JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف لنا طريقة لتوليد جلمس-على أساس الشرطي طفرات ضربة قاضية في المنجلية استخدام تحرير الجينوم كريسبر/Cas9.

Abstract

الملاريا سببا هاما للمراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. بسبب هذا المرض، والتي تؤثر أساسا على أولئك الذين يعيشون في المناطق المدارية وشبه المدارية، الإصابة بالطفيليات المتصورة . يمكن التعجيل باستحداث أدوية أكثر فعالية لمكافحة الملاريا عن طريق تحسين فهمنا لبيولوجيا الطفيليات المعقدة هذه. المعالجة الجينية لهذه الطفيليات هو المفتاح لفهم هذه الأحياء؛ ومع ذلك، تاريخيا جينوم المنجلية كان صعباً للتلاعب. في الآونة الأخيرة، استخدمت كريسبر/Cas9 الجينوم التحرير في طفيليات الملاريا، مما يسمح للبروتين أسهل العلامات، وتوليد كنوكدوونس البروتين الشرطي، والحذف للجينات. تحرير الجينوم كريسبر/Cas9 قد ثبت أن تكون أداة قوية للمضي قدما في مجال أبحاث الملاريا. وهنا، يمكننا وصف أسلوب كريسبر/Cas9 لتوليد جلمس-على أساس مشروط طفرات ضربة قاضية في المنجلية. هذا الأسلوب القدرة على التكيف لأنواع أخرى من التلاعبات الجينية، بما في ذلك علامات البروتين والجينات بالضربة القاضية.

Introduction

الملاريا مرض مدمرة الناجمة عن الطفيليات الأوالي من جنس المتصورة. يسبب المنجلية، طفيلي الملاريا القاتل البشرية معظم، قرابة 445,000 حالة وفاة سنوياً، معظمها في الأطفال تحت سن خمس1. وقد الطفيليات المتصورة دورة حياة معقدة تشمل ناقل البعوض ومجموعة فقاريات. أولاً يصاب البشر عندما يأخذ بعوضة مصابة وجبة الدم. ثم، يغزو الطفيل الكبد حيث تنمو، وتتطور، ويقسم لمدة أسبوع تقريبا. وبعد هذه العملية، يتم إصدار الطفيليات في مجرى الدم، حيث أنها تخضع للنسخ المتماثل عديم في خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). نمو الطفيليات داخل كرات الدم الحمراء المسؤولة مباشرة عن الأعراض السريرية المرتبطة بالملاريا2.

وحتى وقت قريب، كان إنتاج المعدلة وراثيا المنجلية عملية شاقة، تشترك فيها عدة جولات من التحديد المخدرات التي استغرق شهورا عديدة، وكان معدل فشل عالية. هذا الإجراء يستغرق وقتاً طويلاً ريليسون فواصل توليد عشوائية الحمض النووي في منطقة اهتمام والقدرة الذاتية للطفيلي راب عن الجينوم على الرغم من إصلاح مثلى3،،من45،6 . في الآونة الأخيرة، تحرير الجينوم متفاوت بانتظام إينتيرسباسيد المتناوب تكرار/Cas9 (كريسبر/Cas9) بنجاح استخدمت في المنجلية7،8. الأخذ بهذه التكنولوجيا الجديدة في بحوث الملاريا كانت حاسمة للنهوض بفهم بيولوجيا هذه الطفيليات المتصورة القاتلة. كريسبر/Cas9 يسمح لاستهداف محددة من الجينات من خلال دليل الكشف (جرناس) التي مثلى للجينات للفائدة. مجمع جرنة/Cas9 تسلم الجينات من خلال جرنة، وثم يقدم Cas9 فاصل مزدوج-ستراند، مما اضطر الشروع في إصلاح الآليات في الكائن الحي9،10. لأن المنجلية يفتقر إلى إليه لإصلاح فواصل الحمض النووي من خلال الانضمام إلى نهاية غير المتجانسة، فإنه يستخدم آليات جزئ مثلى ويدمج transfected قوالب الحمض النووي مثلى لإصلاح في Cas9/جرنا-الناجم عن فاصل مزدوج-حبلا11،12.

هنا، نقدم بروتوكولا لتوليد الشرطي طفرات ضربة قاضية في المنجلية استخدام تحرير الجينوم كريسبر/Cas9. البروتوكول يوضح استخدام رايبوزيم جلمس إلى مستويات البروتين شرطيا ضربة قاضية من PfHsp70x (PF3D7_0831700)، كوصي تصدرها المنجلية إلى المضيف كرات الدم الحمراء13،14. يتم تنشيط رايبوزيم جلمس بالمعاملة مع الجلوكوزامين (والتي يتم تحويلها إلى الجلوكوزامين-6-الفوسفات في الخلايا) تنشق مرناً المرتبطة به، مما يؤدي إلى انخفاض في البروتين14. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لاستخدام أدوات أخرى ضربة قاضية المشروطة، مثل مجالات زعزعة الاستقرار أو الحمض النووي الريبي الابتامرات4،،من515. لدينا تفاصيل البروتوكول التي توليد بلازميد إصلاح تتكون من هيماغلوتينين (ها) الوسم و جلمس رايبوزيم الترميز تسلسل يحف به تسلسل مثلى إلى PfHsp70x القراءة فتح الإطار (ORF) و 3 '-UTR. كما يصف لنا جيل بلازميد الثاني محرك الأقراص في التعبير عن جرنا. هذه البلازميدات اثنين، جنبا إلى جنب مع ثالث الذي يدفع بالتعبير عن Cas9، ترانسفيكتيد في كرات الدم الحمراء وتستخدم لتعديل جينوم الطفيليات المنجلية . وأخيراً، يمكننا وصف البلمرة المتسلسل (PCR)-على أساس تقنية للتحقق من تكامل رايبوزيم العلامة و جلمس . هذا البروتوكول القدرة على التكيف لتعديل أو خروج المغلوب كاملة من أي الجينات المنجلية ، وتعزيز قدرتنا على توليد رؤى جديدة في علم الأحياء طفيل الملاريا.

Protocol

استمرار ثقافة المنجلية يتطلب استخدام كرات الدم الحمراء البشرية، وعلينا الاستفادة من الوحدات التي تم شراؤها تجارياً للدم الذي تم تجريده من كافة معرفات وتصبح مجهولة المصدر. مجلس المراجعة المؤسسية ومكتب السلامة الأحيائية في جامعة جورجيا استعرض لدينا بروتوكولات ووافق جميع البروتوكولات المستخدمة في المختبر لدينا.

1-اختيار جرنة التسلسل

  1. اذهب إلى تشوبتشوب (http://chopchop.cbu.uib.no/)، وحدد 'Fasta الهدف'. تحت 'الهدف'، قم بلصق زوج قاعدي 200 من 3 'نهاية الإطار القراءة المفتوحة (ORF) الجينات وزوج قاعدي 200 من بداية 3'-UTR هذا الجين. ضمن 'في'، حدد 'المنجلية' (7 3 v3.0)، وحدد 'كريسبر/Cas9' تحت 'استخدام'. وبعد ذلك، انقر فوق 'العثور على المواقع المستهدفة'.
  2. حدد تسلسل جرنة من الخيارات المعروضة، إعطاء الأفضلية إلى جرنة الأكثر فعالية هو الأقرب إلى موقع للتعديل والتي لديها مواقع خارج الهدف أقل.
    ملاحظة: يتم تحديد متواليات جرنة المحتملة لأنها المنبع مباشرة من بروتوسباسير المجاورة عزر (بام)، ومطلوبة من أجل تجنيد Cas9 للحمض النووي. التسلسل الذي هو مستنسخ في pMK-U6، ناقل أن يدفع التعبير جرنة، وهي أسس 20 المنبع مباشرة من بام. أم محددة المقيّحة س. Cas9 هو تسلسل النوكليوتيدات نج وأن لا يدرج في التسلسل الذي هو استنساخ إلى pMK-U6.
    ملاحظة: تشوبتشوب بصريا المرتبة في تسلسل جرنة، عرض أفضل الخيارات في الأخضر وخيارات أقل مثالية في العنبر، وأسوأ الخيارات باللون الأحمر. تشوبتشوب يعطي كل تسلسل جرنا درجة كفاءة التي يتم حسابها باستخدام المعلمات الأكثر حداثة في الأدب، وهي التنبؤ بمواقع خارج الهدف ويمكن التعرف عليه بواسطة جرنا. قد تحتاج تسلسل جرنة يومين أو ثلاثة محاولة للعثور على جرنة أفضل ملاءمة لجين معين.
  3. شراء تسلسل جرنة وملحقها العكس تنقية "التفريد جل بولياكريلاميدي" أوليجوس. يمكن الاطلاع على التسلسل جرنة المستخدمة للهدف PfHSP70x في الشكل 1B.
    ملاحظة: ينبغي أن تشمل هذه اليغو 15 أزواج قاعدة مثلى بلازميد معربا عن جرنا، التي ضرورية للتسلسل ومستقلة عن عملية ربط الاستنساخ (سليك) في مكافحة ناقلات pMK-U616.

2-استنساخ جرنة تسلسل إلى pMK-U6

  1. هضم pMK-U6 مع بتجزي.
    1. خلاصة 10 ميكروغرام لمفتاح التشفير الأصلي-U6 مع 5 ميكروليتر بتجزي إنزيم (5,000 وحدة/مل) ح 3 في 60 درجة مئوية. اتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة إنزيم لشروط رد فعل.
    2. بعد فترة الحضانة ح 3، إضافة ميكروليتر 3 إضافية من بتجزي إلى رد فعل لضمان الهضم الكامل بلازميد. هضم ل 3 ساعات إضافية، لا يزال اتباع إرشادات الشركة المصنعة لضمان شروط الرد الصحيح.
    3. لتنقية pMK هضمها-U6 من رد الفعل، استخدام أدوات تنظيف PCR المستندة إلى عمود طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة.
    4. فصل الحمض النووي هضمها استخدام 0.7% [اغروس] هلام واستخراج الفرقة زوج قاعدي 4,200.
  2. يصلب أوليجوس التي تحتوي على تسلسل جرنة.
    1. إعادة تشكيل أوليجوس تنقية صفحة إلى تركيز 100 ميكرومتر استخدام مياه خالية من نوكلياسي.
    2. الجمع بين 10 ميكروليتر من كل اليغو ميكروليتر 2.2 من المخزن المؤقت 10 x 2 (انظر الجدول للمواد). التأكد من حجم رد فعل مجموع 22.2 ميكروليتر.
    3. تشغيل جرنة الصلب البرنامج في ثيرموسيكلير: الخطوة 1:95 درجة مئوية، 10 دقيقة؛ الخطوة 2:95 درجة مئوية، 1 ق، مع انخفاض في درجة الحرارة من 0.6 ° C/دورة؛ الخطوة 3: انتقل إلى الخطوة 2، 16 مرة؛ الخطوة 4:85 درجة مئوية، 1 دقيقة؛ الخطوة 5:85 درجة مئوية، 1 ق، مع انخفاض في درجة الحرارة من 0.6 درجة مئوية/دورة؛ الخطوة 6: انتقل إلى الخطوة 5، 16 مرة؛ الخطوة 7:75 درجة مئوية، 1 دقيقة؛ خطوة 8:75 درجة مئوية، 1 ق، مع انخفاض في درجة الحرارة من 0.6 ° C/دورة؛ الخطوة 9: انتقل إلى الخطوة 8، 16 مرة. الخطوات 10 إلى 21: كرر الإجراء المتبع في الخطوات 4-9 حتى تصل درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية؛ الخطوة 22:25 درجة مئوية، 1 دقيقة.
  3. إدراج أوليجوس جرنة ملدنة بلازميد بتجزي هضمها وتنقيته جل pMK-U6.
    1. ضم 100 نانوغرام من هضم pMK-U6 مع ميكروليتر 1 من 10 × ميكروليتر المخزن المؤقت 2-1 و 3 من أوليجوس جرنا ملدنة. زيادة مستوى الصوت إلى 9.5 ميكروليتر مع المياه خالية من نوكلاس.
    2. إضافة ميكروليتر 0.5 من بوليميريز T4 واحتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة 2.5.
    3. نقل رد فعل على الجليد واحتضان لمدة 10 دقائق.
    4. فورا تحويل 5 ميكروليتر من رد الفعل إلى كولاي المختصة وفقا للإرشادات الخاصة بالمورد البكتيريا. لوحة البكتيريا في لوحات أجار ليسوجيني مرق (رطل) التي تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين.
    5. تسمح للبكتيريا المحولة لتنمو في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، ثم حدد المستعمرات واستخراج الحمض النووي مع مجموعة مينيبريب بلازميد متاحة تجارياً.

3-تصميم مناطق التماثل لإصلاح القالب

  1. تصميم درع الطفرات ضمن قالب إصلاح التماثل لمنع إعادة قطع من الحمض النووي التي يتم دمجها في الجينوم.
    ملاحظة: طفرة درع يتكون عادة من إدخال طفرة صامت إلى تغيير في بام حيث أن Cas9 لا يحدث انقطاع في قالب إصلاح. مطلوب بام Cas9 المستخدمة في هذا البروتوكول هو تسلسل النوكليوتيدات "نج"، حيث "N" هو أي النوكليوتيدات. إذا كان ذلك ممكناً، قم بتغيير أحد النيوكليوتيدات G إلى A، C، أو ت.
    1. إذا كان لا يمكن أن تحور بصمت بام، استحداث الطفرات صامتة على الأقل من 2 إلى 6 أزواج قاعدة المتاخمة مباشرة إلى7،بام8.
      ملاحظة: سيتم منع الاعتراف بإصلاح القالب بجرنا هذه الطفرات ومنع إعادة قطع محور إصلاح طريق Cas9/جرنا المعقدة. ويمكن إدخال طفرات الدرع إلى منطقة التماثل بتضخيم الحمض النووي مع الإشعال تحتوي على الطفرة.
  2. تضخيم المنطقة ORF التماثل لإصلاح القالب.
    1. استخدام PCR، تضخيم 800 قاعدة أزواج من 3 ' نهاية ORF الجينات المستهدفة. تصميم الإشعال التي سيتم استخدامها لاستبعاد كودون التوقف من هذا أمبليكون.
    2. تصميم الإشعال لإدخال هذا amplicon إلى فا-جلمس التي قد تم هضمها مع ساسيي وافتتاح من خلال رد فعل ربط الحمض النووي أو سليك16.
  3. تضخيم المنطقة 3 '-UTR التماثل لإصلاح القالب.
    1. استخدام PCR، تضخيم أزواج قاعدة 800 فور كودون التوقف من الجينات المستهدفة. تصميم كبسولة تفجير لإدخال هذا amplicon إلى فا-جلمس التي قد تم هضمها مع هنديي وني من خلال رد فعل ربط الحمض النووي أو سليك16.
      ملاحظة: الارتفاع في محتوى الجينوم المنجلية يمكن جعل تضخيم مناطق مثل تحيلها صعبة. وثمة نهج بديل لاستخدام PCR هو توليف مناطق التماثل.

4-استنساخ مناطق التماثل في بلازميد إصلاح

  1. إدراج منطقة التماثل ORF فا-جلمس.
    1. هضم فا-جلمس مع ساسي وافتتاح، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة الإنزيم. إدراج المنتج بكر المنطقة التماثل ORF بلازميد هضمها استخدام SLIC16.
    2. تحويل إلى المختصة كولاي كما يؤديها في الخطوات 2.3.4 و 2.3.5.
  2. إدراج منطقة التماثل 3 '-UTR جلمس فا بلازميد يحتوي بالفعل منطقة التماثل ORF (راجع الخطوة 4، 1).
    1. هضم بلازميد مع هنديي وني وفقا لإرشادات الشركة المصنعة الإنزيم. إدراج amplicon المنطقة التماثل 3 '-UTR بلازميد هضمها استخدام SLIC16.
    2. تحويل إلى المختصة كولاي واستخراج بلازميد الحمض النووي (الخطوات 2.3.4 و 2.3.5).

5-التعجيل بالحمض النووي تعداء

  1. إضافة 40 ميكروغرام في كل من مفتاح التشفير الأصلي-U6، pUF1-Cas9، وفا-جلمس الحمض النووي (لما مجموعة 120 ميكروغرام من الحمض النووي) في أنبوب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل.
  2. أضف 1/10 حجم الحمض النووي خلات الصوديوم 3 أمتار في الماء (pH 5.2) للأنبوب ومزجها جيدا باستخدام دوامة (على سبيل المثال، إذا كانت وحدة التخزين في الخطوة 5، 1 100 ميكروليتر، إضافة 10 ميكروليتر من خلات الصوديوم).
  3. إضافة أوقات 2.5 حجم الإيثانول 100% للأنبوب ومزجها جيدا باستخدام دوامة لمالا يقل عن 30 ثانية (مثلاً، إذا كانت وحدة التخزين في 5.1 100 ميكروليتر، إضافة 250 ميكروليتر من الإيثانول 100%).
  4. ضع الأنبوب على الجليد أو في-20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. الطرد المركزي الأنبوب في س 18,300 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  6. بعناية إزالة المادة طافية من الأنبوب. عدم الإزعاج بيليه.
  7. إضافة 3 مرات حجم الإيثانول 70% إلى الأنبوب ومزجها بإيجاز استخدام دوامة (على سبيل المثال-، إذا كانت وحدة التخزين في 5.1 100 ميكروليتر، إضافة 300 ميكروليتر من الإيثانول 70%).
  8. الطرد المركزي الأنبوب في س 18,300 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة تحت ظروف معقمة في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء.
  9. بعناية إزالة المادة طافية من الأنبوب. عدم الإزعاج بيليه. اترك الأنبوب مفتوحاً والسماح لبيليه أيردري لمدة 15 دقيقة.
  10. تخزين الحمض النووي سرع في-20 درجة مئوية إلى حين الحاجة إليها تعداء.

6-عزل البشرية كرات الدم الحمراء من الدم كله استعدادا تعداء

  1. الكوة دماء جديدة في أنابيب مخروطية العقيمة 50 مل (حوالي 25 مل في الأنبوب).
  2. الطرد المركزي هذه الأنابيب في س 1,088 ز لمدة 12 دقيقة، مع الفرامل الطرد المركزي تعيين إلى 4.
  3. نضح قبالة معطف طافية وبافي قاتلة. ريسوسبيند بيليه ربك مع حجم متساوية من ربمي غير مكتملة.
    ملاحظة: تعد ربمي ناقصة المكمل RPMI 1640 مع 10.32 ميكرو thymidine 110.2 ميكرومترات hypoxanthine، بيروفات صوديوم 1 مم، وبيكربونات الصوديوم 30 ملم، 5 مم هيبيس، الجلوكوز 11.1 ملم والجنتاميسين 0.02% (v/v).
  4. كرر الخطوات من 6، 2 – 6.3 مرتين. بعد الغسيل الأخير، ريسوسبيند كرات الدم الحمراء في وحدة تخزين متساوية من ربمي غير مكتملة وتخزين الأنابيب عند 4 درجة مئوية.

7-ترانسفيكتينج كرات الدم الحمراء مع البلازميدات كريسبر/Cas9 (القيام به أسيبتيكالي)

ملاحظة: يتم الاحتفاظ بالثقافات المنجلية كما هو مبين في تقارير أخرى17. الحفاظ على جميع الثقافات في 37 درجة مئوية تحت 3% O2و 3% CO2و 94% N2 ما لم ينص على خلاف ذلك. كلما تم استخدام الدم في هذا البروتوكول، فإنه يشير إلى خلايا الدم الحمراء النقية إعدادها في الخطوة 6. يجب أن لا تزيد أعمارهم عن 6 أسابيع، الدم المستخدمة كما يوجد عادة انخفاضا في انتشار الطفيليات في الدم كبار السن. تصف الخطوات التالية قبل تحميل كرات الدم الحمراء مع الحمض النووي وإضافة ثقافة طفيلي بالخلايا ترانسفيكتيد. بروتوكولات تعداء ثابتة أخرى متوافقة مع ترانسفيكتينج هذه بنيات18،19.

  1. إعداد المخزن مؤقت x cytomix 1 في الماء (120 مم بوكل، 0.15 مم كاكل2, 2 مم عطا، 5 مم مجكل2، 10 مم ك2مكتب البراءات الهنغاري4، 25 مم حبيس، درجة الحموضة 7.6). عامل التصفية-تعقيم المخزن المؤقت باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
  2. إضافة ميكروليتر 380 من سيتوميكس س 1 للحمض النووي عجلت في الخطوة 5، ودوامه حل. السماح للحمض النووي تذوب في سيتوميكس س 1 لمدة 10 دقائق، فورتيكسينج كل دقيقة 3 ل 10 ق.
  3. في أنبوب مخروطي عقيمة 15 مل، ضم 300 ميكروليتر من كرات الدم الحمراء (50% الهيماتوكريت، من الخطوة 6) في ربمي غير كاملة مع 4 مل سيتوميكس س 1.
  4. الطرد المركزي في كرات الدم الحمراء من الخطوة 7.3 في 870 x ز لمدة 3 دقائق، ثم قم بإزالة المادة طافية من بيليه ربك.
  5. ريسوسبيند بيليه ربك مع مزيج الحمض النووي/سيتوميكس من الخطوة 6.2 ونقل إلى ومبومو انهانسر 0.2 سم.
  6. اليكتروبوراتي كرات الدم الحمراء باستخدام الشروط التالية: 0.32 كيلو فولت، μF 925، السعة تعيين إلى "الباب العالي"، والمقاومة وتعيين إلى "لانهائية".
  7. بعد انهانسر، نقل المحتويات من ومبومو إلى 15 مل المخروطية التي تحتوي على 5 مل من ربمي كاملة (كربمي). الطرد المركزي الأنبوب في 870 x ز لمدة 3 دقائق في 20 درجة مئوية، ومن ثم صب المادة طافية.
    ملاحظة: على استعداد كربمي عن طريق نفس الأسلوب ربمي غير مكتملة بالإضافة إلى 0.25% (w/v) الغنية بالدهون ألبومين المصل البقري.
  8. ريسوسبيند بيليه في 4 مل كربمي ونقل إلى بئر واحدة في لوحة زراعة الأنسجة 6-جيدا. إضافة 400 ميكروليتر من ثقافة عالية-شيزونت (7-10% شيزونت تطفلن مثالي) لكرات الدم الحمراء ترانسفيكتيد.
    ملاحظة: يتم تعريف تطفلن كنسبة مئوية من كرات الدم الحمراء المصابة بالطفيلي.
  9. وفي اليوم التالي يغسل الثقافة مع 4 مل كربمي. الطرد المركزي الثقافة في 870 x ز لمدة 3 دقائق ونضح المادة طافية. ريسوسبيند الثقافة في 4 مل كربمي.
  10. 48 ساعة بعد الانتهاء من الخطوة 7، 6، يغسل الثقافة مع 4 مل كربمي. ثم ريسوسبيند الثقافة في كربمي الذي يحتوي على 1 ميكرومتر DSM1 لتحديد أجل بلازميد Cas9.
  11. يستمر غسل الثقافات كل يوم مع كربمي حتى الطفيليات لم تعد مرئية بمسحه الدم. بعد هذه النقطة، يستعاض عن المتوسط الثقافة مع كربمي جديدة بالإضافة إلى 1 ميكرومتر DSM1 كل 48 ساعة.
    1. جعل دم مسحه، "الماصة؛" ميكروليتر 150 من الثقافة في أنبوب الطرد مركزي 0.6 مل. بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في س 1,700 ز لمدة 30 ثانية.
    2. نضح قبالة المادة طافية. استخدام ماصة نقل الخلايا الأعلاف إلى شريحة زجاج. استخدام شريحة زجاج ثاني المعقود بزاوية 45 درجة للشريحة الأولى، تشويه الحبرية الدم. وصمة عار شريحة باستخدام مجموعة أدوات المصبوغة متاحة تجارياً وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    3. عرض الطفيليات استخدام 100 × النفط الغمر الهدف.
  12. ابتداء من 5 أيام بعد تعداء (الخطوة 7.6)، إزالة 2 مل الثقافة مع كرات الدم الحمراء حراكه في الأجلين المتوسط والثقافة. إضافة مرة أخرى مل 2 متوسطة جديدة (كربمي بالإضافة إلى 1 ميكرومتر DSM1) والدم في الهيماتوكريت 2%. إضافة دماء جديدة بهذه الطريقة مرة واحدة في أسبوع حتى ظهور الطفيليات، كما يحددها لطاخة الدم رقيقة (الخطوة 7، 11).
    ملاحظة: إذا كان التكامل الناجح، الطفيليات عموما تعود إلى الظهور في الثقافة من تعداء بعد شهر واحد.
  13. عندما يعاود الطفيليات، إزالة الضغط DSM1 المخدرات. وبدلاً من ذلك، إزالة الضغط المخدرات بعد قد تم استنساخ الطفيليات خارجاً.

8-فحص الطفيليات للتكامل لإصلاح القالب

  1. عندما الطفيليات تكون مرئية مرة أخرى عن طريق تشويه الدم رقيقة، عزل الحمض النووي من الثقافة باستخدام مجموعة مناسبة.
  2. استخدام PCR لتضخيم المنطقة المعدلة للجينوم لتحديد إذا تم تغيير المكان المستهدف بنجاح، وإذا كان موضع البرية من نوع غير معدلة (يدل على البرية من نوع الطفيليات) قابلاً للاكتشاف.
    1. للكشف عن الطفيليات التي أدمجت إصلاح القالب، استخدم تمهيدي إلى الأمام أن يجلس في بداية ORF، خارج المنطقة التماثل المستنسخة. استخدام عكس تمهيدي أن يجلس في 3 '-UTR.
      ملاحظة: كما يشمل هذا التضخيم في تسلسل العلامات هكتار ورايبوزيم جلمس ، سيكون أطول من نفس المنطقة تضخيمه في البرية من نوع الطفيليات أمبليكونس من الطفيليات المتكاملة.

9-استنساخ الطفيليات عن طريق الحد من التخفيف

  1. إجراء تخفيف المسلسل ثقافة الطفيلي من الخطوة 7.13 لتحقيق تركيز 0.5 الطفيليات/200 ميكروليتر نهائية. إضافة 200 ميكروليتر من ثقافة المخفف لآبار طبق استنبات الأنسجة 96-جيدا.
    ملاحظة: نظراً لأن تطفلن يعرف بأنه النسبة المئوية لكرات الدم الحمراء المصابة والهيماتوكريت أيضا عدد محدد (2 في المائة)، بسهولة يتم الاستدلال عدد الطفيليات في وحدة التخزين.
    1. إعداد 1 مل ثقافة في كربمي في الهيماتوكريت تطفلن و 2% 5% (هذه المستويات تطفلن والهيماتوكريت، يتضمن الثقافة 1 × 107 الطفيليات مليلتر).
    2. تمييع هذه الثقافة 1: 100 مع كربمي. تمييع 1: 100 مع كربمي مرة أخرى.
    3. تمييع 1: 400. أداء هذا التخفيف بإضافة ميكروليتر 62.5 الثقافة إلى 25 مل من كربمي و 1 مل من الدم. وينتج هذا التخفيف المطلوب تركيز 0.5 الطفيليات/200 ميكروليتر.
  2. الحفاظ على اللوحة الاستنساخ حتى الطفيليات قابلة للاكتشاف في الآبار.
    1. استبدال كل ح 48، المتوسطة في لوحة 96-جيدا مع متوسطة جديدة.
    2. مرة كل أسبوع، ابتداء من 5 أيام بعد بداية لوحة الاستنساخ (الخطوة 9.1)، إزالة 100 ميكروليتر من كل بئر وإضافة الخلف 100 ميكروليتر متوسطة جديدة + الدم (الهيماتوكريت 2%).
  3. تحديد أي الآبار التي تحتوي على الطفيليات.
    1. مكان لوحة 96-جيدا بزاوية 45 درجة لمدة 20 دقيقة تقريبا، مما يسمح الدم لتستقر عند زاوية داخل اللوحة.
    2. ضع لوحة 96-جيدا على مربع ضوء. لاحظ أن الآبار التي تحتوي على الطفيليات تحتوي على وسائل الإعلام أن يكون أصفر اللون، مقارنة بوسائل الإعلام الوردي الآبار خالية من الطفيليات، وسبب تحمض المتوسط بالطفيليات.
    3. استخدام ماصة مصلية، نقل محتويات الآبار المحتوية على الطفيلي لصفيحة زراعة الأنسجة 24-جيدا للسماح بالتوسع تطفلن.
    4. باستخدام تحليل PCR كما هو موضح في الخطوة 8، تحقق من هذه الخطوط الطفيلي الاستنساخ للتكامل الصحيح.

10-ضربة قاضية للبروتين بعلاج الطفيليات مع الجلوكوزامين وتأكيد عن طريق تحليل لطخة غربية

  1. إعداد حل أسهم GlcN (الجلوكوزامين) 0.5 م، التي يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية.
  2. إضافة GlcN إلى ثقافات الطفيلي جلمس والسماح لها بالنمو حضور GlcN.
    ملاحظة: أن التركيز النهائي وتوقيت العلاج GlcN يعتمد على خط التجربة والطفيلي. يمكن أن تؤثر GlcN النمو الطفيلي، حيث ينبغي أن تتعرض سلالة الطفيلي الأبوية لتركيزات تتراوح من GlcN لتحديد حساسيتها للمجمع. في كثير من الأحيان، هو تركيز 2.0-7.5 ملم GlcN تستخدم13،،من1420.
  3. عزل بروتين عينات الطفيليات تعامل GlcN13.
  4. استخدام البروتين في عينات لتحليل لطخة غربية للكشف عن تخفيضات في البروتين13.
    1. استخدام جسم ها المضادة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة للكشف عن البروتين هكتار-جلمس-معلم. مقارنة الفرقة هكتار إلى عنصر تحكم تحميل، مثل PfEF1α.

النتائج

تخطيطي من البلازميدات المستخدمة في هذا الأسلوب، فضلا عن مثال من طفرة درع مبينة في الشكل 1. كمثال على كيفية التعرف على الطفيليات المسخ بعد تعداء، تظهر النتائج من تقارير إتمام المشروعات للتحقق من تكامل بنيةجلمس هكتار-في الشكل 2. صورة تم?...

Discussion

تنفيذ كريسبر/Cas9 في المنجلية على حد سواء إلى زيادة الكفاءة وانخفض مقدار الوقت اللازم لتعديل الجينوم الطفيلي، مقارنة بالأساليب السابقة من التلاعب بالجينات. هذا بروتوكول شامل يحدد الخطوات اللازمة لتوليد طفرات مشروطة باستخدام كريسبر/Cas9 في المنجلية. بينما الأسلوب هنا موجهة خصيصا ل?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونحن نشكر كانداسامي موثوجاباتي لب مجهرية جامعة جورجيا (UGA) "الطب الحيوي" للمساعدة التقنية، وخوان خوسيه لوبيز-روبيو لتقاسم والبلازميدات pUF1-Cas9 و pL6. هذا العمل كان تدعمها مؤسسة أقواس، جوائز إلى D.W.C. وإلى H.M.K.، منح أموال بدء التشغيل UGA، منح من "آذار/مارس من الدايمات مؤسسة" (اسيل أوكونور كاتب جائزة البحث الباحث) إلى عين، ولنا المعاهد الوطنية للصحة (R00AI099156 و R01AI130139) إلى عين و (T32AI060546) إلى H.M.K.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad1652660
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad165-2086We buy the ones that are individually wrapped
Sodium AcetateSigma-AldrichS2889-250g
DSM1Gift from Akhil Vaidya labGanesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34
TPP Tissue Culture 6 Well PlatesMIDSCITP92006
TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate)MIDSCITP93100
TPP Tissue Culture 96 Well PlatesMIDSCITP92096
TPP Tissue Culture 24 Well PlatesMIDSCITP92024
NEBuffer 2New England Biolabs#B7002S
NEBuffer 2.1New England Biolabs#B7202S
BtgZINew England Biolabs#R0703L
SacIINew England Biolabs#R0157L
HindIII-HFNew England Biolabs#R3104S
Afe1New England Biolabs#R0652S
Nhe1-HFNew England Biolabs#R3131L
T4 DNA PolymeraseNew England Biolabs#M0203S
500 mL Steritop bottle top filter unitMilliporeSCGPU10REYou can use any size that fits your needs
EGTASigmaE4378-100G
KClSigma-AldrichP9333-500g
CaCl2Sigma-AldrichC7902-500g
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100g
K2HPO4FisherP288-500
HEPESSigma-AldrichH4034-500g
pMK-U6Generated by the Muralidharan Labn/a
pHA-glmSGenerated by the Muralidharan Labn/a
pUF1-Cas9Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio LabGhorbal et al. Nature Biotech 2014
GlucoseSigma-AldrichG7021-1KG
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761-500G
Sodium pyruvateSigma-AldrichP5280-100G
HypoxanthineSigma-AldrichH9636-25g
Gentamicin ReagentGibco15710-064
ThymidineSigma-AldrichT1895-1G
PL6-eGFP BSDGenerated by the Muralidharan Lab
Puf1-cas9 eGFP gRNAGenerated by the Muralidharan Lab
NucleoSpin Gel and PCR Clean-upMacherey-Nagel740609.250
Albumax ILife TechnologiesN/AYou will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best
Human Red Blood CellsInterstate Blood Bank, IncEmail or call them directly for orderingWe typically use O+ blood
3D7 parasite lineAvailable upon requestN/A
Lysogeny Broth (LB)FisherBP1426-2You can make your own, it is not necessary to use exactly this
AmpicilinFisherBP1760-25We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C
AmpicilinClonetechR050A
Anti-EF1alphaDr. Daniel Goldberg's LabWashington University in St. LouisYou can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory
Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonalMade by Roche, sold by Sigma11867423001You can use your preferred anti-HA antibody
0.6 mL tubesFisherAB0350
Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II)Fisher22-122-911You can also use giemsa stain
Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in.Fisher12-544-3

References

  1. World Health Organization. . World Malaria Report. , (2017).
  2. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
  3. Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
  4. Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310 (2012).
  5. Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
  6. Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
  7. Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
  8. Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
  9. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  10. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  11. Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
  12. Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
  13. Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
  14. Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).
  15. Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727 (2016).
  16. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  17. Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
  18. Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
  19. Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
  20. Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
  21. Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
  22. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
  23. Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).
  24. Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
  25. Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).
  26. Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
  27. Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
  28. Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
  29. Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
  30. Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
  31. Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
  32. Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
  33. Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

139

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved