JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Se describe un método para la generación de MLG-base condicionales mutantes precipitación usando CRISPR/Cas9 edición del genoma del falciparum del Plasmodium .

Resumen

La malaria es una causa significativa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Esta enfermedad, que afecta sobre todo a los que viven en regiones tropicales y subtropicales, es causada por infección con los parásitos Plasmodium . El desarrollo de medicamentos más eficaces para combatir la malaria puede acelerarse mediante la mejora de nuestra comprensión de la biología de este parásito complejo. Manipulación genética de estos parásitos es clave para entender su biología; sin embargo, el genoma de p. falciparum ha sido históricamente difícil de manipular. Recientemente, CRISPR/Cas9 edición del genoma ha sido utilizada en parásitos de la malaria, permitiendo para la proteína más fácil etiquetado, generación de caídas de proteína condicional y canceladura de los genes. La edición del genoma CRISPR/Cas9 ha demostrado para ser una poderosa herramienta para avanzar en el campo de la investigación de la malaria. Aquí, describimos un método CRISPR/Cas9 para generar MLG-base de mutantes condicionales precipitación en p. falciparum. Este método es altamente adaptable a otros tipos de manipulaciones genéticas, incluyendo proteína etiquetado y golpes de gracia del gene.

Introducción

La malaria es una enfermedad devastadora causada por parásitos protozoarios del género Plasmodium. P. falciparum, el parásito del paludismo humano mortal más, hace aproximadamente 445.000 muertes por año, sobre todo en niños menores de cinco1. Plasmodium parásitos tienen un ciclo de vida complicado con un vector mosquito y un hospedador vertebrado. En primer lugar los seres humanos se infectan cuando un mosquito infectado toma una comida de sangre. Luego, el parásito invade el hígado donde crece, se desarrolla y se divide por aproximadamente una semana. Después de este proceso, los parásitos se liberan en el torrente sanguíneo, donde se someten a la replicación asexual en células de sangre rojas (RBCs). Crecimiento de los parásitos en los glóbulos rojos son directamente responsables de los síntomas clínicos asociados con la malaria2.

Hasta hace poco, producción de transgénicos por p. falciparum fue un proceso laborioso, que implica varias rondas de selección de la droga que tomó muchos meses y tenían una tasa alta de fracaso. Este procedimiento desperdiciador de tiempo relieson la generación de DNA al azar rompe en la región de interés y la capacidad endógena del parásito para reparar su genoma aunque reparación homóloga3,4,5,6 . Recientemente, agrupadas regularmente otro palindrómico Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) edición del genoma ha sido exitosamente utilizada en p. falciparum7,8. La introducción de esta nueva tecnología en la investigación de la malaria ha sido fundamental para el avance de la comprensión de la biología de estos parásitos Plasmodium mortales. CRISPR/Cas9 permite la focalización específica de genes a través de guía RNAs (gRNAs) que son homólogos a los genes de interés. El gRNA/Cas9 complejo reconoce el gen por el gRNA y Cas9 introduce entonces una rotura de doble cadena, obligando a la iniciación de los mecanismos de reparación en el organismo9,10. Porque p. falciparum carece de la maquinaria para reparar roturas de DNA por unirse a final no homóloga, que utiliza mecanismos de recombinación homóloga e integra plantillas de ADN homólogas transfected para reparar el Cas9 gRNA-inducido rotura de doble cadena11,12.

Aquí, presentamos un protocolo para la generación de mutantes condicionales precipitación en p. falciparum usando CRISPR/Cas9 edición del genoma. El protocolo muestra el uso de la ribozima MLG a niveles de proteína condicional precipitación de PfHsp70x (PF3D7_0831700), un acompañante exportadas por p. falciparum en host gr13,14. La ribozima MLG es activado por el tratamiento con glucosamina (que se convierte en la glucosamina-6-fosfato en las células) para hender su mRNA asociados, llevando a una reducción de la proteína14. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para utilizar otras herramientas de precipitación condicionales, como dominios de desestabilización o RNA aptámeros4,5,15. Nuestros detalles del protocolo la generación de un plásmido de reparación que consta de un ribozima de etiqueta y glmS de hemaglutinina (HA) secuencia flanqueada por secuencias de codificación son homólogas a las PfHsp70x marco abierto de lectura (ORF) y 3'-UTR. También se describe la generación de un segundo plásmido de expresión de la unidad de la gRNA. Estos dos plásmidos, junto con un tercero que conduce la expresión de Cas9, transfected en glóbulos rojos y sirve para modificar el genoma de p. falciparum parásitos. Por último, se describe una reacción en cadena de polimerasa (polimerización en cadena)-basado en la técnica para verificar la integración de la etiqueta y glmS ribozyme. Este protocolo es altamente adaptable para la modificación o completo octavos de final de cualquier genes de p. falciparum , mejorar nuestra capacidad de generar nuevos conocimientos sobre la biología del parásito de la malaria.

Protocolo

Continua el cultivo de p. falciparum requiere el uso de glóbulos rojos humanos, y se utilizaron comercialmente compradas unidades de sangre que fueron despojados de todos los identificadores y anonimizada. La Junta de revisión institucional y la oficina de seguridad de la biotecnología en la Universidad de Georgia revisaron nuestros protocolos y aprobaron todos los protocolos utilizados en nuestro laboratorio.

1. elegir un gRNA secuencia

  1. Ir a CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) y seleccione ' Fasta Target'. En 'Target', pegar los 200 pares de bases del extremo 3' del marco de lectura abierto (ORF) de un gen y 200 pares de bases desde el inicio de 3'-UTR de la gene. En 'En', seleccione 'P. falciparum' (3 7 v3.0) y seleccione ' CRISPR/Cas9 ' bajo 'Uso'. A continuación, haga clic en ' buscar sitios de destino '.
  2. Seleccionar una secuencia de gRNA de las opciones presentadas, dando preferencia a la gRNA más eficiente que es la más cercana al sitio de modificación y que tiene los sitios objetivo menor.
    Nota: Las secuencias gRNA potencial se identifican porque son inmediatamente aguas arriba de un motivo adyacente Protospacer (PAM), que se requiere para contratación de Cas9 al ADN. La secuencia que se clona en pMK-U6, el vector que impulsa a la expresión de gRNA, es las 20 bases inmediatamente aguas arriba del PAM. El PAM específico para S. pyogenes Cas9 es la secuencia de nucleótido NGG y no debe incluirse en la secuencia que se clona en pMK-U6.
    Nota: CHOPCHOP visualmente alinea las secuencias gRNA, mostrando las mejores opciones en verde, las opciones menos ideales en ámbar y las peores opciones en rojo. CHOPCHOP da cada secuencia de gRNA una puntuación de eficiencia que se calcula utilizando los parámetros más actualizados encontrados la literatura, y predicen sitios fuera del objetivo que podrían ser reconocidos por el gRNA. Dos o tres secuencias de gRNA deba ser intentó encontrar la gRNA mejor adaptada a un gen determinado.
  3. Comprar la secuencia gRNA y su complemento reverso como oligos purificada de electroforesis en Gel de poliacrilamida. La secuencia de gRNA usada a PfHSP70x de destino puede encontrarse en la figura 1B.
    Nota: Este oligo debe incluir 15 pares de bases homólogas para el plásmido de expresión de gRNA, que son necesarios para la secuencia y la independiente de la ligadura de clonación (SLIC) en el pMK-U6 vector16.

2. clonación de la gRNA secuencia en pMK-U6

  1. Digerir el pMK-U6 con BtgZI.
    1. Recopilación de 10 μg de pMK-U6 con 5 μL de la enzima BtgZI (5.000 unidades/mL) durante 3 h a 60 ° C. Seguir el protocolo del fabricante de la enzima para condiciones de reacción.
    2. Después del período de incubación de 3 h, agregar un adicional 3 μL de BtgZI a la reacción para asegurar la digestión completa del plásmido. Digerir un adicional 3 h, siguiendo las instrucciones del fabricante para garantizar las condiciones de reacción correcta.
    3. Para purificar el pMK-U6 digerido de la reacción, utilizar un kit de limpieza PCR basada en la columna según las instrucciones del fabricante.
    4. Separar el ADN digerido con un gel de agarosa de 0,7% y extracto de la banda de 4.200-pares.
  2. Templar los oligos que contiene la secuencia de gRNA.
    1. Reconstituir los oligos purificada de página a una concentración de 100 μM con agua libre de nucleasa.
    2. Combinar 10 μL de cada oligo con 2,2 μL de 10 x tampón 2 (véase Tabla de materiales). Asegúrese de que el volumen total de reacción es 22.2 μL.
    3. Ejecutar el gRNA recocido programa en un termociclador: paso 1: 95 ° C, 10 minutos; Paso 2: 95 ° C, 1 s, con una reducción de temperatura de 0.6 ° C/ciclo; Paso 3: vaya al paso 2, 16 veces; Paso 4: 85 ° C, 1 min; Paso 5: 85 ° C, 1 s, con una reducción de temperatura de 0,6 ° C/ciclo; Paso 6: ir al paso 5, 16 veces; Paso 7: 75 ° C, 1 min; paso 8: 75 ° C, 1 s, con una reducción de temperatura de 0.6 ° C/ciclo; Paso 9: vaya al paso 8, 16 veces. Pasos 10 a 21: Repita el procedimiento utilizado en los pasos 4-9 hasta que la temperatura alcanza los 25 ° C; Paso 22:25 ° C, 1 min.
  3. Inserte los oligos gRNA recocido en el plásmido BtgZI-digerido y purificaron por gel de pMK-U6.
    1. Combinar 100 ng de pMK-U6 digerido con 1 μL de 10 x tampón 2.1 y 3 μL de oligos de gRNA recocido. Aumentar el volumen a 9,5 μL con agua libre de nucleasa.
    2. Añadir 0,5 μL de polimerasa T4 e incubar la reacción a temperatura ambiente durante 2,5 min.
    3. Mueva la reacción del hielo e incubar durante 10 minutos.
    4. Inmediatamente transformar 5 μL de la reacción en competentes de e. coli según las instrucciones del proveedor de bacterias. La placa de las bacterias en placas de agar caldo de lisogenia (LB) que contiene 100 μg/mL de ampicilina.
    5. Permitir que las bacterias transformadas crecen a 37 ° C durante la noche, luego seleccionar colonias y extraer ADN con un kit de miniprep de plásmidos disponibles comercialmente.

3. diseño de las regiones de la homología de la plantilla de reparación

  1. Diseño escudo mutaciones dentro de la plantilla de homología reparación para evitar que vuelva a cortar el ADN que se integra en el genoma.
    Nota: Una mutación del escudo por lo general consiste en introducir una mutación silenciosa para alterar el PAM para que Cas9 no inducirá una rotura en la plantilla de reparación. El PAM requerido para la Cas9 utilizado en este protocolo es la secuencia de nucleótidos "NGG", donde "N" es cualquier nucleótido. Si es posible, uno de los nucleótidos G cambiar una A, C o T.
    1. Si el PAM no puede ser transformado en silencio, introducir al menos 2 mutaciones silenciosas en los 6 pares de base directamente adyacentes a la PAM7,8.
      Nota: Estas mutaciones evitar el reconocimiento de la plantilla de reparación por el gRNA y evitar que vuelva a cortar el locus reparado por Cas9/gRNA complejo. Las mutaciones de escudo pueden introducirse en la región de homología amplificando el ADN con las cartillas que contienen la mutación.
  2. Amplificar la región de homología ORF de la plantilla de reparación.
    1. Mediante PCR, amplificación 800 pares de bases del extremo 3' del ORF del gen objetivo. Diseño de los cebadores que se utilizará para excluir el codón de este amplicón.
    2. Diseño de los cebadores para la inserción de este amplicón en el pHA -MLG que ha sido digerido con SacII y AfeI a través de una reacción de ligadura de ADN o SLIC16.
  3. Amplificar la región de homología 3'-UTR de la plantilla de reparación.
    1. Mediante PCR, amplificar los 800 pares de bases, inmediatamente después del codón de parada del gen objetivo. Diseño de cebadores para la inserción de este amplicón en el pHA -MLG que ha sido digerido con HindIII y NheI a través de una reacción de ligadura de ADN o SLIC16.
      Nota: El alto contenido del genoma de p. falciparum puede dificultar la amplificación de regiones como NC. Un enfoque alternativo al uso de PCR está sintetizando las regiones de homología.

4. clonación de regiones de homología en el plásmido de reparación

  1. Insertar la región de homología ORF en el pHA -MLG.
    1. Digerir la pHA -MLG con SacII y AfeI, según instrucciones del fabricante de la enzima. Inserte el producto PCR de región de homología ORF en el plásmido digerido con SLIC16.
    2. Transformar en competentes de e. coli , se realiza en pasos de 2.3.4 y 2.3.5.
  2. Insertar la región de homología 3'-UTR en un plásmido de pHA-MLG que ya contiene la región de homología ORF (ver paso 4.1).
    1. Digerir el plásmido con HindIII y NheI según instrucciones del fabricante de la enzima. Inserte el amplicon de región 3'-UTR homología plásmido digerido con SLIC16.
    2. Transformarse en competentes de e. coli y extraer el plásmido ADN (pasos 2.3.4 y 2.3.5).

5. precipitar el ADN para transfección

  1. Añadir 40 μg de pMK-U6 pUF1 Cas9 y pHA -MLG DNA (de un total de 120 μg de DNA) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril.
  2. Añadir 1/10 del volumen de DNA de 3 M acetato de sodio en agua (pH 5,2) al tubo y se mezcla bien con un vortex (por ejemplo, si el volumen en el paso 5.1 fue de 100 μL, añadir 10 μL de acetato de sodio).
  3. Añadir 2,5 veces el volumen de etanol al 100% al tubo y se mezcla bien con un vortex durante al menos 30 s (por ejemplo, si el volumen de 5.1 fue de 100 μL, Añadir 250 μL de etanol al 100%).
  4. Coloque el tubo en hielo o a-20 ° C por 30 minutos.
  5. Centrifugar el tubo a 18.300 x g durante 30 min a 4 ° C.
  6. Retire con cuidado el sobrenadante del tubo. No molestes a la pelotilla.
  7. Añadir 3 veces el volumen de etanol al 70% al tubo y mezclar brevemente mediante un vortex (e.g., si el volumen de 5.1 fue de 100 μL, añadir 300 μL de etanol al 70%).
  8. Centrifugar el tubo a 18.300 x g durante 30 min a 4 ° C.
    Nota: Este paso debe realizarse en condiciones estériles en un gabinete de seguridad biológica.
  9. Retire con cuidado el sobrenadante del tubo. No molestes a la pelotilla. Deje el tubo abierto y permitir la pelotilla secar al aire durante 15 minutos.
  10. Almacenar el ADN precipitado a-20 ° C hasta que se necesite para la transfección.

6. aislar humanos glóbulos rojos de la sangre entera en preparación para transfección

  1. Sangre fresca alícuota en tubos cónicos estériles de 50 mL (aproximadamente 25 mL por tubo).
  2. Centrifugar los tubos a 1.088 x g durante 12 min, con frenos de centrifugar a 4.
  3. Aspirar el sobrenadante y buffy la chaqueta. Resuspender el precipitado de RBC, con un volumen igual de RPMI incompleto.
    Nota: RPMI incompleto es preparado por suplir RPMI 1640 con 10.32 timidina μM, 110.2 hipoxantina μM, piruvato de sodio 1 m m, bicarbonato de sodio de 30 mM, 5 mM HEPES, 11,1 mM de glucosa y gentamicina de 0.02% (v/v).
  4. Repita los pasos 6.2-6.3 dos veces. Después del último lavado, resuspender los eritrocitos en un volumen igual de RPMI incompleto y almacenar los tubos a 4 º C.

7. transferencia de glóbulos rojos con lo plásmidos CRISPR/Cas9 (a realizarse asépticamente)

Nota: Los cultivos de p. falciparum se mantienen como se describe en otros informes17. Mantener todos los cultivos a 37 ° C en 3% de O2, 3% CO2y 94% N2 a menos que se indique lo contrario. Cuando se usa la sangre de este protocolo, se refiere a los glóbulos rojos puros preparados en el paso 6. La sangre no debe ser mayor de 6 semanas, como por lo general hay una disminución en la proliferación del parásito en sangre mayores. Los siguientes pasos describen la cargando glóbulos rojos con la DNA y adición de una cultura del parásito a las células transfected. Otros protocolos de la transfección establecido son compatibles con la transferencia de estas construcciones18,19.

  1. Preparar un buffer de x cytomix 1 en agua (120 mM de KCl, 0,15 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 10 m m K2HPO4, 25 mM HEPES, pH 7,6). Filtro-esterilizar el búfer utilizando un filtro de 0,22 μm.
  2. Añadir 380 μL de la cytomix de 1 x al ADN precipitado en el paso 5 y agitar para disolver. Permitir que el ADN disolver en el cytomix 1 x durante 10 minutos, Vortex cada 3 min 10 s.
  3. En un tubo cónico de 15 mL estéril, mezclar 300 μL de glóbulos rojos (hematocrito de 50%, desde el paso 6) en el RPMI incompleto con 4 mL de 1 x cytomix.
  4. Centrifugue los hematíes de paso 7.3 en 870 x g durante 3 min y luego retire el sobrenadante de la pelotilla de RBC.
  5. Resuspender el pellet de RBC con la mezcla DNA/cytomix en el paso 6.2 y la transferencia a una cubeta de electroporación de 0,2 cm.
  6. Electroporate los hematíes mediante las siguientes condiciones: 0,32 925 μF en kV, capacidad para "Gran capacidad" y la resistencia se establece en "Infinito".
  7. Después de la electroporación, transferir el contenido de la cubeta a una 15 mL cónico que contiene 5 mL de RPMI completo (cRPMI). Centrifugar el tubo a 870 x g durante 3 min a 20 ° C y luego decantar el sobrenadante.
    Nota: cRPMI se prepara por el método mismo como RPMI incompleto con la adición de albúmina de suero bovino 0.25% (p/v) ricos en lípidos.
  8. Resuspender el precipitado en 4 mL de cRPMI y la transferencia de un bien en una placa de cultivo de tejidos bien 6. Añadir 400 μL de una cultura alto-esquizonte (7 – 10% esquizonte parasitemia es ideal) para los hematíes transfected.
    Nota: Parasitemia se define como el porcentaje de glóbulos rojos infectados por el parásito.
  9. Al día siguiente, lave la cultura con 4 mL de cRPMI. Centrifugar el cultivo a 870 x g durante 3 min y aspirar el sobrenadante. Resuspender el cultivo en 4 mL de cRPMI.
  10. 48 h después de terminar paso 7.6, lave la cultura con 4 mL de cRPMI. Luego Resuspender la cultura en cRPMI que contiene 1 μM DSM1 seleccionar para el plásmido Cas9.
  11. Continuar el lavado las culturas cada día con cRPMI hasta que los parásitos no son visibles por frotis de sangre. Después de este punto, sustituir el medio de cultivo con cRPMI fresco y 1 μM DSM1 cada 48 h.
    1. Para hacer la sangre manchar, Pipetear 150 μL de cultivo en un tubo de centrífuga de 0.6 mL. Sedimenten las células por centrifugación a 1.700 x g durante 30 s.
    2. Aspirar apagado el sobrenadante. Utilice una pipeta para transferir las células concentradas a un portaobjetos de vidrio. Con un segundo portaobjetos de vidrio en un ángulo de 45° a la primera diapositiva, frotis de la gota de sangre. Mancha la diapositiva usando un kit de tinción comercialmente disponible según protocolo del fabricante.
    3. Ver los parásitos con un 100 X objetivo de inmersión de aceite.
  12. Comenzando 5 días post-transfección (paso 7.6), retirar 2 mL del cultivo con hematíes suspendidas en el medio de cultivo. Añadir back 2 mL de medio fresco (cRPMI plus 1 μM DSM1) y sangre en el 2% de hematocrito. Añadir sangre fresca de esta manera una vez a la semana hasta parásitos vuelven a aparecer, según lo determinado por frotis de sangre fina (paso 7.11).
    Nota: Si la integración es exitosa, parásitos generalmente reaparecen en la cultura por la transfección después de un mes.
  13. Una vez que resurgir de parásitos, eliminar la presión de drogas DSM1. Alternativamente, quitar presión de drogas después de parásitos han sido clonados hacia fuera.

8. control de parásitos para la integración de la plantilla de reparación

  1. Cuando los parásitos son visibles otra vez por frotis de sangre fina, aislar ADN de la cultura con un kit adecuado.
  2. Uso de PCR para amplificar la región modificada del genoma para determinar si el locus específico se ha modificado con éxito y si el locus de tipo salvaje no modificado (indicativo de parásitos de tipo salvaje) es detectable.
    1. Para detectar parásitos que han integrado la plantilla de la reparación, utilice un primer avance que se encuentra al principio del ORF, fuera de la región de homología clonados. Utilizar una cartilla reversa que se encuentra en el 3'-UTR.
      Nota: Como esta amplificación incluye las secuencias de las etiquetas HA y glmS ribozyme, amplicones de parásitos integrados será más de la misma región amplificada en parásitos de tipo salvaje.

9. clonación parásitos limitando la dilución

  1. Realizar diluciones seriadas de la cultura de parásito del paso 7.13 para alcanzar una concentración final de 0,5 μL de parásitos/200. Añadir 200 μL de la cultura diluida en los pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos.
    Nota: Debido a parasitemia se define como el porcentaje de glóbulos rojos infectados y el hematocrito también es un número definido (2%), el número de parásitos por unidad de volumen se infiere fácilmente.
    1. Preparar 1 mL de cultivo en cRPMI al 5% parasitemia y un 2% de hematocrito (en estos niveles de parasitemia y hematocrito, la cultura contiene 1 x 107 parásitos/mL).
    2. Diluir esta cultura 1: 100 con cRPMI. Otra vez diluido 1: 100 con cRPMI.
    3. Diluir 1: 400. Realizar esta dilución mediante la adición de 62.5 μL de cultivo a 25 mL de cRPMI y 1 mL de sangre. Resultados de esta dilución en la concentración de 0,5 μL de parásitos/200.
  2. Mantenga la placa de clonación hasta que los parásitos son detectables en los pozos.
    1. Cada 48 h, sustituir el medio de la placa de 96 pozos con medio fresco.
    2. Una vez por semana, a partir de 5 días después del inicio de la placa de clonación (paso 9.1), saque 100 μL de cada pocillo y añadir espalda 100 μL de medio fresco + sangre (2% hematocrito).
  3. Identificar cualquier pozos que contienen parásitos.
    1. Coloque la placa de 96 pocillos en un ángulo de 45° por aproximadamente 20 min, permitiendo que la sangre colocar en un ángulo dentro de la placa.
    2. Coloque la placa de 96 pozos en una caja de luz. Tenga en cuenta que los pozos que contienen parásitos contienen los medios de comunicación que es amarillo en color, en comparación con los medios de comunicación rosa de pozos libres de parásitos, debido a la acidificación del medio por los parásitos.
    3. Con una pipeta serológica, mover el contenido de los pocillos que contienen el parásito a una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos para permitir la expansión de la parasitemia.
    4. Mediante análisis de PCR como se describe en el paso 8, compruebe estas líneas clonales parásito para su correcta integración.

10. precipitación de la proteína por el tratamiento de parásitos con glucosamina y confirmación por análisis de Western Blot

  1. Preparar una solución stock GlcN (glucosamina) de 0,5 M, que puede ser almacenada a-20 ° C.
  2. Añadir GlcN a las culturas de parásito de MLG y permitirles crecer en presencia de GlcN.
    Nota: La concentración final y el momento de GlcN tratamiento depende de la línea de experimento y parásito. GlcN puede impactar el crecimiento del parásito, por lo que la cepa de parásito de los padres debe ser expuesta a una gama de GlcN concentraciones para determinar su sensibilidad al compuesto. A menudo, una concentración de 2.0-7.5 mM GlcN es usado13,14,20.
  3. Aislar las muestras de proteína de los parásitos tratados GlcN13.
  4. Utilizar muestras de proteínas para análisis de western blot para detectar reducciones en la proteína13.
    1. Utilizar un anticuerpo anti-HA según las instrucciones del fabricante para detectar la proteína HA-GLM-etiquetadas. Comparar una banda de HA a un control de carga, como PfEF1α.

Resultados

Figura 1muestra un esquema de lo plásmidos utilizados en este método, así como un ejemplo de una mutación de escudo. Como un ejemplo de cómo identificar parásitos mutantes después de transfección, resultados de PCRs para comprobar la integración de la construcción HA -MLG se muestran en la figura 2. Una imagen representativa de una clonación de la placa se muestra en la figura 3 p...

Discusión

La implementación de CRISPR/Cas9 en p. falciparum tiene tanto aumentó la eficacia de y redujeron la cantidad de tiempo necesario para modificar el genoma del parásito, en comparación con los métodos anteriores de manipulación genética. Este protocolo integral esboza los pasos necesarios para la generación de mutantes condicionales utilizando CRISPR/Cas9 en p. falciparum. Mientras que el método está orientado específicamente para la generación de mutantes deMLG HA -, esta estrategia ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos Muthugapatti Kandasamy en el centro de microscopia Biomédica de Universidad de Georgia (UGA) para asistencia técnica y Juan Jose Lopez-Rubio por compartir la plásmidos pUF1 Cas9 y pL6. Este trabajo fue apoyado por premios de la Fundación de arcos D.W.C. y H.M.K., otorga fondos de inicio UGA a V.M., subvenciones de la Fundación marcha de Dimes (Premio de investigación de albahaca o ' Connor arrancador erudito) a V.M. y nos institutos nacionales de salud (R00AI099156 y R01AI130139) a V.M. y (T32AI060546) a H.M.K.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad1652660
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad165-2086We buy the ones that are individually wrapped
Sodium AcetateSigma-AldrichS2889-250g
DSM1Gift from Akhil Vaidya labGanesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34
TPP Tissue Culture 6 Well PlatesMIDSCITP92006
TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate)MIDSCITP93100
TPP Tissue Culture 96 Well PlatesMIDSCITP92096
TPP Tissue Culture 24 Well PlatesMIDSCITP92024
NEBuffer 2New England Biolabs#B7002S
NEBuffer 2.1New England Biolabs#B7202S
BtgZINew England Biolabs#R0703L
SacIINew England Biolabs#R0157L
HindIII-HFNew England Biolabs#R3104S
Afe1New England Biolabs#R0652S
Nhe1-HFNew England Biolabs#R3131L
T4 DNA PolymeraseNew England Biolabs#M0203S
500 mL Steritop bottle top filter unitMilliporeSCGPU10REYou can use any size that fits your needs
EGTASigmaE4378-100G
KClSigma-AldrichP9333-500g
CaCl2Sigma-AldrichC7902-500g
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100g
K2HPO4FisherP288-500
HEPESSigma-AldrichH4034-500g
pMK-U6Generated by the Muralidharan Labn/a
pHA-glmSGenerated by the Muralidharan Labn/a
pUF1-Cas9Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio LabGhorbal et al. Nature Biotech 2014
GlucoseSigma-AldrichG7021-1KG
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761-500G
Sodium pyruvateSigma-AldrichP5280-100G
HypoxanthineSigma-AldrichH9636-25g
Gentamicin ReagentGibco15710-064
ThymidineSigma-AldrichT1895-1G
PL6-eGFP BSDGenerated by the Muralidharan Lab
Puf1-cas9 eGFP gRNAGenerated by the Muralidharan Lab
NucleoSpin Gel and PCR Clean-upMacherey-Nagel740609.250
Albumax ILife TechnologiesN/AYou will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best
Human Red Blood CellsInterstate Blood Bank, IncEmail or call them directly for orderingWe typically use O+ blood
3D7 parasite lineAvailable upon requestN/A
Lysogeny Broth (LB)FisherBP1426-2You can make your own, it is not necessary to use exactly this
AmpicilinFisherBP1760-25We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C
AmpicilinClonetechR050A
Anti-EF1alphaDr. Daniel Goldberg's LabWashington University in St. LouisYou can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory
Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonalMade by Roche, sold by Sigma11867423001You can use your preferred anti-HA antibody
0.6 mL tubesFisherAB0350
Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II)Fisher22-122-911You can also use giemsa stain
Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in.Fisher12-544-3

Referencias

  1. World Health Organization. . World Malaria Report. , (2017).
  2. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
  3. Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
  4. Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310 (2012).
  5. Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
  6. Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
  7. Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
  8. Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
  9. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  10. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  11. Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
  12. Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
  13. Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
  14. Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).
  15. Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727 (2016).
  16. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  17. Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
  18. Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
  19. Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
  20. Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
  21. Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
  22. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
  23. Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).
  24. Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
  25. Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).
  26. Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
  27. Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
  28. Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
  29. Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
  30. Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
  31. Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
  32. Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
  33. Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Gen tican mero 139CRISPRPlasmodiumMLGca dala malariagen tica

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados