Бронхоальвеолярный лаваж Exosomes в Липополисахарид индуцированной септик легких травм

Резюме

Мышей в внутрибрюшинного ПЛАСТИНОК выделяют exosomes в жидкости бронхо альвеолярные промывание (БАЖ), которые упакованы с адаптивной. С помощью системы совместного культуры, мы показывают, что exosomes, выпущенный в жидкости бал нарушить экспрессию белков жесткой перехода в бронхиальной эпителиальных клеток и увеличить выражение провоспалительных цитокинов, что подчеркнет повреждения легких.

Аннотация

ОПЛ (Али) и острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) представляют собой разнородную группу легочных заболеваний, который продолжает иметь высокие показатели заболеваемости и смертности. Молекулярный патогенез Али в настоящее время лучше определены; Однако ввиду сложного характера заболевания молекулярной терапии еще не разработаны. Здесь мы используем модель индуцированных мыши липополисахарида (LPS) септик ОПЛ разграничить роль exosomes в воспалительной реакции. С помощью этой модели, мы смогли показать, что мышей, которые подвергаются воздействию внутрибрюшинного ПЛАСТИНОК выделяют exosomes в бронхо альвеолярные промывание (BAL) жидкости из легких, которые упакованы с Мирна и цитокины, которые регулируют воспалительной реакции. Далее с помощью системы модель совместного культуры, мы показываем, что exosomes выпущена с макрофаги нарушить экспрессию белков жесткой перехода в бронхиальной эпителиальных клеток. Эти результаты показывают, что 1) кросс talk между врожденной иммунной и структурных клетки через exosomal челночные способствовать воспалительной реакции и нарушения структурных барьеров и 2) ориентации этих адаптивной может предоставить новые платформы для лечения Али и ОРДС.

Введение

Али и ОРДС являются опасные для жизни формы дыхательной недостаточности с тяжелой гипоксемия, вызванные non кардиогенный отек легких, которая затрагивает около 1 миллиона человек во всем мире ежегодно¹. Этиология ОРДС включает прямой травмы легких от инфекции или аспирации и целый ряд косвенных оскорбления. За последнее десятилетие наблюдается рост понимания молекулярный патогенез ОРДС, однако, конкретных целевых лечения ОРДС еще быть разработаны^2,3.

Были разработаны несколько животных модели острого повреждения лёгких, которые обеспечивают мост для перевода экспериментальной терапии для человека исследования^4,5. Часто используемые модели включают в себя местные установки олеиновой кислоты, бактерий, ПЛАСТИНОК и блеомицин. Другие подходы включают ишемии реперфузии, сенситизации лигирование прокол, механические ИВЛ индуцированное стрейч травмы, гипероксия или системного администрирования бактерий и LPS⁵. Эти модели обеспечивают полезные биологические системы для тестирования клинических гипотезы и для разработки потенциальных терапий. Чтобы имитировать человека ОРДС, Животные модели следует воспроизвести воспаления и острой травмы эпителиальных и эндотелиальных клеток с дефектами в барьерные функции в легких.

Exosomes мембрана везикулы с 20-200 Нм в диаметре, содержание которых молекулярный содержит белки, ДНК, РНК и липидов, и облегчить между сотовой связи в ткани микроокружения молекулярного состава переводом. Exosomes выделяется несколько типов клеток, таких как эндотелиальные клетки, клетки эпителия, гладкомышечные клетки и клетки тумора и существуют в человеческий организм жидкости. Исследования показывают, что exosomes регулировать перекрестных помех между иммунные клетки и стромальных клеток при инфекционных и стерильные воспалительных заболеваний, и их аномальные релиз, как представляется, регулируются различные природные и экспериментальных стимулы при физиологических и⁶патологических процессов. Такие сети связи могут играть важную роль в патогенезе легочных заболеваний и может повлиять на патофизиологические прогрессирования^7,8. Как 18-22 нуклеотидов некодирующих РНК, адаптивной существуют в ткани и жидкости организма, плазмы, сера и модулировать выражение mRNA в столб-поступательные уровня^9,10.

Фасованные интерферирующим в exosomes влияние дифференциации и функции различных типов клеток, и чрезмерные уровни связаны с целым рядом заболеваний, включая рак, легочных заболеваний, ожирения, диабета и сердечно-сосудистых заболеваний^{11, 12,13,14,,1516}. Вступление в получателя клетки и челночные exosomal интерферирующим облегчить межклеточные связи, изменения гемостаза микроокружения^17,18. Острого повреждения лёгких-это сложные процессы, с участием нескольких типов клеток с обширной межклеточных коммуникаций через exosomes⁸. Мир-155 и мир 146А общий механизм transcriptional регулирования и способствовать воспалительной реакции и Иммунологическая толерантность^19,20. Недавние исследования показывают, что оба модуляции воспалительной реакции через exosomal интерферирующим челночные иммунные клетки²¹. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе модулирующее влияние exosomal интерферирующим на альвеолярной ответ эндотоксина остаются неясными, несомненно потенциальных клинической значимости и заслуг трансляционная последствия дальнейшего расследования.

Совместное культуры модели используются для определения взаимодействия типов конкретных клеток в сложных условиях, таких как воспаление и рак^22,23. Эти платформы предоставляют альтернативную стратегию допросить кросс talk между типами клеток, особенно для иммунной и структурных клеток.

Внутри трахеи, аэрозольных, внутрибрюшинного или системного администрирования LPS широко используются для стимулирования экспериментальной легких повреждений^24,25,26и показали, чтобы побудить проницаемость эпителия и эндотелиальных дефекты. Здесь мы используем внутрибрюшинного LPS побудить децентрализованная модель острого повреждения легких у мышей. В течение 24 h внутрибрюшинного администрации LPS проницаемость дефектов наведенные в легких с набора воспалительных клеток. Кроме того мы показывают, что exosomes от бал содержат Мирна-155 и мир 146А, и exosomes от жидкости бал побудить выражение провоспалительных цитокинов в получателей эпителиальных клеток, включая ИЛ-6 и ФНО α. Эти данные являются первым, чтобы показать, что exosomal интерферирующим выделяется в бал в этой модели септик ОПЛ.

протокол

Общий протокол требует 2 дней, включая первый день индукции сепсиса и изоляции бал жидкости из животного и на второй день для exosomes изоляции от мыши BALF. Все процедуры, рассмотрели и утвердили институциональный уход животных и использования Комитетом в медицинском центре Атланты ва.

1. мышь септик ОПЛ травмы модель

1. Использовать 6-8 недель - старый одичал тип C57BL/6J мышей-самцов (вес 20-22 g) для животных модель и выполнять все процедуры с использованием асептических методов и инструментов. Автоклав всех хирургических инструментов, в том числе щипцы и ножницы для 20 мин при 121 ° C.
2. Случайным образом распределите мышей в экспериментальной и контрольной группы. Останови мышей на доске хирургического. Лечат мышей с кишечной палочкой липополисахарида (LPS, 15 мг/кг), внутрибрюшинного маршрут. Согласно индивидуального тела вес разбавить соответствующие LPS дозировки до 0,1 мл PBS на мыши, а затем LPS раствор с помощью 1 мл шприц с иглой 27 G и вставляют эквивалентный объем PBS для контроля животных.
3. Держите мышей в объекте животных BSL2, который состоит из чистой клетки при соответствующей температуре.
4. 24 часа спустя, усыпить мышей с CO₂ ингаляции.
5. Выберите область, хирургические в центре мыши шеи. Сделать небольшой надрез (около 5 мм) и осторожно отделить мышцы для доступа к трахеи, используя тупой щипцы до тех пор, пока подвергается трахеи.
6. Снимать мыши бал жидкости с 10 мл стерильного шприца с иглой 27 G. Во-первых осторожно, вставить иглу в трахею и медленно вводить 1 мл стерильного PBS в трахею, а затем нарисуйте BALF в одноразовые шприц 3 мл с иглой 27 G. По завершении процедуры распоряжаться шприцев и игл в биологически опасных Шарпс контейнер.
7. Лечения хирургических инструментов с диоксидом хлора, как описано ранее, Chauret и др. ²⁷и затем стерилизовать всех хирургических инструментов путем автоклавирования 20 мин при 121 ° C.

2. Exosomes изоляции серийный ультра центрифугирования и характеристика

1. Собирайте мыши бал жидкости в 15 мл конические трубы. Урожая альвеолярных клеток, Центрифугуйте образцы на 10 мин на 1000 g, при 4 ° C.
2. Перенесите супернатант новые 15 мл конические трубы, затем Центрифугуйте образцы на 30 мин в 4000 x g при 4 ° C для удаления мусора ячейки.
3. Соберите супернатант в образцах центрифуги 60 мин в 10 000 x g при 4 ° C для удаления сотовой частицами и ультрацентрифугирования трубы.
4. Передать новые конические трубы супернатанта, а затем фильтр образцы через 0,2 мкм шприц фильтр для удаления оставшихся крупных частиц.
5. Сбор образцов в ультрацентрифуга трубы и баланс трубы. Центрифугуйте образцы на 2 ч в 140 000 x g при 4° C до Пелле exosomes.
   Примечание: Размер exosomes изменяется 20-200 Нм. 0.2 мкм фильтр используется для удаления крупных частиц, которые являются более чем 200 Нм в размер.
6. Выбросите supernatants осторожно. Растворяют гранулы с 100 мкл PBS или лизис решение и передача exosomes образцы для 1.5 мл пробирок и хранить при температуре-80 ° C до использования.
   Примечание: Просвечивающий электронный микроскоп рекомендуется проверить изолированных exosomes.
7. Следуйте стандартного образца ТЕА, обработки протокол²⁸. Анализировать образцы exosomes с помощью просвечивающей электронной микроскопии и принимать образы, шкала бар 200 Нм.

3. Подготовка Мирна и исполнительских Мирна q-RT-PCR

Примечание: Мирна q-RT-PCR рекомендуется проанализировать уровень экспрессии адаптивной.

1. Следуйте стандартным интерферирующим Протокол изоляции и убедитесь в том использовать одинаковое количество очищенной РНК в сингл стренги обратной транскрипции²⁴.
2. Следуйте стандартным реального времени протокол постановки ПЦР для выявления уровня exosomal микроРНК в BAL жидкости. Использование конкретных праймеры PCR реального времени против мир-155, мир 146А и U6 мяРНК. Запуск реакции PCR с аппаратом количественного PCR и нормализовать значения выражений для внутреннего контроля U6 мяРНК.
   Примечание: Каждая группа состоит из трех экземплярах образцы²⁴.

4. Exosomes маркировки и очистки

1. Приостановить Пелле exosomes раствором 100 мкл подвеска в 1,5 мл полипропиленовые трубы, а затем 0.4 мкл exosomes красителя в другую трубу с 100 мкл раствора подвеска.
2. Быстро добавить exosomes в растворе в раствор красителя и перемешать, закупорить. Храните образцы для 5 мин при комнатной температуре, защищать от света.
3. Положите один спин столбец exosome в трубку элюции 1,5 мл. Передача смеси решение центр столбце спина exosome.
4. Спина в столбце 2 мин на 800 x g при комнатной температуре.
5. Удалить столбец и хранить eluted образца при-20 ° C до использования.

5. Проверка Exosomes вверх, принимаемые получателями клетки

1. Семена, 1 x 10⁴ /cell MLE 12 в слайд 8-Ну камеры и культуры клеток при 37 ° C, 5% CO₂.
2. Добавьте 10 мкл люминесцентные меченых exosomes клетки. Инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
3. Удалите медиа культуры и вымыть клетки с PBS, а затем исправить клетки с 1% параформальдегида 10 минут при комнатной температуре.
4. Смонтируйте слайд в горе среде с DAPI.
5. Анализировать образцы через микроскоп флуоресценции и принимать изображения, 40 кратном.

6. Проверка взаимодействия между Exosomes и получателей клетки

1. Семенной 2 x 10⁵ MLE12/колодец в 12-ну культуры пластины, содержащие соответствующие питательной среды и культуры клеток при 37 ° C, 5% CO₂.
2. Добавить 20 мкг exosomes от мыши бал жидкости MLE12 клеток и настройка повторных измерений на экспериментальной группы.
3. 24 часа позже, вымыть клетки с PBS и добавить 600 мкл буфера lysis в колодец. Осторожно встряхнуть пластину и собирать образцы лизиса в 1,5 мл с пипеткой.
4. Следуйте стандартным всего РНК изоляции и протокола cDNA обратной транскрипции, завершить cDNA стренги одной обратной транскрипции²⁹.
5. Следуйте стандартным реального времени протокол постановки ПЦР для выявления уровня выражение mRNA в получателей клетки²⁹. Использование конкретных праймеры PCR реального времени против ФНО α, Ил-6 и ZO-1. Запустите реакций PCR с аппаратом количественного PCR и нормализовать значения выражений для внутреннего контроля GAPDH.
   Примечание: Каждая группа состоит из трех экземплярах образцов.

Результаты

Чтобы побудить септик легких травм, мышей лечили внутрибрюшинного ПЛАСТИНОК (15 мг/кг). В течение 24 ч LPS администрации нейтрофильные приток был замечен в легких, как показано на рисунке 1A. Было обращено мыши бал жидкости, следуют изоляция и очищение exosomes. ?...

Обсуждение

Модели мыши заболеваний широко используются для оценки физиологические функции конкретных генов и уменьшить стоимость экспериментов². Септик ОПЛ описанных здесь имитирует воспалительной реакции, видел в людях с ОРДС. Эта модель имеет отношение к расследованию молекуляр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich	Escherichia coli 055:B5
PBS pH7.2(1X)	Life technologies	20012-027
mirVana miRNA isolation kit	Thermo Fisher	449774
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo Fisher	4369016
mmu-miR-155 (002571) primer	Thermo Fisher	4427975
has-miR-146a (000468) primer	Thermo Fisher	4427975
U6snRNA primer	Thermo Fisher	4427975
TNF-α(Mm00443258_m1 ) primer	Thermo Fisher	4331182
IL-6 (Mm00446190_m1   )primer	Thermo Fisher	4331182
ZO-1 (Mm00493699_m1  )primer	Thermo Fisher	4331182
minimal essential medium (MEM)	Thermo Fisher	11095-072
Trysin-EDTA solution(0.05%)	Thermo Fisher	25300054
Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit	Sigma-Aldrich	MINI67-1KT
Exosome Spin Columns (MW3000)	Thermo Fisher	4484449
Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge	Beckman Coulter	L-100XP
Ultra-clear centrifuge tubes	Beckman Coulter	344058
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System	Thermo Fisher
transmission electron microscopes (TEM)	JEOL Ltd	120 kV TEM
Olympus BX41 microscope	Olympus	BX41