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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo un metodo per generare glmS-basato mutanti condizionali atterramento in Plasmodium falciparum utilizzando CRISPR/Cas9 editing genomico.

Abstract

La malaria è una causa significativa della morbosità e della mortalità in tutto il mondo. Questa malattia, che colpisce soprattutto coloro che vivono nelle regioni tropicali e subtropicali, è causata da infezione con parassiti del plasmodio . Lo sviluppo di farmaci più efficaci per combattere la malaria può essere accelerato da migliorare la nostra comprensione della biologia di questo parassita complesso. Manipolazione genetica di questi parassiti è la chiave per comprendere la loro biologia; Tuttavia, il genoma del p. falciparum è storicamente difficile da manipolare. Recentemente, è stato utilizzato CRISPR/Cas9 editing genomico in parassiti della malaria, consentendo per la proteina più semplice tagging, generazione di atterramenti proteina condizionale e delezione dei geni. L'editing genomico CRISPR/Cas9 ha dimostrato di essere un potente strumento per far progredire il campo della ricerca sulla malaria. Qui, descriviamo un metodo CRISPR/Cas9 per generare glmS-basato mutanti condizionali atterramento in p. falciparum. Questo metodo è altamente adattabile ad altri tipi di manipolazioni genetiche, tra cui proteine tagging e knockout del gene.

Introduzione

La malaria è una malattia devastante causata da protozoi parassiti del genere Plasmodium. P. falciparum, il parassita della malaria umana mortale la maggior parte, provoca circa 445.000 morti all'anno, principalmente in bambini sotto l'età di cinque1. Parassiti del plasmodio hanno un ciclo di vita intricato che coinvolgono un vettore zanzara e un ospite vertebrato. Gli esseri umani in primo luogo essere infettati quando una zanzara infetta prende un pasto di sangue. Quindi, il parassita invade il fegato dove cresce, si sviluppa e si divide per circa una settimana. Dopo questo processo, i parassiti vengono rilasciati nel flusso sanguigno, dove subiscono asessuale replica in globuli rossi (RBCs). Crescita dei parassiti all'interno di globuli rossi sono direttamente responsabili per i sintomi clinici associati con la malaria2.

Fino a poco tempo, produzione di transgenici da p. falciparum era un processo laborioso, che coinvolge diverse fasi di selezione della droga che ha preso molti mesi e aveva un alto tasso di fallimento. Questa procedura richiede molto tempo relieson la generazione di casuale del DNA si rompe nella regione di interesse e la capacità endogena del parassita per riparare il suo genoma però riparazione omologa3,4,5,6 . Recentemente, l'editing genomico cluster regolarmente intervallate palindromi Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) è stato correttamente utilizzato in falciparum del p.7,8. L'introduzione di questa nuova tecnologia nella ricerca sulla malaria è stato fondamentale per far progredire la comprensione della biologia di questi parassiti Plasmodium mortale. CRISPR/Cas9 permette di targeting specifico di geni attraverso guida RNAs (gRNAs) che è omologo al gene di interesse. Il gRNA/Cas9 complesso riconosce il gene attraverso il gRNA e Cas9 introduce quindi una rotture a doppio filamento, costringendo l'iniziazione dei meccanismi di riparazione nell'organismo9,10. P. falciparum manca il macchinario per riparare le rotture del DNA attraverso unirsi non-omologo fine, si utilizza meccanismi di ricombinazione omologa e integra modelli del DNA omologhe trasfettate per riparare il Cas9/gRNA-indotta rotture a doppio filamento11,12.

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di mutanti condizionali atterramento in p. falciparum usando CRISPR/Cas9 editing genomico. Il protocollo viene illustrato l'utilizzo del ribozima glmS ai livelli della proteina in modo condizionale atterramento di PfHsp70x (PF3D7_0831700), uno chaperon esportati da p. falciparum in host RBCs13,14. Il ribozima glmS viene attivato dal trattamento con glucosamina (che viene convertito in glucosamina-6-fosfato in cellule) per fendere il suo mRNA associato, che conduce ad una riduzione della proteina14. Questo protocollo può essere facilmente adattato per utilizzare altri strumenti di atterramento condizionale, ad esempio domini di destabilizzazione o RNA aptameri4,5,15. I nostri dettagli del protocollo la generazione di un plasmide di riparazione che consiste di un ribozima emoagglutinina (HA) di tag e glmS sequenza fiancheggiato da sequenze di codificazione che sono omologhi al PfHsp70x open reading frame (ORF) e 3'-UTR. Inoltre descriviamo la generazione di un plasmide seconda espressione di unità del gRNA. Questi due plasmidi, insieme a un terzo che spinge espressione di Cas9, sono trasfettati in RBCs e utilizzati per modificare il genoma del p. falciparum parassiti. Infine, descriviamo una reazione a catena della polimerasi (PCR)-tecnica per verificare l'integrazione del ribozima tag e glmS basata. Questo protocollo è altamente adattabile per la modifica o la completa eliminazione di eventuali geni di p. falciparum , aumentando la nostra capacità di generare nuove intuizioni riguardanti la biologia del parassita della malaria.

Protocollo

Continua cultura di p. falciparum richiede l'uso di globuli rossi umani, e abbiamo utilizzato commercialmente acquistato unità di sangue che sono stati spogliati di tutti gli identificatori e resi anonimi. L'Institutional Review Board e l'ufficio di biosicurezza presso l'Università della Georgia esaminato i nostri protocolli e approvato tutti i protocolli utilizzati nel nostro laboratorio.

1. scegliere una gRNA sequenza

  1. Vai a CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) e seleziona ' Fasta Target'. Sotto 'Target', incollare le 200 coppie di basi dall'estremità 3' dell'open reading frame (ORF) di un gene e 200 paia di basi fin dall'inizio di 3'-UTR del gene. In 'In', selezionare 'P. falciparum' (3 7 v 3.0) e selezionare ' CRISPR/Cas9 ' sotto 'Using'. Fare clic su ' trovare siti di destinazione '.
  2. Selezionare una sequenza di gRNA le opzioni presentate, dando la preferenza al gRNA più efficiente che è più vicina al sito di modifica e che ha i minor numero siti fuori bersaglio.
    Nota: Potenziali gRNA sequenze sono identificate perché sono immediatamente a Monte di un motivo adiacente Protospacer (PAM), che è necessaria per l'assunzione di Cas9 a DNA. La sequenza che viene duplicata in pMK-U6, il vettore che spinge gRNA espressione, è la 20 basi immediatamente a Monte del PAM. Il PAM specifico per Cas9 di S. pyogenes è la sequenza nucleotidica NGG e non devono essere inclusi nella sequenza che viene duplicata in pMK-U6.
    Nota: CHOPCHOP truppa visivamente le sequenze gRNA, visualizzare le opzioni migliori in verde, le opzioni meno ideale in ambra e le opzioni peggiori in rosso. CHOPCHOP dà ogni sequenza gRNA un punteggio di efficienza che viene calcolato utilizzando i più aggiornati parametri trovati nella letteratura, e predicono fuori bersaglio siti che potrebbero essere riconosciuti dal gRNA. Due o tre sequenze di gRNA potrebbero essere necessario essere tentato di trovare il gRNA migliore adatto a un particolare gene.
  3. È possibile acquistare la sequenza gRNA e suo inverso-complemento come oligos purificato per elettroforesi su Gel di poliacrilammide. La sequenza di gRNA utilizzata per destinazione PfHSP70x può essere trovata in Figura 1B.
    Nota: Questa oligo dovrebbe includere 15 paia di basi omologa per il plasmide che esprimono gRNA, che sono necessari per la sequenza e la legatura-indipendente clonazione (SLIC) nel vettore pMK-U616.

2. clonazione gRNA sequenza in pMK-U6

  1. Digerire il pMK-U6 con BtgZI.
    1. Digest 10 μg di pMK-U6 con 5 μL di enzima BtgZI (5.000 unità/mL) per 3 ore a 60 ° C. Seguire il protocollo del produttore enzima per condizioni di reazione.
    2. Dopo il periodo di incubazione di 3 h, è possibile aggiungere un ulteriore 3 μL di BtgZI alla reazione per garantire la completa digestione del plasmide. Digerire per ulteriori 3 ore, sempre seguendo le istruzioni del produttore per garantire le condizioni di reazione corretta.
    3. Per purificare il pMK-U6 digeriti dalla reazione, utilizzare un kit di pulizia PCR basata su colonne secondo le istruzioni del produttore.
    4. Separare il DNA digerito utilizzando un gel di agarosio di 0,7% ed estrarre la band di 4.200-accoppiamenti.
  2. Tempri il oligos contenente la sequenza di gRNA.
    1. Ricostituire il pagina-purificato oligos ad una concentrazione di 100 μM utilizzando acqua priva di nucleasi.
    2. Unire 10 μL di ogni oligo con 2,2 μL di tampone di 10 x 2 (Vedi Tabella materiali). Assicurarsi che il volume di reazione totale è 22,2 μL.
    3. Eseguire il programma in un termociclatore di ricottura di gRNA: passo 1: 95 ° C, 10 min; Passo 2: 95 ° C, 1 s, con una riduzione della temperatura di 0,6 ° C/ciclo; Passo 3: andare al passaggio 2, 16 volte; Passo 4: 85 ° C, 1 min; passo 5: 85 ° C, 1 s, con una riduzione della temperatura di 0,6 ° C/ciclo; passaggio 6: andare al passaggio 5, 16 volte; Passo 7: 75 ° C, 1 min; passo 8: 75 ° C, 1 s, con una riduzione della temperatura di 0,6 ° C/ciclo; passaggio 9: andare al passaggio 8, 16 volte. Passaggi da 10 a 21: ripetere la procedura utilizzata nei passaggi 4 – 9 fino a quando la temperatura raggiunge i 25 ° C; passo 22:25 ° C, 1 min.
  3. Inserire i oligos ricotto gRNA nel plasmide BtgZI-digerito e gel-purificato pMK-U6.
    1. Combine 100 ng di pMK-U6 digerito con 1 μL di 10 x μL di tampone 2.1 e 3 dei oligos gRNA ricotto. Aumentare il volume a 9,5 μL con acqua priva di nucleasi.
    2. Aggiungere 0,5 μL della polimerasi di T4 e incubare la reazione a temperatura ambiente per 2,5 min.
    3. Spostare la reazione di ghiaccio e incubare per 10 min.
    4. Immediatamente trasformare 5 μL della reazione in competente e. coli secondo le istruzioni del fornitore di batteri. Piastra i batteri sui piatti di agar Lisogenesi brodo (LB) contenente 100 μg/mL Ampicillin.
    5. Consentire i batteri trasformati crescere a 37 ° C durante la notte, quindi selezionare colonie ed estrarre il DNA con un kit miniprep plasmide commercialmente disponibili.

3. progettazione di regioni di omologia del modello riparazione

  1. Progettazione scudo mutazioni all'interno del modello di riparazione di omologia per evitare ri-taglio del DNA che è integrato nel genoma.
    Nota: Una mutazione di scudo in genere consiste nell'introdurre una mutazione silenziosa per alterare il PAM, in modo che Cas9 non indurrà una pausa nel modello di riparazione. Il PAM necessari per il Cas9 utilizzata nel presente protocollo è la sequenza di nucleotide "NGG", dove "N" è qualsiasi nucleotide. Se possibile, modificare uno dei nucleotidi G in un A, C o T.
    1. Se il PAM non può essere mutato in silenzio, introdurre almeno 2 mutazioni silenti nelle 6 coppie di basi direttamente adiacente al PAM7,8.
      Nota: Queste mutazioni saranno impedire il riconoscimento del modello riparazione dal gRNA e prevenire rimacinazione del locus riparato da Cas9/gRNA complesse. Le mutazioni di scudo possono essere introdotto nella regione di omologia di amplificare il DNA con gli iniettori che contengono la mutazione.
  2. Amplificare la regione di omologia ORF per il modello di riparazione.
    1. Usando la PCR, amplificare 800 paia di basi da estremità 3' del ORF di gene dell'obiettivo. Progettare il primer che verrà utilizzato per escludere il codone di arresto da questo amplicon.
    2. Progettare il primer per l'inserimento di questo amplicon nel pHA -glmS ha stato digerito con Silvio e AfeI attraverso una reazione di legatura del DNA o SLIC16.
  3. Amplificare la regione di omologia di 3'-UTR per il modello di riparazione.
    1. Usando la PCR, amplificare le 800 coppie di basi, immediatamente dopo il codone di arresto del gene target. Disegnare primers per l'inserimento di questo amplicon nel pHA -glmS ha stato digerito con HindIII e NheI attraverso una reazione di legatura del DNA o SLIC16.
      Nota: L'alto contenuto del genoma del p. falciparum può rendere l'amplificazione delle regioni quali l'UTR difficile. Un approccio alternativo all'utilizzo di PCR sta sintetizzando le regioni di omologia.

4. clonazione omologia regioni nel plasmide riparazione

  1. Inserire la regione di omologia ORF la pHA -glmS.
    1. Digerire il pHA -glmS con Silvio e AfeI, secondo le istruzioni del produttore degli enzimi. Inserire il prodotto PCR di ORF omologia regione nel plasmide digerito utilizzando SLIC16.
    2. Trasformare in competente Escherichia coli come eseguita in punti 2.3.4 e 2.3.5.
  2. Inserire la regione di omologia di 3'-UTR in un plasmide di pHA-glmS che già contiene la regione di omologia ORF (Vedi punto 4.1).
    1. Digerire il plasmide con HindIII e NheI secondo le istruzioni del produttore degli enzimi. Inserire l'amplicone di regione 3'-UTR omologia nel plasmide digerito utilizzando SLIC16.
    2. Trasformare in competente Escherichia coli ed estrarre il plasmide DNA (punti 2.3.4 e 2.3.5).

5. precipitazione del DNA per la transfezione

  1. Aggiungere 40 µ g di pMK-U6, pUF1-Cas9 e pHA -glmS DNA (per un totale di 120 µ g di DNA) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sterile.
  2. Aggiungere 1/10th il volume di DNA di 3M acetato di sodio in acqua (pH 5.2) nella provetta e mescolare bene con un vortex (ad esempio, se il volume nel passaggio 5.1 era 100 μL, aggiungere 10 μL di acetato di sodio).
  3. Aggiungere 2,5 volte il volume di etanolo al 100% nella provetta e mescolare bene con un vortex per almeno 30 s (ad esempio, se il volume in 5.1 era 100 μL, aggiungere 250 µ l di etanolo al 100%).
  4. Porre la provetta in ghiaccio o a-20 ° C per 30 min.
  5. Centrifugare la provetta a 18.300 x g per 30 min a 4 ° C.
  6. Rimuovere con cautela il surnatante dal tubo. Non disturbare il pellet.
  7. Aggiungere 3 volte il volume di etanolo al 70% al tubo e mescolare brevemente con un vortex (ad es., se il volume in 5.1 era 100 μL, aggiungere 300 µ l di etanolo al 70%).
  8. Centrifugare la provetta a 18.300 x g per 30 min a 4 ° C.
    Nota: Questo passaggio deve essere eseguito in condizioni di sterilità in una cappa di sicurezza biologica.
  9. Rimuovere con cautela il surnatante dal tubo. Non disturbare il pellet. Lasciare aperto il tubo e lasciar asciugare all'aria per 15 min il pellet.
  10. Conservare il DNA precipitato a-20 ° C fino a quando non è necessario per la transfezione.

6. isolamento umano RBCs da sangue intero in preparazione per la transfezione

  1. Aliquota sangue fresco in provette coniche da 50 mL sterile (circa 25 mL per tubo).
  2. Centrifugare le provette a 1.088 x g per 12 min, con freni centrifuga impostati su 4.
  3. Aspirate fuori il surnatante e buffy coat. Risospendere il pellet di RBC con un volume uguale di RPMI incompleta.
    Nota: Incomplete RPMI è preparato completando RPMI 1640 con 10,32 timidina μM, 110,2 ipoxantina μM, piruvato di sodio 1 mM, 30 mM bicarbonato di sodio, 5 mM HEPES, 11,1 millimetri di glucosio e gentamicina 0,02% (v/v).
  4. Ripetere i passaggi da 6.2 – 6.3 due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere i globuli rossi in un volume uguale di RPMI incompleta e conservare i capillari a 4 ° C.

7. trasfettando RBCs con i plasmidi CRISPR/Cas9 (per essere fatto in modo asettico)

Nota: P. falciparum culture sono mantenute come descritto in altri rapporti17. Mantenere tutte le culture a 37 ° C sotto il 3% O2, 3% CO2e 94% N2 salvo diversa indicazione. Ogni volta che il sangue è utilizzata nel presente protocollo, si riferisce ai globuli rosso puri preparati nel passaggio 6. Il sangue utilizzato non deve essere più vecchio di 6 settimane, come c'è in genere una diminuzione nella proliferazione del parassita nel sangue più anziani. I passaggi seguenti descrivono RBCs pre-caricamento con il DNA e l'aggiunta di una cultura di parassita alle cellule trasfettate. Altri protocolli di transfezione stabiliti sono compatibili con questi costrutti18,19di trasfezione.

  1. Preparare un tampone x cytomix 1 in acqua (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 10mm K2HPO4, 25mm HEPES, pH 7,6). Filtro-sterilizzare il buffer utilizzando un filtro di 0,22 μm.
  2. Aggiungere 380 μL della cytomix 1x al DNA precipitato nel passaggio 5 e vortexare per sciogliere. Consentire il DNA da sciogliere nella cytomix 1x per 10 minuti, Vortex ogni 3 min per 10 s.
  3. In una provetta conica sterile 15 mL, unire 300 μL di globuli rossi (50% ematocrito, dal passaggio 6) nel RPMI incompleta con 4 mL di 1x cytomix.
  4. Centrifugare i globuli rossi dal punto 7.3 a 870 x g per 3 minuti e quindi rimuovere il supernatante dal pellet RBC.
  5. Risospendere il pellet di RBC con la miscela di DNA/cytomix dal punto 6.2 e trasferirlo in una cuvetta di elettroporazione di 0,2 cm.
  6. Electroporate globuli rossi utilizzando le seguenti condizioni: 0,32 kV, 925 μF, capacità impostata su "High Cap" e resistenza impostata su "Infinito".
  7. A seguito di elettroporazione, trasferire il contenuto dalla cuvette di 15 mL conica contenente 5 mL di RPMI completo (cRPMI). Centrifugare la provetta a 870 x g per 3 min a 20 ° C e quindi decantare il supernatante.
    Nota: cRPMI è preparato tramite lo stesso metodo come incompleta RPMI con l'aggiunta di albumina di siero bovino di 0.25% (p/v) ricca di lipidi.
  8. Risospendere il pellet in 4 mL di cRPMI e trasferimento in un pozzetto di una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti. Aggiungere 400 μL di una cultura alta-schizonte (7 – 10% schizonte parassitemia è ideale) ai globuli rossi trasfettate.
    Nota: La parassitemia è definita come la percentuale di globuli rossi infettati dal parassita.
  9. Il giorno successivo, lavare la cultura con 4 mL di cRPMI. Centrifugare la coltura a 870 x g per 3 min e aspirare il supernatante. Risospendere la cultura in 4 mL di cRPMI.
  10. 48 ore dopo aver completato il passaggio 7.6, lavare la cultura con 4 mL di cRPMI. Quindi Risospendere la cultura in cRPMI contenente 1 μM DSM1 per selezionare per il plasmide Cas9.
  11. Continuare a lavare le culture ogni giorno con cRPMI fino a quando i parassiti non sono più visibili di striscio di sangue. Dopo questo punto, sostituire il terreno di coltura fresco cRPMI Plus 1 μM DSM1 ogni 48 h.
    1. Per rendere un sangue striscio, aggiungere 150 μL di coltura in una provetta da centrifuga 0,6 mL. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 1.700 x g per 30 s.
    2. Aspirare il sovranatante. Utilizzare una pipetta per trasferire le cellule pellettate a una lastra di vetro. Utilizzando una seconda lastra di vetro tenuta ad un angolo di 45° alla prima diapositiva, striscio la goccia di sangue. Macchia la diapositiva utilizzando un kit di colorazione commercialmente disponibile secondo il protocollo del produttore.
    3. Mostra i parassiti utilizzando un 100x obiettivo a immersione in olio.
  12. A partire da 5 giorni post-transfezione (punto 7.6), rimuovere da 2 mL della cultura con RBCs risospese in terreno di coltura. Aggiungere posteriore 2 mL di terreno nuovo (cRPMI plus 1 μM DSM1) e nel sangue 2% ematocrito. Aggiungere sangue fresco in questo modo una volta a settimana fino a riappaiono i parassiti, come determinato da striscio di sangue sottile (passo 7.11).
    Nota: Se l'integrazione viene eseguita correttamente, parassiti generalmente riappaiono nella cultura di un mese post-transfezione.
  13. Una volta che i parassiti riemergere, rimuovere DSM1 farmaco pressione. In alternativa, rimuovere la pressione di droga dopo che i parassiti sono stati clonati fuori.

8. controllo parassiti per l'integrazione del modello di riparazione

  1. Quando i parassiti sono visibili ancora per sbavatura di anima sottile, isolare il DNA dalla cultura utilizzando un apposito kit.
  2. Utilizzare la PCR per amplificare la regione modificata del genoma per determinare se il luogo di destinazione è stato modificato con successo e il locus di selvaggio-tipo non modificato (indicativo di selvaggio-tipo parassiti) è rilevabile.
    1. Per rilevare i parassiti che hanno integrato il modello di riparazione, utilizzare un primer in avanti che si trova all'inizio del ORF, di fuori della regione di omologia clonato. Utilizzare un primer inverso che si siede in 3'-UTR.
      Nota: Questa amplificazione include le sequenze del tag HA e glmS ribozima, ampliconi di parassiti integrati sarà più lungo della stessa regione amplificata nel selvaggio-tipo parassiti.

9. clonazione parassiti limitando la diluzione

  1. Effettuare diluizioni seriali della cultura parassita dal passaggio 7.13 per ottenere una concentrazione finale di 0,5 parassiti/200 μL. Aggiungere 200 μL della cultura diluito nei pozzetti di una piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti.
    Nota: Poiché la parassitemia è definita come la percentuale di globuli rossi infetti e l'ematocrito è anche un numero definito (2%), facilmente si deduce che il numero di parassiti per unità di volume.
    1. Preparare 1 mL di coltura in cRPMI al 5% parassitemia e 2% ematocrito (a questi livelli di parassitemia e l'ematocrito, la cultura contiene 1 x 107 parassiti/mL).
    2. Diluire questa cultura di 1: 100 con cRPMI. Nuovo diluire 1: 100 con cRPMI.
    3. Diluire 1: 400. Eseguire questa diluizione aggiungendo 62,5 μL della cultura a 25 mL di cRPMI e 1 mL di sangue. Questa diluizione conseguente alla concentrazione desiderata di 0,5 parassiti/200 μL.
  2. Mantenere la clonazione piastra fino a quando i parassiti sono rilevabili nei pozzetti.
    1. Ogni 48 h, sostituire il mezzo della piastra a 96 pozzetti con medium fresco.
    2. Una volta a settimana, a partire da 5 giorni dopo l'inizio della piastra clonazione (punto 9.1), rimuovere 100 μL da ogni pozzetto e aggiungere indietro 100 μL di sangue (2% ematocrito) + mezzo fresco.
  3. Identificare eventuali pozzetti contenenti i parassiti.
    1. Posizionare la piastra a 96 pozzetti ad un angolo di 45° per circa 20 min, permettendo al sangue di stabilirsi in un angolo all'interno della placca.
    2. Posizionare la piastra a 96 pozzetti su un light box. Si noti che i pozzetti contenenti parassiti contengono media che è di colore giallo a colore, rispetto ai media rosa pozzetti esenti da parassita, a causa dell'acidificazione del mezzo dai parassiti.
    3. Utilizzando una pipetta sierologica, spostare il contenuto dei pozzetti contenenti parassita ad una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti per consentire l'espansione la parassitemia.
    4. Usando l'analisi PCR come descritto nel passaggio 8, controllare queste linee clonali parassita per l'integrazione corretta.

10. knockdown della proteina trattando i parassiti con glucosamina e conferma tramite analisi Western Blot

  1. Preparare una soluzione stock di GlcN (glucosamina) 0,5 M, che possa essere conservata a-20 ° C.
  2. Aggiungere GlcN alle culture glmS parassita e consentire loro di crescere in presenza di GlcN.
    Nota: La concentrazione finale e la tempistica del trattamento GlcN dipende la linea esperimento e parassita. GlcN può influire sulla crescita del parassita, così il ceppo parentale parassita deve essere esposta a una gamma di GlcN concentrazioni per determinare la sensibilità al composto. Spesso, una concentrazione di 2.0-7.5 millimetri GlcN è usato13,14,20.
  3. Isolare i campioni della proteina dai parassiti GlcN-trattati13.
  4. Utilizzare campioni di proteine per l'analisi western blot per rilevare riduzioni nella proteina13.
    1. Utilizzare un anticorpo anti-HA secondo le istruzioni del produttore per rilevare la proteina HA-glmS-etichetta. Confrontare la band HA a un controllo di carico, ad esempio PfEF1α.

Risultati

Uno schema dei plasmidi utilizzati in questo metodo, così come un esempio di una mutazione di scudo sono mostrati nella Figura 1. Come un esempio di come identificare parassiti mutanti dopo trasfezione, risultati da PCRs per controllo integrazione del costruttoglmS ettari - sono riportati in Figura 2. Un'immagine rappresentativa di una piastra di clonazione è illustrata nella Figura 3 per ...

Discussione

L'implementazione di CRISPR/Cas9 a p. falciparum ha aumentato l'efficienza di sia diminuito la quantità di tempo necessario per la modifica del genoma del parassita, rispetto ai precedenti metodi di manipolazione genetica. Questo protocollo completo vengono delineati i passaggi necessari per la generazione di mutanti condizionali utilizzando CRISPR/Cas9 a p. falciparum. Mentre il metodo qui è orientato in modo specifico per la generazione di ettari -glmS mutanti, questa strategia può essere ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo Muthugapatti Kandasamy presso il nucleo di microscopia biomedica Università della Georgia (UGA) per l'assistenza tecnica e Jose-Juan Lopez-Rubio per aver condiviso i plasmidi pUF1-Cas9 e pL6. Quest'opera è stata sostenuta da archi Foundation Award di D.W.C. e di H.M.K., concede fondi avvio UGA di V.M., sovvenzioni da marzo di Dimes Foundation (Basil o ' Connor Starter Scholar Research Award) di V.M. e US National Institutes of Health (R00AI099156 e R01AI130139) di V.M. e (T32AI060546) a H.M.K.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad1652660
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad165-2086We buy the ones that are individually wrapped
Sodium AcetateSigma-AldrichS2889-250g
DSM1Gift from Akhil Vaidya labGanesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34
TPP Tissue Culture 6 Well PlatesMIDSCITP92006
TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate)MIDSCITP93100
TPP Tissue Culture 96 Well PlatesMIDSCITP92096
TPP Tissue Culture 24 Well PlatesMIDSCITP92024
NEBuffer 2New England Biolabs#B7002S
NEBuffer 2.1New England Biolabs#B7202S
BtgZINew England Biolabs#R0703L
SacIINew England Biolabs#R0157L
HindIII-HFNew England Biolabs#R3104S
Afe1New England Biolabs#R0652S
Nhe1-HFNew England Biolabs#R3131L
T4 DNA PolymeraseNew England Biolabs#M0203S
500 mL Steritop bottle top filter unitMilliporeSCGPU10REYou can use any size that fits your needs
EGTASigmaE4378-100G
KClSigma-AldrichP9333-500g
CaCl2Sigma-AldrichC7902-500g
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100g
K2HPO4FisherP288-500
HEPESSigma-AldrichH4034-500g
pMK-U6Generated by the Muralidharan Labn/a
pHA-glmSGenerated by the Muralidharan Labn/a
pUF1-Cas9Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio LabGhorbal et al. Nature Biotech 2014
GlucoseSigma-AldrichG7021-1KG
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761-500G
Sodium pyruvateSigma-AldrichP5280-100G
HypoxanthineSigma-AldrichH9636-25g
Gentamicin ReagentGibco15710-064
ThymidineSigma-AldrichT1895-1G
PL6-eGFP BSDGenerated by the Muralidharan Lab
Puf1-cas9 eGFP gRNAGenerated by the Muralidharan Lab
NucleoSpin Gel and PCR Clean-upMacherey-Nagel740609.250
Albumax ILife TechnologiesN/AYou will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best
Human Red Blood CellsInterstate Blood Bank, IncEmail or call them directly for orderingWe typically use O+ blood
3D7 parasite lineAvailable upon requestN/A
Lysogeny Broth (LB)FisherBP1426-2You can make your own, it is not necessary to use exactly this
AmpicilinFisherBP1760-25We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C
AmpicilinClonetechR050A
Anti-EF1alphaDr. Daniel Goldberg's LabWashington University in St. LouisYou can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory
Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonalMade by Roche, sold by Sigma11867423001You can use your preferred anti-HA antibody
0.6 mL tubesFisherAB0350
Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II)Fisher22-122-911You can also use giemsa stain
Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in.Fisher12-544-3

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