Alvéolaire Lavage Exosomen in Lipopolysaccharid-induzierte septischen Lungenschädigung

Zusammenfassung

Mäusen intraperitoneal LPs absondern exosomen in Broncho-alveoläre Lavage (BAL) Flüssigkeit, die mit MiRNAs verpackt sind. Ein Kokulturen-System verwenden, zeigen wir, dass exosomen veröffentlicht in der BAL-Flüssigkeit engen Kreuzung Proteinexpression in bronchialen Epithelzellen stören und Ausdruck von Pro-inflammatorischen Zytokinen, die Lungenschädigung betonen zu erhöhen.

Zusammenfassung

Akute Lungenschädigung (ALI) und akute Atemnotsyndrom (ARDS) repräsentieren eine heterogene Gruppe von Lungenkrankheiten, die nach wie vor eine hohe Morbidität und Mortalität haben. Die molekulare Pathogenese von ALI wird besser definiert; jedoch aufgrund der Komplexität der Krankheit müssen Molekulare Therapien erst noch entwickelt werden. Hier verwenden wir ein Lipopolysaccharid (LPS) induzierte Mausmodell der akuten septischen Lungenschädigung, um die Rolle der exosomen in der entzündlichen Reaktion zu beschreiben. Mit diesem Modell konnten wir zeigen, dass Mäuse, die intraperitoneale LPS ausgesetzt sind, exosomen in Broncho-alveoläre Lavage (BAL) Flüssigkeit aus der Lunge absondern, die verpackt sind, mit MiRNA und Zytokine die entzündliche Reaktion zu regulieren. Weiter mit kokultur Modellsystem, zeigen wir, dass exosomen veröffentlicht von Makrophagen engen Kreuzung Proteinexpression in bronchialen Epithelzellen stören. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass (1) Übersprechen zwischen angeborenen immun- und strukturelle Zellen durch die Exosomal pendelt beitragen, die entzündliche Reaktion und Störung der strukturelles Hindernis und (2) diese MiRNAs targeting kann eine neuartige Plattform zur Behandlung von ALI und ARDS.

Einleitung

ALI und ARDS sind die lebensbedrohliche Formen der respiratorische Insuffizienz mit schweren Hypoxämie, verursacht durch nicht-kardiogenen Lungenödem betrifft etwa 1 Million Menschen weltweit pro Jahr¹. Die Ätiologie des ARDS umfasst direkte Verletzung zu den Lungen von Infektionen oder Aspiration und eine Vielzahl von indirekten Beleidigungen. Im letzten Jahrzehnt gab es ein besseres Verständnis der molekularen Pathogenese des ARDS, gezielten Spezialbehandlungen für ARDS sind jedoch noch zu^2,3entwickelt.

Verschiedenen Tiermodellen der akuten Lungenversagen sind entwickelt worden, die eine Brücke bieten, für die Übersetzung von experimentellen Therapien auf Studien am Menschen^4,5. Häufigsten verwendeten Modelle verfügen über lokale Installation von Ölsäure, Bakterien, LPS und Bleomycin. Andere Ansätze sind Ischämie-Reperfusion, cecal Ligatur Punktion, mechanische Lüftung-induzierte Stretch Verletzungen, hyperoxie oder systemischen Verabreichung von Bakterien und LPS⁵. Diese Modelle bieten ein nützliches biologische System um klinische Hypothesen zu testen und für die Entwicklung von möglichen Therapien. Um menschliche ARDS zu simulieren, sollten Tiermodellen Entzündungen und akute Verletzung der epithelialen und endothelial Zellen mit defekten in Barriere-Funktion in der Lunge reproduzieren.

Exosomen sind membranvesikel mit 20-200 nm im Durchmesser, deren molekulare Inhalt Lipide, Proteine, DNA und RNA enthält, und Inter Mobilfunk in Gewebe Mikroumgebung über Molekulare Zusammensetzung Transfer erleichtern. Exosomen sind mehrere Arten von Zellen, wie endothelial Zellen, Epithelzellen, glatten Muskelzellen und Tumor-Zellen sezerniert und im menschlichen Körper Flüssigkeit vorhanden. Studien zeigen, dass exosomen Übersprechen zwischen Immunzellen und Stromazellen Zellen bei Infektions- und sterilen entzündlichen Erkrankungen regulieren und ihre abnorme Release erscheint durch die verschiedenen natürlichen und experimentellen Stimuli während physiologische geregelt werden und pathologische Prozesse⁶. Solchen Kommunikationsnetz kann eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Lungenerkrankungen und pathophysiologischen Fortschreiten^7,8beeinträchtigen. So 18-22 Nukleotid nicht-kodierende RNAs, MiRNAs vorhanden im Gewebe und Körperflüssigkeiten, Plasma, Serum und modulieren mRNA Expression am Post-translationalen Ebene^9,10.

Verpackte MiRNAs in exosomen zu beeinflussen, Differenzierung und Funktion von mehreren Arten von Zellen und übermässigem sind verbunden mit einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Krebs, Lungenkrankheiten, Fettleibigkeit, Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen^{11, 12,13,14,15,16}. Einstieg in den empfängerzellen und pendelt von Exosomal MiRNAs erleichtern interzelluläre Kommunikation ändern die Blutstillung Mikroumgebung^17,18. Akutes Lungenversagen ist eine komplexe Prozesse, bei denen mehrere Zelltypen mit umfangreichen interzelluläre Kommunikation durch exosomen⁸. MiR-155 und MiR-146a Teilen der gemeinsamen transkriptionelle Regulierungsmechanismus und dazu beitragen, die entzündliche Reaktion und die Immuntoleranz^19,20. Aktuelle Studien zeigen, dass sowohl entzündliche Reaktion über Exosomal MiRNAs pendeln zwischen Immunzellen²¹modulieren. Jedoch die molekularen Mechanismen, die modulierende Effekte der Exosomal MiRNAs alveoläre Reaktion auf Endotoxin bleiben unklar, zweifellos die potenzielle klinische Relevanz und Translationale Implikation Verdienst weitere Untersuchungen.

Kokultur Modelle werden eingesetzt, um die Interaktion der spezifischen Zelltypen im komplexen Umfeld, wie Entzündungen und Krebs^22,23zu definieren. Diese Plattformen bieten eine alternative Strategie zur Nebensprechen zwischen Zelltypen besonders für immun- und strukturelle Zellen zu befragen.

Intra-trachealen, Aerosol, intraperitoneal oder systemische Gabe von LPS sind weit verbreitet, experimentelle Lunge Verletzungen^24,25,26zu induzieren und haben gezeigt, dass die Durchlässigkeit von epithelialen und endotheliale induzieren Mängel. Hier verwenden wir intraperitoneale LPS, um septische Modellcharakter für die akute Lungenschädigung bei Mäusen zu induzieren. Innerhalb 24 h nach intraperitonealer Gabe von LPS induziert werden Permeabilität Defekte in der Lunge bei der Einstellung von Entzündungszellen. Darüber hinaus zeigen wir, dass exosomen aus BAL MiRNA-155 und MiR-146a enthalten, und exosomen von BAL-Flüssigkeit Pro-inflammatorischen Zytokinen Ausdruck im Empfänger Epithelzellen induzieren, wie IL-6 und TNF-α. Diese Daten sind erstmals zeigen, dass Exosomal MiRNAs sind in diesem Modell der akuten septischen Lungenschädigung in BAL abgesondert.

Protokoll

Das gesamte Protokoll erfordert 2 Tage, unter anderem am ersten Tag der Sepsis Induktion und Absonderung von BAL-Flüssigkeit aus der Tier- und am zweiten Tag exosomen Isolation von der Maus BALF. Alle Verfahren wurden überprüft und durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an Atlanta VA medical Center genehmigt.

1. akute septische Lunge Verletzungen Mausmodell

1. Verwenden Sie 6 bis 8 Wochen - alte männliche Wildtyp C57BL/6J Mäuse (20-22 g Gewicht) für das Tier zu modellieren, und führen Sie alle Verfahren mit aseptischen Techniken und Instrumente. Autoklav alle chirurgischen Instrumente, einschließlich Pinzetten und Scheren für 20 min bei 121 ° C.
2. Verteilen Sie Mäuse in experimentellen und Kontrollgruppe nach dem Zufallsprinzip. Mäuse auf eine chirurgische Board zurückhalten. Behandeln Sie Mäuse mit Escherichia coli Lipopolysaccharid (LPS, 15 mg/kg), intraperitoneale Weg. Verdünnen Sie nach dem individuellen Körpergewicht entsprechende LPS Dosierungen bis 0,1 mL PBS per Mausklick, dann injizieren Sie LPS-Lösung mit einer 1 mL Spritze mit 27 G Nadel und Spritzen Sie gleichwertigem Umfang von PBS zu Kontrolltieren.
3. Halten Sie Mäuse in der tierischen BSL2-Anlage, bestehend aus sauberen Käfigen angemessene Raumtemperatur.
4. 24 Stunden später einschläfern Mäuse mit CO₂ Einatmen.
5. Wählen Sie den OP-Bereich in der Mitte der Maus Hals. Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 5 mm) und trennen Sie vorsichtig Muskeln für den Zugriff auf die Luftröhre mit stumpfen Pinzette, bis die Luftröhre ausgesetzt ist.
6. Maus-BAL-Flüssigkeit mit 10 mL sterile Spritze mit einer 27 G Nadel zurückziehen. Zuerst sanft, Stechen Sie die Nadel in die Luftröhre und Spritzen Sie 1 mL sterile PBS langsam in die Luftröhre, dann ziehen Sie BALF in eine Einweg-Spritze 3 mL mit einer 27 G Nadel. Nach Abschluss des Verfahrens Spritzen und Nadeln im Biohazard Sharps Container entsorgen.
7. Chirurgische Instrumente mit Chlordioxid, zu behandeln, wie zuvor beschrieben von Chauret Et al. ²⁷, und Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren für 20 min bei 121 ° C.

(2) Exosomen Isolation-seriell Ultra-Zentrifugation und Charakterisierung

1. Maus-BAL-Flüssigkeit in 15 mL konische Röhrchen zu sammeln. Alveoläre Zellen ernten, Zentrifugieren Sie Proben für 10 min bei 1.000 g bei 4 ° C.
2. Übertragen Sie den überstand auf neue 15 mL konische Röhrchen, dann Zentrifugieren Sie Proben für 30 min bei 4.000 x g bei 4 ° C, Zelle Ablagerungen zu entfernen.
3. Sammeln des Überstands in Ultrazentrifuge Tuben und Zentrifuge Proben 60 min bei 10.000 x g bei 4 ° C, größere zelluläre Partikel zu entfernen.
4. Den überstand auf neue konische Rohre übertragen, dann die Proben durch 0,2 µm Spritze-Filter zu entfernen, bleiben größere Partikel zu filtern.
5. Proben in Ultrazentrifuge Rohre und Rohre zu balancieren. Zentrifugieren Sie Proben für 2 h bei 140.000 x g bei 4° C zu die exosomen Pellets.
   Hinweis: Die Größe der exosomen variiert 20-200 nm. 0,2 µm-Filter dient zur Entfernung von größerer Partikeln, die mehr als 200 nm Größe.
6. Entsorgen Sie die Überstände sanft. Das Pellet mit 100 µL PBS oder Lyse-Lösung und Transfer exosomen Proben zu 1,5 mL Röhrchen lösen und bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
   Hinweis: Transmissions-Elektronenmikroskop wird empfohlen, um isolierte exosomen zu überprüfen.
7. Folgen Sie der Standardprobe TEM Verarbeitung Protokoll²⁸. Analysieren von exosomen Proben mit Transmissions-Elektronenmikroskopie und nehmen Sie Bilder, Skala bar 200 nm.

3. Vorbereitung der MiRNA und darstellende MiRNA-Q-RT-PCR

Hinweis: MiRNA-Q-RT-PCR wird empfohlen, Ausdruck von MiRNAs analysieren.

1. Folgen Sie standard-MiRNAs Isolierung Protokoll und achten Sie darauf, eine gleiche Menge von gereinigtem RNAs in Einzel-Strang reversen Transkription²⁴.
2. Folgen Sie das Echtzeit-PCR Standardprotokoll zur Erkennung von Exosomal RNA Ebene in BAL-Flüssigkeit. Verwenden Sie spezifische Echtzeit-PCR-Primer vor MiR-155, MiR-146a und U6 SnRNA. Laufen Sie PCR-Reaktion mit dem quantitativen PCR-Gerät und Normalisieren Sie die Ausdruckswerte zur internen Kontrolle U6 SnRNA.
   Hinweis: Jede Gruppe besteht aus dreifacher Proben²⁴.

4. Exosomen Etikettier- und Reinigung

1. Aussetzen Sie exosomen Pellet mit 100 µL Aussetzung Lösung in einem 1,5 mL Polypropylen Röhrchen, dann fügen Sie 0.4 µL der exosomen Farbstoff in das andere Rohr mit 100 µL der Aussetzung-Lösung.
2. Schnell die Farbstofflösung exosomen in der Lösung hinzu und mischen Sie es gründlich durch pipettieren. Beispiele für 5 min bei Zimmertemperatur aufbewahren, vor Licht schützen.
3. Setzen Sie eine exosom Spin Spalte in einem 1,5 mL Elution Rohr. Übertragen Sie die Lösung-Mischung in die Mitte der Spalte exosom Spin.
4. Drehen Sie die Spalte für 2 min bei 800 X g bei Raumtemperatur.
5. Verwerfen Sie die Spalte und speichern Sie die eluierten Probe bei-20 ° C bis zu seiner Verwendung zu.

5. Validierung von Exosomen Up Empfängerzellen getroffenen

1. Samen Sie 1 x 10⁴ MLE 12 /cell in einem 8-Well-Kammer-Folie und Zellkulturen bei 37 ° C, 5 % CO₂.
2. Fügen Sie 10 µL Leuchtstoff-Label exosomen zu den Zellen. 1 h bei 37 ° c inkubieren
3. Entfernen Sie, Kultur, Medien und waschen Sie Zellen mit PBS, dann befestigen Sie Zellen mit 1 % Paraformaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Montieren Sie die Folie in Mount Medium mit DAPI.
5. Analysieren Sie Proben durch ein Fluoreszenzmikroskop und nehmen Sie Bilder, 40 X Vergrößerung.

6. Überprüfung der Interaktion zwischen Exosomen und Empfängerzellen

1. Samen 2 x 10⁵ MLE12/Brunnen in einer Kultur 12-Well-Platte mit geeigneten Nährmedium und Zellkulturen bei 37 ° C, 5 % CO₂.
2. MLE12 Zellen 20 µg exosomen aus Maus BAL Flüssigkeit hinzufügen und Einrichten von Wiederholungen pro Versuchsgruppe.
3. 24 h später Zellen mit PBS waschen und Hinzufügen von 600 µL Lyse Puffer in Brunnen. Schütteln Sie die Platte und Lyse Proben in 1,5 mL-Tube mit der Pipette.
4. Folgen Sie den gesamten RNA Isolierung Standardprotokoll und cDNA reversen Transkription Protokoll, vervollständigen Sie die Einzel-Strang cDNA reversen Transkription²⁹.
5. Folgen Sie Real-Time PCR Standardprotokoll zur Erkennung von mRNA Ausdruck Ebene in empfängerzellen²⁹. Verwenden Sie spezifische Echtzeit-PCR-Primer gegen TNF-α, IL-6 und ZO-1. Laufen Sie PCR-Reaktionen mit dem quantitativen PCR-Gerät und Normalisieren Sie die Ausdruckswerte der internen Kontrolle GAPDH.
   Hinweis: Jede Gruppe besteht aus dreifacher Proben.

Ergebnisse

Septische Lungenschädigung induzieren, wurden Mäuse mit intraperitonealer LPS (15 mg/kg) behandelt. Innerhalb von 24 h LPS Verwaltung wurde neutrophile Zustrom in der Lunge gesehen, wie in Figur 1Adargestellt. Maus-BAL-Flüssigkeit wurde gezogen, gefolgt von Isolierung und Reinigung der exosomen. Morphologie der BALF exosomen bestätigte Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (Abbildung 1 b).

Diskussion

Mausmodelle von Krankheiten werden üblicherweise verwendet, um die physiologische Funktion bestimmter Gene bewerten und zur Reduzierung der Kosten des Experimentierens². Die akute septische Lungenversagen beschrieben hier imitiert Entzündungsreaktion bei Menschen mit ARDS gesehen. Dieses Modell ist relevant, die molekulare Pathogenese, Entwicklung von Biomarkern zu untersuchen und mögliche neue Therapien⁵zu testen.

Kokultur Systeme sind releva...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich	Escherichia coli 055:B5
PBS pH7.2(1X)	Life technologies	20012-027
mirVana miRNA isolation kit	Thermo Fisher	449774
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo Fisher	4369016
mmu-miR-155 (002571) primer	Thermo Fisher	4427975
has-miR-146a (000468) primer	Thermo Fisher	4427975
U6snRNA primer	Thermo Fisher	4427975
TNF-α(Mm00443258_m1 ) primer	Thermo Fisher	4331182
IL-6 (Mm00446190_m1   )primer	Thermo Fisher	4331182
ZO-1 (Mm00493699_m1  )primer	Thermo Fisher	4331182
minimal essential medium (MEM)	Thermo Fisher	11095-072
Trysin-EDTA solution(0.05%)	Thermo Fisher	25300054
Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit	Sigma-Aldrich	MINI67-1KT
Exosome Spin Columns (MW3000)	Thermo Fisher	4484449
Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge	Beckman Coulter	L-100XP
Ultra-clear centrifuge tubes	Beckman Coulter	344058
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System	Thermo Fisher
transmission electron microscopes (TEM)	JEOL Ltd	120 kV TEM
Olympus BX41 microscope	Olympus	BX41