, ו משרעת של Ca^{2 +} גדל ולאחר מפוענחים על ידי תאים אשר, בתורו, לעורר תגובות ספציפיות בתוך מה שנקרא Ca^{2 +} קוד^4,5 . עלייה מתמשכת ב Ca^{2 +} הריכוז cytosolic בתנאים פתולוגי עלול להוביל מוות של תאים הקשורים את permeabilization של ממברנות מיטוכונדריאלי שחרורו של פרו-אפופטוטיים להיפגע או גורמי נמק^{6, 7}.

שיגלה, סוכן סיבתי של דיזנטריה bacillary, פולש לתאי האפיתל על ידי הזרקת effectors לתוך התאים המארחים באמצעות סוג III הפרשת מערכת (T3SS)^8,9. פלישה שיגלה התאים מארח מזוהה עם גלובליים ומקומיים Ca^{2 +} אותות שהפיק את T3SS. באשר להיוות נקבובית רעלים, את translocon T3SS מוסיף לתוך קרום התא המארח, נדרש עבור ההזרקה של T3SS effectors הוא סביר אחראי על ההפעלה של בקר לוגי מיתכנת, של אינוזיטול (1, 4, 5) טריפוספט (InsP3)-Ca התלויים^{2 +} שחרור. השילוב של הגירוי PLC מקומי ואת ההצטברות של אקטין polymerized באתרים של תוצאה הפלישה שיגלה ב אופיינית ארוכות Ca תלויי-InsP3^{2 +} שחרור¹⁰. אפקטור השלישי סוג IpgD, bisphosphate phosphatidyl 4.5 (PIP2) -4-פוספטאז, מגביל את מקומי כמות PIP2, ובכך שולט כמות המצע זמינים עבור בקר לוגי מיתכנת ליצירת InsP3, אשר תורמת ההחזקה של Ca מקומי^{2 +} תגובות על פלישת חיידקים אתרי^11,12. מקומיים Ca^{2 +} תגובות אלה עשוי לתרום פלמור אקטין שיגלה הפלישה אתרים¹⁰. גלובל Ca^{2 +} התגובות הן גם שהפיק שיגלה, עם זאת, לוותר על התהליך פלישת חיידקים אבל לעורר את הפתיחה של hemichannels connexin ב קרום פלזמה ואת שחרורו של ATP ב- חוץ-תאית תא. ATP שפורסמו מתנהג בצורה paracrine, בתורו, מעוררת Ca תגובות^{2 +} מתנדנדות בתאים לצד התא הנגוע. IpgD הוא גם אחראי על עיצוב Ca העולמית^{2 +} תגובות לתוך התגובות מבודדים לא יציב עם דינמיקה איטי. בסופו של דבר, על זיהום חיידקי ממושכת, IpgD מוביל עיכוב של בתיווך InsP3 Ca^{2 +} אותות. דרך הפרעות שלו עם איתות^{2 +} Ca, IpgD מעכב Ca^{2 +}-הפעלת calpain תלויים שמוביל את פירוק מבנים אדהזיה מוקד ולהתנתקות מוקדמת של נגוע תאים¹³.

בעוד Ca^{2 +} אותות מעורבים היבטים קריטיות של הפתוגנזה, השימוש מיקרואורגניזם מעלה מספר אתגרים טכניים, כי לא נתקלתי במחקרים אגוניסט קלאסית. הפרוטוקולים המתוארים כאן להשתמש בשימוש נפוץ פלורסנט Ca^{2 +} כימיים מחוון Fluo-4 אנחנו המהנדס לאפיין Ca מקומי^{2 +} אותות במהלך זיהום שיגלה . שלבים קריטיים עבור זיהוי אותות אלה נידונות, כמו גם הליכי מיושם עבור שלהם ניתוח כמותי הנדרשות על מנת לאפיין את התפקיד של חיידקי effectors ב Ca^{2 +} איתות.

Protocol

1. תכשירים

1. הכנה חיידקים
   1. צלחת החיידקים – זן פראי-סוגשיגלה לבטא את adhesin AfaE (M90T-AfaE) — trypticase סויה (TCS) אגר צלחת 0.01% המכיל קונגו אדום (CR) ועל תקופת דגירה אותם של 18 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: כדי להגדיל הפארמצבטית שלהם, הצלחות שיגלה שהושג בשלב 1.1.1 מאוחסנים ב 4 ° C, אמור לשמש תוך שבוע, כי כל המושבות באמצעי CR תהפוך לאדומה בסופו של דבר לאורך זמן.
   2. לחסן TCS מרק תרבות מראש על-ידי בחירת 3 מושבות אדום מן הלוחות פס.
      הערה: חיסון עם 3 מושבות מתבצע כדי להגביל את ההסתברות של איסוף שיבוט יחיד פלסמיד התקפה אלימה אשר עבר על שחלוף.
   3. לגדול נוזלי חיידקי תרבויות חממה חזק עבור h 16 ב 37 ° C-200 סל ד. להוסיף אמפיצילין ריכוז סופי של 75 מ"ג/מ"ל. בריכוזים אנטיביוטי לא יעלה 3 x ריכוז מעכבות מינימלית, כמו עודף של אנטיביוטיקה עשויה להוביל לאובדן פלסמיד גדול התקפה אלימה.
      הערה: שמירה על פלסמיד התקפה אלימה שיגלה צריך לאמת על ידי ציפוי התרבויות חיידקי על צלחות CR בתוספת בריכוזים אנטיביוטי מתאים. הנוכחות של מושבות לבן מציין אובדן פלסמיד.
   4. לחסן את התרבות TCS עם התרבות חיידקי טרום-לדילול מטריים. דגירה זה ב- 37 מעלות צלזיוס חממה חזק עבור 2 h ב- 200 סל ד. להבטיח כי הצפיפות האופטית-600 ננומטר (OD_600nm) הוא 0.2 - 0.4.
   5. Centrifuge התרבות חיידקי למשך 2 דקות ב g x 13,000 ב 21 ° C, resuspend בגדר המקבילה ףקיהב EM בינוני (120 מ"מ NaCl, 7 מ מ אשלגן כלורי, מ מ 1.8 CaCl₂, MgCl 0.8 מ מ₂, גלוקוז 5 מ מ ו- 25 מ מ HEPES pH = 7.3).
   6. לדלל את המתלים חיידקי ב מאגר EM-יתר הסופית_600nm של 0.1 להשתמש בה באופן מיידי או לאחסן אותו ב 21 ° C ולהשתמש בו בתוך הבא 60 דקות.
2. הכנה תא
   1. תרבות הלה תאים DMEM עם 1 g/L של גלוקוז בתוספת 10% עגל עוברית סרום (FCS), לגדל אותם ב 37 ° C עם 10% CO₂. לגדול TC-7 גדלו ב DMEM עם 4.5 g/L של גלוקוז, המכיל 10% FCS וחומצות אמינו שאינם חיוניים ב חממה 37 ° C המכיל 10% CO₂.
   2. תא תחזוקה, לפצל את התאים באופן קבוע כדי למנוע עיכוב גדילה-צור קשר מקושר למדינות confluent; . זה קריטי עבור Ca^{2 +} בדיקה טעינה/תקנים יעילות גבוהה.
   3. צלחת הלה תאים על coverslips עגול בקוטר 25 מ מ סטרילי ב 6-ובכן צלחות על צפיפות של תאים⁵ 3 x 10/טוב יום לפני הניסוי עבור התאים הלה.
   4. תאי TC-7, trypsinize, לספור תאים. זרע אותם ב- 4 x 10⁵ תאים/טוב, דגירה אותם 5-7 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס ב 10% CO₂-חממה לפני הניסויים כדי לאפשר קיטוב.
      1. רענן המדיום התרבות התא בכל יום עד ליום של הניסוי.
         הערה: צ'יימברס חד פעמיות בקוטר 35 מ מ זכוכית-התחתון עשוי לשמש גם כחלופה הבארות המכילות coverslips. אם הם האחרונים שימוש, בקרת טמפרטורה דרך שלב מחוממת או המטרה אינה מספיקה, תא הדגירה טרמוסטט רכוב על הבמה מיקרוסקופ נדרש.
3. היום של הניסוי, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים 3 x 1 מ"ל EM בינונית-21 ° C.
4. לטעון את התאים עם 3 מ מ Fluo-4-אם¹⁴ מאגר EM למשך 30 דקות ב 21 ° C.
   הערה: בזמן הטעינה של תאים הלה תת confluent לא להעלות בעיות רציניות, הטעינה של תאי TC-7 מקוטב לעתים קרובות הטרוגנית ויעיל לקוי. עבור תאים אלה, מצאנו כי ההטענה מועצמת על ידי התוספת של פיזור סוכן – חומצה pluronic —-ריכוז סופי של 0.1% ושל bromosulfophtalein מעכב את אניון-טרנספורטר-ריכוז סופי של 20 מיקרומטר Fluo-4-AM-המכיל אותם. שימוש רציומטרי כימיים רגשים או גנטית מקודד-סריג הגששים דרישה כפולה-רכישה אינה תואמת המהירות של רכישת הדרושים עבור ההדמיה של רשות מקומית^{2 +} תגובות.
5. לשטוף את הדגימות 3 x עם EM מאגר, בהמשך דגירה אותם ב 1 מ"ל EM מאגר ב 21 ° C כדי לאפשר הידרוליזה של moiety AM. שימוש Fluo-4 טעון תאים באופן מיידי או תוך הבאה 90 דקות (ומתוחזק על 21 ° C).

2. זיהום, ייבוא תמונות מקומיות Ca^{2 +} תגובות

1. מניחים את coverslip המכילות את התאים Fluo-4 טעון קאמרית הדמיה או זכוכית-בתחתית המצודה. לשטוף את הדגימות בבית הבליעה הדמיה או זכוכית-תחתון חד פעמיות קאמרית 3 x עם EM המאגר כדי להסיר תרכובות פוטנציאלי הנובע פירוק התא. להוסיף 1 מ"ל EM המאגר.
2. המקום התא על במה מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה מחומם ב 33 º C.
   הערה: טמפרטורה זו נבחרה בתור פשרה בין הטמפרטורות האופטימלי תואם עם תהליך הפלישה שיגלה להאטה של Ca^{2 +} תגובות להמחיש תגובות מקומיות. אנו משתמשים 63 X טבילה שמן המטרה (NA = 1.25) מצוידים עם שלב ניגודיות טבעות.
3. בחר שדה מיקרוסקופ ולהגדיר פרמטרים הרכישה, לרבות זמן החשיפה, binning במקרה הצורך למטב את האות פלורסנט Fluo-4.
   הערה: האתגרים הגדולים של רשות מקומית^{2 +} הדמיה הן משרעת נמוכה ולהציג משך קטן של התגובות, הדורשות רכישת גב' 30 לפחות כל מספר זמינים מסחרית בחזרה מואר EM-CCD או C-MOS מצלמות הדרוש רגישות כדי לזהות תגובות^{2 +} Ca מקומי באמצעות Fluo-4. איתור רגישות הוא גם נושא חשוב להגביל את נזקי או חפצים כגון תגובות ספונטנית לקשר את עירור פלורסנט של Fluo-4 בתדר גבוה. כאן, של תאורה מבוססת LED של 470 nm, עם 480 ± 40 ננומטר הלהקה לעבור עירור מסנן, מסנן ודיקרואיק זוהר 505-nm של פליטה 527 של הלהקה לעבור nm ± 30 פעם ב-5% עוצמה מירבית שלו בשילוב עם דחיסות נייטרלית מסנן 1.0 שימשו כדי למזער את הבעיות האלה תחת זרם של רכישות של משכי זמן מוגבל. ניתוח של Ca מקומי^{2 +} אותות על ידי קבוצות של 120 s זרמים היה שגרתי שבוצעה. בתנאים אלה תאורה נמוכה, fluorophore photobleaching לא נצפתה במהלך 2 min-stream הרכישות. רכישות רצופות על הדגימה זהה ניתן לבצע, בתנאי שדות שונים משמשים. ככלל, זרם הרכישה הראשון מתבצע על שדה שליטה בהיעדר גירוי חיידקים כדי לוודא העדר תגובות ספונטנית. אם הם נצפו תגובות ספונטנית, הדגימות נשטפים עם מאגר EM עד אין תגובות שנצפו.
4. כדי להוסיף חיידקים המדגם, להסיר µL 500 EM מאגר מן החדר ולהוסיף 500 µL של חיידקי ההשעיה מוכן בשלב 1.1.6 להשיג OD הסופי_600nm 0.05, את הטיפול המתאים כדי למנוע העברת השדה שנבחר מיקרוסקופ; אמצעי האחסון להבטיח ערבוב נאותה של החיידק, התפלגות אחידה של החיידקים על הדגימות תא.
5. לבצע רכישה על תוספת חיידקים. לחלופין, לבצע רכישה 10 דקות בעקבות תוספת חיידקים, התואם את הזמן הנדרש עבור חיידקים כדי משקעים על גבי התאים תחת תנאי שימוש. בקצה הנחל רכישה, רוכשים את תמונת שלב-ניגודיות של השדה שנבחר כדי להמחיש את החיידקים פנייה אל התאים, של קפלים ממברנה הקשורים עם פלישת חיידקים אתרים.
6. חזור על הליך רכישת כמו שלב 2.5, במרווחי זמן נתונות משך הזמן של רכישות תמונה, קבצי חיסכון, מבחר של שדה חדש כדי לכסות את כל התהליך.
   הערה: עבור שיגלה, מצאנו כי רכישת זרמים בכל 5 דקות למשך 20 דקות, בעקבות שקיעת חיידקי של 10 דקות, מותר לכסות את רוב האירועים הפלישה.
7. בסופו של התהליך רכישה, להוסיף ריכוז סופי של 2 מיקרומטר של Ca^{2 +} ionophore ionomycin הדגימות כדי לקבוע את משרעת מקסימלי של Ca^{2 +} האותות. לרכוש תמונות כל 3-5 s עד ייצוב האות, בדרך כלל על פחות מ- 10 דקות.
8. פעל על-ידי הוספת Ca^{2 +} chelator EGTA-ריכוז סופי של 10 מ מ כדי לקבוע את האות פלורסצנטיות בהיעדרו של Ca^{2 +}. לרכוש תמונות כל 3-5 s עד ייצוב האות, בדרך כלל על פחות מ- 10 דקות.
   הערה: בגלל הדינמיקה האיטי יחסית של הווריאציות^{2 +} Ca העולמית, לבצע רכישות אלה כל s 3-5 (לא במצב של זרימה), המאפשר Ca^{2 +} הדמיה באותו שדה מיקרוסקופית במהלך הטיפולים רצופים.

3. ניתוח

1. אקספרס cytosolic Ca^{2 +} וריאציות לאורך זמן כאחוז מתוך ΔF/F₀, כאשר ΔF מייצג את הווריאציה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית הממוצע של האזור בעל עניין (ROI) ו- F₀ של זריחה בסיסית ברועי אותו, שבה אזור שאינו רלוונטי של השדה ללא תאים יופחת.
   1. הסר את רמות קרינה פלואורסצנטית הבסיס עבור כל תא בתחומים שונים, המתאימים רמות הבסיס; רמות אלה ניתן לקבוע חד משמעית עקב תדירות נמוכה, קצרים יחסית משך Ca מקומי^{2 +} תגובות ברכישה זרם מסוים.
      הערה: לכמת המאפיינים הבולטים של התגובות הקשורים השאלה הנשאלת ודגם פתוגניים למד. באופן קלאסי, פרמטרים שונים נלקחים בחשבון כדי לנתח Ca^{2 +} אותות, כולל את התדירות של תאים מציג המקומי או הגלובלי Ca^{2 +} תגובות, כמו גם את המשך, משרעת, והתדירות מהתגובות. במקרה של שיגלה , תגובות מקומיות, היבט חשוב נוסף של הניתוח היא השיוך המרחבי של התגובות באתרי הפלישה חיידקי.
2. כדי לכמת את אחוז התאים מגיבים מציג תגובות גלובלי או מקומי, צייר ROIs בתאים, בסדרת הזמן-התואמים הווריאציות בעוצמה Fluo-4.
   1. להגדיר פרמטרים קפדני כדי לזהות המקומית Ca^{2 +} תגובות, כגון משרעת החולוני לעיל וריאציות על רקע של התוכנית הבסיסית תא עוצמת קרינה פלואורסצנטית ממוצע, או משך זמן של פחות 200 ms, כדי להימנע הניקוד שווא.
      הערה: ככלל, Ca מקומי קטן אפילו^{2 +} תגובות ניתן להבדיל בין כל רעש רקע על ידי הפרופיל שלהם. ROIs צריך להיות גדול מספיק כדי לשלב את אותות פלורסצנטיות מספיק כדי לאפשר הגילוי של וריאציות מקומיות. בהתאם, את עוצמת גילוי Fluo-4 ROIs אלה עשויים להתאים עיגולים עם קטרים הנע בין 2-5 מ מ.
   2. למדוד את הווריאציות של עוצמת קרינה פלואורסצנטית Fluo-4 בממוצע 2 אזורים באזור ברורים באותו התא, כדי לקבוע אם התגובות הם המקומי או הגלובלי.
      הערה: הניתוח של מספר גדול של תאים הוא הקל על ידי שימוש imaging התוכנה מתיר את תצוגת המסך ופשוט הואריאציות של עוצמת קרינה פלואורסצנטית הממוצע לאורך זמן עבור אזורים שנבחרו. תוכנת הדמיה זמינים מסחרית יש אופציה כזו, אבל זה יכול גם להתבצע באמצעות freeware אייסי , באמצעות תוסף רועי בעוצמה האבולוציה .
   3. לקבוע את אחוז תאים מציג תגובות מקומיות.
      הערה: אחוז זה מחושב לפי המספר הכולל של תאים ניתח בשטח מיקרוסקופ, שאמור להיות במספרים מספיקות לתמיכה מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן פרמטרית.
   4. לקבוע את משך הזמן של התגובות המקומיות.
      הערה: Ca מקומי^{2 +} תגובות ניתן עוד להבחין לפי טווחים משך שלהם (קרי, פחות מ 500 ms, בין 5 ל 10 s, או מעל 10 s) והקשר שלהן עם שיגלה הפלישה אתרים.
3. לכמת את משרעת של התגובות. ראשית, כיילו את מקסימלי Ca^{2 +} תא רקע ורמות נחוש כמו שלב 2.1.7. מאז העומס Fluo-4 עשוי להשתנות עבור כל תא, לבצע אלה האישושים לתאים בודדים בשדה.
   1. לבטא את משרעת של התגובות כאחוז היחסי של התגובה מקסימלי.
   2. לבצע בדיקות סטטיסטיות באמצעות מבחן נורמליות, ואחריו מבחן פרמטרי לנתח ההבדלים הפוטנציאליים משרעת של תגובות בין דגימות.
   3. לקבוע האגודה מהתגובות ביחס האתרים פלישת חיידקים על ידי לוקליזציה בהתאמה שלהם קפלים ממברנה בקטריאלי-induced דמיינו של תמונות חדות השלב המתאים.

תוצאות

הפלישה שיגלה משויך טיפוסיות לאורך זמן מקומי Ca^{2 +} תגובות:

בעקבות פרוטוקול שהוזכרו לעיל, הלה טעון-Fluo-4 תאים לערער עם WT שיגלה , זרם הרכישות בוצעו כדי לנתח אותות^{2 +} Ca. ניסוי נציג מוצג באיור 1, עם סדרת תמונות בציל...

Discussion

כתב יד זה מתאר פרוטוקול אנחנו המהנדס לעקוב Ca מקומי^{2 +} אותות במהלך קינטיקה קצר יחסית של פלישה שיגלה , כמו גם Ca העולמית^{2 +} תגובות במהלך קינטיקה מורחבת של שיגלה. להלן, מפתח הנושאים ניתן למצוא את זה צריכים להיות מופנית כדי למטב את הגילוי של Ca^{2 +} אותות תוך מזעור כל התערבות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph version 7.7	Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2	Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high	IBIDI	81156
Trypticase Soy (TCS) broth	Thermofisher		B11768
TCS agar	Thermofisher		B11043
Congo red	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017	isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin