اكسوسوميس الغسل للفيسيولوجيا في الإصابات الناجمة عن Lipopolysaccharide الرئة التفسخ

Summary

تفرز الفئران المعرضة للبس داخل اكسوسوميس في السنخية برونتشو الغسل (BAL) السوائل التي يتم حزمها مع ميرناس. باستخدام نظام ثقافة المشارك، نظهر أن اكسوسوميس صدر في السائل BAL عرقلة التعبير من مفرق ضيق البروتينات في الخلايا الظهارية الشعب الهوائية وزيادة التعبير عن السيتوكينات الموالية التحريضية التي تزيد من حدة الإصابة الرئوية.

Abstract

وتمثل إصابة الرئة الحاد (على) ومتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (اردز) مجموعة غير متجانسة من أمراض الرئة التي تواصل ارتفاع معدلات الاعتلال والوفيات. ويجري المرضية الجزيئية على أفضل تعريف؛ ومع ذلك، بسبب الطبيعة المعقدة لهذا المرض لم توضع العلاجات الجزيئية. هنا نستخدم نموذج ماوس مستحث lipopolysaccharide (LPS) لإصابة الرئة الانتانية الحادة لتحدد دور اكسوسوميس في الاستجابة الالتهابية. باستخدام هذا النموذج، كنا قادرين على إظهار أن الفئران التي تتعرض للبس داخل تفرز اكسوسوميس في السنخية برونتشو الغسل (BAL) السائل من الرئتين التي يتم حزمها مع ميرنا والسيتوكينات التي تنظم الاستجابة الالتهابية. كذلك استخدام نظام نموذج ثقافة المشارك، نظهر أن اكسوسوميس صدر من الضامة عرقلة تعبير البروتينات مفرق ضيق في الشعب الهوائية الخلايا الظهارية. هذه النتائج تشير إلى أن الصليب الحديث 1) بين الخلايا المناعية والهيكلية الفطرية من خلال جولات مكوكية اكسوسومال المساهمة في الاستجابة الالتهابية وتمزق الجدار الهيكلي و 2) استهداف هذه ميرناس قد توفر منبرا جديداً لعلاج على والضائقة.

Introduction

على والضائقة هي الأشكال تهدد الحياة من فشل في الجهاز التنفسي مع نقص تاكسج الدم الحاد الناجم عن ذمة رئوية غير كارديوجينيك الذي يؤثر على ما يقرب من 1 مليون شخص في العالم سنوياً¹. تشمل مسببات الضائقة الضرر المباشر إلى الرئتين من العدوى أو الطموح ومجموعة متنوعة من إهانات غير مباشرة. خلال العقد الماضي كان هناك زيادة فهم الآلية المرضية الجزيئية للضائقة، ولكن العلاجات المستهدفة المحددة للضائقة بعد أن وضعت^2،3.

وقد وضعت عدة نماذج حيوانية لإصابة الرئة الحادة التي توفر جسراً لترجمة علاجات تجريبية للدراسات الإنسانية^4،5. وتشمل نماذج شائعة التثبيت المحلي من حمض الأولييك والبكتيريا ولبس وبليوميسين. وتشمل النهج الأخرى الاسكيمية-الاكسجينيه، ثقب ربط سيكال، الإصابة تمتد الميكانيكية المستحثة بالتهوية أو هايبروكسيا أو الإدارة المنهجية للبكتيريا ولبس⁵. هذه النماذج توفر نظام بيولوجي مفيدة لاختبار فرضيات السريرية وتطوير العلاجات المحتملة. لمحاكاة الضائقة الإنسانية، ينبغي استنساخ نماذج حيوانية الالتهابات والإصابات الحادة للخلايا الظهارية وبطانية بعيوب في وظيفة الحاجز في الرئتين.

اكسوسوميس الحويصلات الغشاء مع 20-200 نانومتر في القطر، ومحتواه الجزيئي يحتوي على البروتينات والحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والدهون، وتيسير الاتصالات بين الخلوية في المكروية الأنسجة عن طريق نقل التركيب الجزيئي. اكسوسوميس التي يفرزها أنواع متعددة من الخلايا، مثل خلايا بطانية والخلايا الظهارية، وخلايا العضلات الملساء والخلايا السرطانية، وتوجد في السوائل في الجسم البشري. وتشير الدراسات إلى أن تنظيم اكسوسوميس عبر الحديث بين الخلايا المناعية والخلايا اللحمية أثناء أمراض الالتهابات المعدية والعقيمة، والإفراج عنهم غير طبيعي يظهر تنظمها مختلف المحفزات الطبيعية والتجريبية خلال الفسيولوجية والعمليات المرضية⁶. شبكة الاتصال من هذا القبيل قد تلعب دوراً هاما في الآلية المرضية لأمراض الرئة، وقد تؤثر على تطور الفيزيولوجية المرضية^7،8. النوكليوتيدات، 18-22 غير الترميز الكشف، ميرناس الموجودة في الأنسجة وسوائل الجسم، البلازما، سيرا، وتعدل التعبير مرناً في مستوى بوستترانسلاشونال^9،10.

ميرناس المعبأة في اكسوسوميس التأثير على التمايز والدالة لأنواع متعددة من الخلايا، والمستويات المفرطة المرتبطة بمجموعة متنوعة من الأمراض، بما في ذلك السرطان وأمراض الرئة، والسمنة، والسكري، والأمراض القلبية الوعائية^{11، 12،،}من^1314،،من¹⁵¹⁶. دخول الخلايا المتلقية ويتنقلون من ميرناس اكسوسومال تيسير الاتصالات بين الخلايا تعديل الأرقاء المكروية^17،18. إصابة الرئة الحاد عمليات معقدة، التي تنطوي على العديد من أنواع الخلايا مع الاتصالات الواسعة النطاق بين الخلايا عن طريق اكسوسوميس⁸. مير-155 ومير-146a حصة الآلية التنظيمية النسخي المشتركة والمساهمة في الاستجابة الالتهابية و التسامح المناعي^19،20. الدراسات الحديثة تشير إلى أن كلا تعدل الاستجابة الالتهابية عن طريق اكسوسومال ميرناس جولات مكوكية بين الخلايا المناعية²¹. ومع ذلك، الآليات الجزيئية الكامنة وراء آثار مودولاتوري ميرناس اكسوسومال على السنخية وردا على الذيفان لا تزال غير واضحة، وبلا شك أهميتها السريرية المحتملة وضمنا متعدية الجنسيات تستحق المزيد من التحقيق.

تستخدم نماذج الثقافة المشتركة لتحديد التفاعل بين أنواع خلية معينة في بيئة معقدة، مثل السرطان والتهاب^،من²²²³. وتوفر هذه المنصات استراتيجية بديلة استجواب الصليب الحديث بين أنواع خلية خاصة بالنسبة للخلايا المناعية والهيكلية.

داخل الرغامى، الضبوبيه، داخل أو منهجية إدارة لبس تستخدم على نطاق واسع للحث على الرئة التجريبية إصابة^24،،من²⁵²⁶، وأظهرت للحث على نفاذية الظهارية وبطانية العيوب. هنا نستخدم لبس داخل للحث على نموذج الصرف الصحي لإصابة الرئة الحاد في الفئران. خلال 24 ساعة داخل الإدارة للبس، هي التي يسببها العيوب النفاذية في الرئتين بتجنيد الخلايا التحريضية. علاوة على ذلك، نعرض أن يتضمن اكسوسوميس من بال ميرنا-155 ومير-146a، وحمل اكسوسوميس من السوائل BAL التعبير السيتوكينات برو-التهاب في الخلايا الظهارية المتلقي، بما في ذلك 6 إيل وتنف-α. هذه البيانات الأولى لإظهار أن ميرناس اكسوسومال يفرز في بال في هذا النموذج من الإصابة الحادة التهاب الرئة.

Protocol

ويتطلب البروتوكول العام أيام 2، بما في ذلك اليوم الأول من تحريض الانتان وعزله من السائل بال من الحيوان، وفي اليوم الثاني لعزل اكسوسوميس من الماوس بالف. تم استعراض جميع الإجراءات ووافقت عليها لجنة الاستخدام في مركز طبي خامسا أتلانتا ورعاية الحيوان المؤسسية.

1-الماوس الحاد التهاب الرئة الإصابة النموذجي

1. استخدام 6-8 أسابيع-القديمة البرية من نوع C57BL/6J الفئران الذكور (وزن ز 20-22) للحيوان النموذجية، وتنفيذ جميع الإجراءات باستخدام تقنيات العقيم والصكوك. اﻷوتوكﻻف جميع الأدوات الجراحية، بما في ذلك ملقط ومقص لمدة 20 دقيقة في 121 درجة مئوية.
2. توزيع عشوائي الفئران إلى التجريبية ومجموعة المراقبة. كبح جماح الفئران على لوحة العمليات جراحية. علاج الفئران مع lipopolysaccharide الإشريكيّة القولونية (لبس، 15 مغ/كغ) بداخل المسار. استناداً إلى وزن الجسم الفردية، تخفف جرعات لبس المناسبة إلى 0.1 مل برنامج تلفزيوني في الماوس، ثم حل لبس استخدام المحاقن 1 مل مع ز 27 إبرة حقن وحقن بما يعادل حجم برنامج تلفزيوني لمراقبة الحيوانات.
3. الحفاظ على الفئران في مرفق BSL2 الحيوانية، التي تتألف من أقفاص النظيف في درجة حرارة الغرفة مناسبة.
4. 24 ساعة في وقت لاحق، euthanize الفئران مع استنشاق أول أكسيد الكربون₂ .
5. حدد منطقة الجراحية في وسط الرقبة الماوس. إجراء شق صغير (حوالي 5 ملم)، وفصل برفق العضلات للوصول إلى القصبة الهوائية باستخدام الملقط حادة حتى يتم كشفها في القصبة الهوائية.
6. سحب الماوس بال السائل مع 10 مل المحاقن المعقمة بإبرة ز 27. أولاً، بلطف، أدخل الإبرة في القصبة الهوائية وحقن 1 مل PBS العقيمة ببطء في القصبة الهوائية، ثم رسم بالف في محقن 3 مللي المتاح بإبرة ز 27. عند انتهاء الإجراء، التخلص من المحاقن والإبر في حاوية الأدوات الحادة واقية.
7. التعامل مع الأدوات الجراحية مع ثاني أكسيد الكلور، كما هو موضح مسبقاً قبل شاريت et al. ²⁷، وثم تعقيم جميع الأدوات الجراحية بالتعقيم لمدة 20 دقيقة في 121 درجة مئوية.

2-اكسوسوميس العزلة-مسلسل الترا-الطرد المركزي وتوصيف

1. جمع الماوس BAL السوائل في الأنابيب المخروطية 15 مل. حصاد الخلايا السنخية، وعينات للطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في ز 1,000، في 4 درجات مئوية.
2. نقل المادة طافية على أنابيب مخروطية الشكل 15 مل جديدة، ثم الطرد المركزي عينات لمدة 30 دقيقة في 4,000 س ز عند 4 درجة مئوية لإزالة الحطام خلية.
3. جمع المادة طافية في أنابيب ultracentrifuge وعينات للطرد المركزي لمدة 60 دقيقة في 10,000 ز x عند 4 درجة مئوية لإزالة الجسيمات الأكبر حجماً الخلوية.
4. نقل المادة طافية على أنابيب مخروطية الشكل الجديد، ثم تصفية العينات من خلال 0.2 ميكرون حقنه-تصفية لإزالة المتبقي الجسيمات الأكبر حجماً.
5. جمع العينات في أنابيب أولتراسينتريفوجي، وتحقيق التوازن بين الأنابيب. الطرد المركزي عينات ح 2 في 140,000 س ز عند 4 درجة مئوية بيليه اكسوسوميس.
   ملاحظة: يختلف حجم اكسوسوميس 20-200 نانومتر. 0.2 ميكرون فلتر يستخدم لإزالة الجسيمات الأكبر حجماً التي هي أكثر من 200 نانومتر في الحجم.
6. تجاهل سوبيرناتانتس برفق. حل بيليه مع 100 ميليلتر PBS أو حل تحلل، ونقل اكسوسوميس عينات لأنابيب 1.5 مل، وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
   ملاحظة: يوصي بالمجهر الإلكتروني انتقال للتحقق من اكسوسوميس معزولة.
7. اتبع العينة تيم القياسية تجهيز بروتوكول²⁸. تحليل عينات اكسوسوميس باستخدام مقياس مجهر إلكتروني، والتقاط الصور وشريط 200 نانومتر.

3-إعداد ميرنا والمسرحية ميرنا--RT-PCR

ملاحظة: من المستحسن ميرنا--RT-PCR لتحليل مستوى التعبير ميرناس.

1. اتبع ميرناس القياسية البروتوكول العزلة وتأكد من استخدام مبلغ مساو من الكشف المنقاة في النسخ العكسي حبلا واحد²⁴.
2. يتبع البروتوكول PCR الوقت الحقيقي القياسية للكشف عن مستوى ميكرورنا اكسوسومال في بال السائل. استخدام محددة الإشعال PCR الوقت الحقيقي ضد مير-155 ومير-146a سنرنا U6. تشغيل [بكر] رد فعل مع جهاز PCR الكمي وتطبيع قيم التعبير للرقابة الداخلية U6 سنرنا.
   ملاحظة: كل فريق يتكون من ثلاث عينات²⁴.

4-اكسوسوميس وسم وتنقية

1. تعليق بيليه اكسوسوميس مع 100 ميليلتر تعليق الحل في أنبوب البولي بروبلين 1.5 مل، ثم إضافة ميليلتر 0.4 من صبغة اكسوسوميس في الأنبوبة الأخرى مع 100 ميليلتر من الحل تعليق.
2. بسرعة إضافة اكسوسوميس في الحل إلى الحل صبغ ومزجها جيدا قبل بيبيتينج. الاحتفاظ بعينات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وحماية من الضوء.
3. وضع عمود الدوران اكسوسومي واحد في أنبوب شطف 1.5 مل. نقل الخليط الحل إلى مركز العمود تدور اكسوسومي.
4. تدور في عمود 2 دقيقة في 800 x ز في درجة حرارة الغرفة.
5. تجاهل العمود وتخزين العينة التيد في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

5-التحقق من اكسوسوميس حتى تتخذها الخلايا المتلقية

1. البذور 1 × 10⁴ /MLE 12 الخليوي في شريحة دائرة 8-جيدا، وخلايا الثقافة في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂.
2. إضافة 10 ميليلتر نيون المسمى اكسوسوميس للخلايا. احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية.
3. قم بإزالة وسائط الثقافة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، ثم إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 1% لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. جبل الشريحة في جبل المتوسطة مع DAPI.
5. تحليل عينات من خلال مجهر الأسفار والتقاط صور، 40 X التكبير.

6-تحقق تفاعل بين اكسوسوميس والخلايا المتلقية

1. البذور 2 × 10⁵ MLE12/بئر في صفيحة ثقافة 12-كذلك يتضمن مناسبة الثقافة المتوسطة، وخلايا الثقافة في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂.
2. إضافة 20 ميكروغرام اكسوسوميس من الماوس بال السائل إلى خلايا MLE12 وإعداد replicates كل مجموعة تجريبية.
3. 24 ساعة في وقت لاحق، تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وإضافة 600 ميليلتر تحلل العازلة في البئر. بلطف يهز اللوحة وجمع عينات تحلل في أنبوب 1.5 مل مع الماصة.
4. اتبع معيار مجموع الجيش الملكي النيبالي العزلة وبروتوكول كدنا النسخ العكسي، وإكمال النسخ العكسي كدنا حبلا واحد²⁹.
5. يتبع البروتوكول PCR الوقت الحقيقي القياسية للكشف عن مستوى التعبير مرناً في الخلايا المتلقية²⁹. استخدام محددة الإشعال PCR الوقت الحقيقي ضد تنف-α، وايل-6، وزوى--1. تشغيل PCR ردود الفعل مع جهاز PCR الكمي وتطبيع قيم التعبير للرقابة الداخلية جابده.
   ملاحظة: كل فريق يتكون من ثلاث عينات.

النتائج

للحث على إصابة الرئة التفسخ، يعاملون الفئران مع لبس داخل (15 مغ/كغ). خلال 24 ساعة إدارة لبس، شهدت تدفق بالعدلات الرئتين، كما هو مبين في الشكل 1 ألف. ووجه السائل BAL الماوس، متبوعاً بعزل وتنقية اكسوسوميس. وأكد مورفولوجية اكسوسوميس بالف انتقال الميكروسكوب الإلك?...

Discussion

نماذج الماوس من الأمراض تستخدم عادة لتقييم الوظيفة الفسيولوجية لجينات محددة وخفض تكلفة التجريب². إصابة الرئة الانتانية الحادة الموصوفة هنا يحاكي الاستجابة الالتهابية في البشر مع الضائقة. هذا النموذج ذات الصلة بالتحقيق في الآلية المرضية الجزيئية، تطوير المؤشرات الحيوية واخ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich	Escherichia coli 055:B5
PBS pH7.2(1X)	Life technologies	20012-027
mirVana miRNA isolation kit	Thermo Fisher	449774
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo Fisher	4369016
mmu-miR-155 (002571) primer	Thermo Fisher	4427975
has-miR-146a (000468) primer	Thermo Fisher	4427975
U6snRNA primer	Thermo Fisher	4427975
TNF-α(Mm00443258_m1 ) primer	Thermo Fisher	4331182
IL-6 (Mm00446190_m1   )primer	Thermo Fisher	4331182
ZO-1 (Mm00493699_m1  )primer	Thermo Fisher	4331182
minimal essential medium (MEM)	Thermo Fisher	11095-072
Trysin-EDTA solution(0.05%)	Thermo Fisher	25300054
Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit	Sigma-Aldrich	MINI67-1KT
Exosome Spin Columns (MW3000)	Thermo Fisher	4484449
Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge	Beckman Coulter	L-100XP
Ultra-clear centrifuge tubes	Beckman Coulter	344058
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System	Thermo Fisher
transmission electron microscopes (TEM)	JEOL Ltd	120 kV TEM
Olympus BX41 microscope	Olympus	BX41