تقييم لوظيفة الكلي في نماذج الماوس من المرض الكبيبي

Summary

ويصف هذا البروتوكول عمل الكلي كامل حتى التي ينبغي الاضطلاع بها في نماذج الماوس من المرض الكبيبي. الأساليب التي يسمح بإجراء تحليل الوظيفية والهيكلية والميكانيكية مفصلة وظيفة الكبيبي، والتي يمكن تطبيقها على جميع نماذج الماوس من المرض الكبيبي.

Abstract

استخدام نماذج مورين لتقليد أمراض الكلي البشرية أصبحت شائعة بشكل متزايد. لدينا أبحاث تركز على تقييم الدالة الكبيبي في حدوث السكري والفئران المغلوب فيجف-أ بودوسيتي على حدة؛ ولذلك، يصف هذا البروتوكول يصل العمل الكلي الكامل المستخدمة في لدينا مختبر لتقييم هذه النماذج الماوس من المرض الكبيبي، تمكين كمية هائلة من المعلومات المتعلقة بالكلى ودالة الكبيبي يمكن الحصول عليها من ماوس واحدة. بالمقارنة مع طرق بديلة عرضت في الأدب لتقييم دالة الكبيبي، يمكن استخدام الطريقة المبينة في هذه الورقة النمط الظاهري الكبيبي تقييمه بشكل كامل من جوانب متعددة. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن تحديد النمط الظاهري الكلي للنموذج الباحث وتقييم الآلية بشأن لماذا يتطور النمط الظاهري. هذه المعلومات الحيوية عن الآلية المرض مطلوب عند دراسة السبل العلاجية المحتملة في هذه النماذج. الأساليب تسمح بتقييم وظيفي مفصل للحاجز الترشيح الكبيبي عن طريق قياس نسبة كرياتينين الزلال البولي ونفاذيه المياه الكبيبي الفردية، فضلا عن دراسة هيكلية وهيكلية فائقة استخدام "حمض الدوري شيف" وصمة عار والمجهر الإلكتروني. وعلاوة على ذلك، يتيح تحليل dysregulated الجينات على مستوى البروتين ومرناً آليا إلى تحليل وظيفة الكبيبي. هذا البروتوكول يحدد أساليب عامة ولكن قابلة للتكيف التي يمكن تطبيقها على جميع نماذج الماوس من المرض الكبيبي.

Introduction

استخدام نماذج مورين لتقليد أمراض الكلي البشرية أصبحت شائعة بشكل متزايد. وتشمل هذه النماذج مورين نماذج عفوية مثل تلقائياً ارتفاع ضغط الدم الفئران (باستفاض)¹، بالستريبتوزوتوسين (STZ)-التي يسببها السكري الجرذان والفئران²، واكتب db/db الثاني الفئران السكري³، نماذج المهندسة وراثيا مثل النماذج الأولية الخاصة بودوسيتي التنسيق القطاعي الكبيبي التصلب (FSGS)⁴، خاصة بودوسيتي الأوعية الدموية غشائي عامل النمو (فيجف-A) المغلوب (فيجفا كو) نموذج⁵، وألبرت متلازمة نماذج⁶، واكتسبت نموذج نماذج مثل استئصال 5/6⁷ وانسداد الحالب الانفرادية (أو)⁸. وبغية تقييم الجوانب المختلفة للدالة الكبيبي في هذه النماذج، تتوفر عدة تقنيات. والغرض من هذه الورقة الأسلوب هو إثبات شاملة عمل أعلى التي يجب تنفيذها في نماذج الماوس لأمراض الكلي من أجل إجراء تقييم كامل للدالة الكبيبي.

الأساس المنطقي لاستخدام هذا الأسلوب أنه يتيح النمط الظاهري الكبيبي تقييمه بشكل كامل من جوانب متعددة. وهذا يشمل تقييم نفاذية الكبيبي، سواء للبروتين والماء، والتشوهات الهيكلية الكبيبي، والتغييرات في التعبير/الربط مرناس والبروتينات ضروري لوظيفة الكبيبي طبيعية. باستخدام هذا الأسلوب، الباحث قادراً على تحديد النمط الظاهري الكلي للنموذج وتقييم الآلية بشأن لماذا يتطور النمط الظاهري. هذه هي معلومات حيوية عن الآلية للمرض، ومطلوب عند دراسة السبل العلاجية المحتملة في هذه النماذج.

في الأدب، هو شائع لتقديمها مع نموذج الفأر من المرض الكبيبي حيث يتم تحديد النمط الظاهري بزيادة مستوى الزلال في البول. ومع ذلك، هناك أدلة على أن أسلوب واحد لتحديد دالة الكبيبي ليست دائماً فعالة؛ قياس معدل إفراز الزلال البولي أو نسبة كرياتينين الزلال البولي (أواكر) فقط يوفر معلومات عن الدالة المجموع الكلي، وليس من جلوميرولي الفردية. وقد أثبتت الدراسات السابقة أن النفاذية يمكن أن تختلف في جلوميرولي مختلفة من نفس الكلي^5،،من⁹¹⁰. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تقييم نفاذية glomeruli الفردية بطريقة أكثر حساسية لتقييم دالة الكبيبي؛ تقنية قياس نفاذية المياه الكبيبي الفردية (L_pA/V_أنا) قد أظهرت أن تكون أكثر حساسية للتغيرات في وظيفة الكبيبي من قياس أواكر⁹. هذا التحليل مفيد في نماذج الماوس التي تقاوم بروتينية، مثل تلك المتعلقة خلفية c57BL/6¹¹. وميزة هذه الورقة الأسلوب أن يفحص نفاذية الكلي الإجمالي للزلال فضلا عن نفاذية الكبيبي الفردية للمياه.

غالباً ما يتم تقييم دراسة التشوهات الهيكلية الكبيبي ببطارية من البقع مثل حمض الدوري Schiff (PAS)، تريتشرومي، والبقع الفضية. وهي تمكن أخصائي الكلي مدربين لتقييم مستوى مرض الكلي عن طريق أسلوب التهديف. على الرغم من أن جميع طرق جيدة، تغييرات على الهيكل الكلي الكبيبي لا تحترم دائماً في نماذج كلوي حاد إصابة¹². وتقترح هذه الطريقة أن الترا الكبيبي-الهيكل ينبغي أيضا تقييم بالإضافة إلى اضطلاعها بالانسجة الكلوية التقنيات الموضحة أعلاه، عن طريق الميكروسكوب الإلكتروني (م). الكبيبة الملون يمكن أن تبدو طبيعية نسبيا تحت مجهر خفيفة عادية؛ ومع ذلك، عند تقييم مع م، التغييرات الصغيرة في عرض الغشاء الكبيبي (GBM)، بودوسيتي القدم عملية عفو، فينيستريشنز بطانية، وتغطية مساحة بودوسيتي الفرعية يتم تحليل. ولذلك، من المهم أن الكبيبي الترا-الهيكل والبنية الصغرى هو تقييم لتحديد إليه الخلل الوظيفي الكبيبي.

وبالإضافة إلى تقييم التشوهات الهيكلية الكبيبي، ينبغي دراسة التغيرات في مرناً والتعبير البروتين والربط، فضلا عن تنشيط البروتين (مثلاً، الفسفرة)، لتوضيح آليات المرض الكبيبي. عندما ننظر إلى المرض الكبيبي، أو، على سبيل المثال، عندما كو/عبر-expressing جينات على وجه التحديد في الخلايا الكبيبي، مثلما حدث في بودوسيتي الخاصة "فيجفا كو" الماوس⁵، من المهم أن يتم فحص التغييرات البروتين ومرناً فقط داخل الخلايا الكبيبي، وليس كله الكلي. ويصف هذا البروتوكول وسيلة التي glomeruli أنها معزولة من قشرة الكلي الماوس، ومن ثم يتم عزل البروتين/الجيش الملكي النيبالي. يسمح هذا التحليل محددة من التقلبات البروتين/مرناً في جلوميرولي طراز المرض.

ويصف هذا البروتوكول عمل الكلي كامل متابعة التي ينبغي الاضطلاع بها في نماذج الماوس من المرض الكبيبي، تمكين كمية هائلة من المعلومات المتعلقة بالكلى ودالة الكبيبي يمكن الحصول عليها من ماوس واحدة. الأساليب التي يسمح بإجراء تحليل الوظيفية والهيكلية والميكانيكية مفصلة وظيفة الكبيبي، والتي يمكن تطبيقها على جميع نماذج الماوس من المرض الكبيبي.

Protocol

أجريت جميع التجارب وفقا لتشريعات المملكة المتحدة وموافقة اللجنة الأخلاقية المحلية. ووافقت جامعة "بريستول لجنة أخلاقيات البحوث" الدراسات الحيوانية.

1-البولي "نسبة كرياتينين" الزلال (أواكر)

ملاحظة: يتم استخدام أواكر تقييم نفاذية جفب للزلال. ويشير إلى وجود الزلال في البول زيادة نفاذية عبر جفب، الذي هو تطبيع إلى كرياتينين لمراقبة التغيرات في معدل تدفق البول. بيله علامة شائعة لأمراض الكلي المزمنة.

1. جمع البول في الأساس التجريبي وعلى فترات منتظمة (مرة واحدة أسبوعيا لمرة واحدة شهريا) حتى نقطة النهاية التجريبية.
2. إعداد الماوس أقفاص الأيضية مع النظام الغذائي في المياه وتخصيب اليورانيوم. ضع الفئران (الذكور، الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع) في أقفاص فردية ح 6 في غرفة هادئة.
3. العودة من الفئران للمساكن العادية وجمع البول من أقفاص فارغة. مطلوب على الأقل 50 ميليلتر.
   ملاحظة: إذا كان الماوس لا تنتج البول في وقت معين، كرر في يوم آخر في غرفة أكثر دفئا.
4. الطرد المركزي البول في ز 500 x لأدنى 10 جمع البول واستبقاء الرواسب لتقييم خسائر بودوسيتي. وعند هذه النقطة بتخزين البول في-20 درجة مئوية في الأجل القصير.
5. تمييع البول في ألبومين المصل البقري 1% (BSA) في 1 x Tris مخزنة المالحة (TBS الرقم الهيدروجيني 7.5) في 1: 500 لتمييع 1:10000، اعتماداً على شدة بيله.
   ملاحظة: يجب أن يكون حجم نهاية > 400 ميليلتر. النقطة الأمثل لتحديد تمييع الحق في كل وقت.
6. قياس تركيز الزلال البولي باستخدام ماوس الزلال إنزيم الممتز مرتبط مقايسة (أليسا) لإرشادات الشركة المصنعة.
   1. بإيجاز، معطف لوحة أليسا، الذي هو الأمثل للبروتين ملزمة، مع 100 ميليلتر من جسم الزلال الماوس المضادة الأولية (10 ميكروغرام/مل في 0.5 م كربونات بيكربونات pH 9.6) ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
   2. أغسل جسم الزائد من الآبار خمس مرات مع 1 x TBS بالإضافة إلى 0.05% توين (pH 8.0)، وإضافة 200 ميليلتر من عرقلة الحل (x TBS 1 مع 1% جيش صرب البوسنة pH 8.0) بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
7. أغسل لوحة خمس مرات وإضافة 100 ميليلتر من المعايير (تمييع المسلسل: 2000 ميكروغرام/مل إلى 15.63 ميكروغرام/مل في x TBS 1 مع 1% جيش صرب البوسنة، pH 8.0)، الفارغة، وعينات المخفف في ثلاث نسخ. ترك ح 1 في درجة حرارة الغرفة ثم يغسل صفيحة خمس مرات.
   1. إضافة 100 ميليلتر من برنامج الصحة الإنجابية الكشف عن الأجسام المضادة لكل بئر (10 نانوغرام/مل في 1xTBS مع 1% جيش صرب البوسنة، pH 8.0) واحتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
   2. أغسل اللوحة خمس مرات وإضافة 100 ميليلتر من إنزيم الركازة الحل لكل بئر. اترك اللوحة في الظلام لوضع لمدة 15 دقيقة، ووقف رد الفعل بإضافة 100 ميليلتر من حامض الكبريتيك 0.18 متر (ح₂هكذا₄).
      تنبيه: ح₂حتى₄ التآكل.
8. تحديد تركيز الزلال كل عينة عن طريق قراءة اللوحة في امتصاص 450 نانومتر. استخدام المنحنى القياسي لقياس الزلال موجودة في كل عينة. إذا كان يكرر التقنية السيرة ذاتية قيمة أكبر من 5%، كرر التحليل تلك العينات.
9. وبدلاً من ذلك، تقييم تركيز الزلال البولي باستخدام التفريد. إضافة 5 ميليلتر من 4 × البروتين عينة تحميل المخزن المؤقت إلى 15 ميليلتر من البول. الحرارة عينات إلى 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم قم بتحميل إلى هلام تريس الجاهزة 4-12%.
   1. تشغيل الهلام في 100 الخامس ووصمة عار بين عشية وضحاها في أخذ اللون الأزرق للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
   2. وبعد التصوير الهلام، استخدام قياس كثافة لتقييم إضعاف تركيز الزلال التغيير بالنسبة لعنصر التحكم.
      ملاحظة: في حالة ملاحظة لا فرق بالنسبة للزلال عندما يتوقع، تقييم تركيز البروتين البول وضبط حجم البول إضافة إلى الهلام.
10. تمييع عينة البول الخام في dH₂س في 1:1 و 1:5 و 01:10.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم نهاية > 70 ميليلتر. الأمثل لتحديد تمييع الحق لكل عينة.
11. قياس تركيز كرياتينين البول استخدام تحليل كيميائية كل مجموعة التعليمات. بإيجاز، تحميل 20 ميليلتر كرياتينين البول فارغة، أو تضعف المعايير، لوح جيدا 96 في ثلاث نسخ.
12. تحديد تركيز كرياتينين لكل عينة بقراءة اللوحة في امتصاص 490 نانومتر قبل وبعد إضافة الحل حمض (تنبيه، أكالة؛ تجنب ملامسة الجلد).
    ملاحظة: الفرق بين القيم امتصاص طرديا مع تركيز كرياتينين في كل عينة. منحنى قياسي جيل من المعايير. إذا كان يكرر التقنية السيرة ذاتية قيمة أكبر من 5%، كرر التحليل تلك العينات.
13. إنشاء أواكر (ميكروغرام/mg). تطبيع البيانات إلى قيمة الأساس لكل الماوس لتمثيل رسومي.

2-الأنسجة وجمع الدم

ملاحظة: الكلي والأنسجة الكبيبي يمكن أن تستخدم لتقييم علامات التعبير البروتين والهيكلية، ومرناً لأمراض الكلي. يمكن استخدام الدم لتقييم علامات لوظيفة الكلي، مثل كرياتينين، التي يمكن تنظيمها حتى في أمراض الكلي، مما يشير إلى انخفاض في قدرة الترشيح glomeruli.

1. إعداد الحلول التالية: الطازجة 2.5 ٪ glutaraldehyde في بارافورمالدهيد 4% في 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، الحل في المسابقة الثدييات (115 مم كلوريد الصوديوم (NaCl)، خلات الصوديوم 10 ملم (CH₃كونا) و 1.2 م 0.1 الصوديوم كاكوديلاتي (7.3 درجة الحموضة)، مم فوسفات الصوديوم (Na₂هبو₄)، بيكربونات الصوديوم 25 مم (ناكو₃)، سلفات المغنيزيوم 1.2 مم (مجسو₄)، كلوريد الكالسيوم 1 مم (كاكل₂)، الجلوكوز د (+) 5.5 مم، الرقم الهيدروجيني 7.4) مع جيش صرب البوسنة 1%، و 1 x PBS.
   تنبيه: 2.5 ٪ glutaraldehyde: السامة، محسس، مهيجة؛ استخدم في خزانة الأبخرة. 0.1 كاكوديلاتي الصوديوم M: استخدام في خزانة الأبخرة السامة. 4% منهاج عمل بيجين: مثبت، الاستخدام في مجلس الوزراء الدخان
2. إعداد المواد التالية: إيسوفلوراني، حمض الإيثيلين الصغيرة (يدتا)-مغلفة بأنابيب الدم، إبر ز 23-25، 5 مل يدتا مغلفة الحقن، قنينات زجاج 10 مل، 10 مل قارورة من البلاستيك، أنابيب بلاستيكية 0.5 مل، قوالب الأنسجة المتاح، الثلج الجاف، السائل ن ₂، الماوس الأدوات الجراحية، وقطع الأمثل المتوسطة (OCT).
3. ضع الماوس تحت التخدير العميق، الذي يمكن التحقق منه بالماوس ويجري غير المستجيبة لوخزة إبرة إلى لوح سيرا على الأقدام، باستخدام دائرة isoflurane، أو ما يعادل طرق التخدير الطرفي مثل وكلاء مخدر عن طريق الحقن (بينتوباربيتال، 50 مغ/كغ داخل [IP]؛ أفيرتين، IP 240 ملغ/كغ)، أو التعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون (CO₂) (75% CO_2%25 س₂).
4. إعدام الماوس عبر ثقب القلب في البطين الأيسر وجمع الدم قدر الإمكان. نقل إلى أنبوب الدم يدتا المغلفة لما يصل إلى 4 س. إذا فضلت, يمكن أعدمت الفئران عن طريق خلع عنق الرحم مع الحرص على عدم تمزق حبل الوريد.
5. تشريح الخروج الكلي عن طريق البطن والمياه والصرف الصحي في برنامج تلفزيوني x 1 الباردة الجليد.
6. دراسة جلوميرولي القشرية وإزالة القطب واحد من قشرة الكلي وإلى قطع³ 1 مم. دراسة glomeruli العميقة المجاورة النخاع، كرر نفس الأسلوب مع الأنسجة من لب. ضع 5 مل من 2.5 ٪ glutaraldehyde الحل في قنينة زجاج م. مخزن في 4 درجات مئوية.
   تنبيه: 2.5 ٪ glutaraldehyde الحل: السامة، محسس، مهيجة؛ استخدم في خزانة الأبخرة
   ملاحظة: العملية في غضون شهر 1 للحصول على أفضل النتائج.
7. بالنسبة لعلم الأنسجة، إزالة الثالث العلوي الكلي، لضمان جلوميرولي القشرية والمجاورة النخاع على حد سواء سيكون حاضرا، والإصلاح في 5 مل بارافورمالدهيد 4% في 4 درجات مئوية عن 24 حاء التحويل إلى 5 مل من 70% EtOH لمدة 24 ساعة قبل تضمينها في البارافين.
   تنبيه: 4% منهاج عمل بيجين: مثبت، الاستخدام في مجلس الوزراء الدخان
8. الفلورة، مكان ثالث للكلى، لضمان جلوميرولي القشرية والنخاع على حد سواء سيكون حاضرا، في الأنسجة العفن ومعطف في أكتوبر الماضي على الثلج الجاف تجميد وتخزين في-80 درجة مئوية.
9. للبروتين والحمض النووي الريبي، تجميد مكان 3 × 2 مم³ قطعة من قشرة الكلي إلى 0.5 مل أنابيب بلاستيكية والمفاجئة في سائل ن₂. مخزن في-80 درجة مئوية. للتخزين طويل الأجل الأنسجة للجيش الملكي النيبالي، وضع الأنسجة في 5 مجلدات من الحمض النووي الريبي تثبيت الحل وتخزينها في-80 درجة مئوية.
10. لعزل glomeruli، شريحة حتى النسيج الكلي المتبقية ووضع في 5 مل من محلول الثدييات المسابقة مع جيش صرب البوسنة 1% على الجليد. إعداد منخل glomeruli فورا.

3-البلازما كرياتينين

ملاحظة: يمكن كرياتينين البلازما حتى ينظم في أمراض الكلي، مما يشير إلى انخفاض في قدرة الترشيح glomeruli. ويمكن أيضا تقييم مستويات النيتروجين (بون) اليوريا في الدم، على الرغم من أن البروتوكول لا يرد هنا.

1. الطرد المركزي عينة الدم في 500 غ س لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
2. جمع البلازما، التي يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية في الأجل القصير في هذه المرحلة.
3. قياس تركيز كرياتينين البلازما استخدام مقايسة كرياتينين كيميائية كل الإرشادات المذكورة أعلاه كرياتينين البول في البروتوكول 1.11.
4. تحديد تركيز كرياتينين لكل عينة بقراءة اللوحة في امتصاص 490 نانومتر قبل وبعد إضافة حمض الحل.
   ملاحظة: الفرق بين هذه القيم امتصاص طرديا مع تركيز كرياتينين في كل عينة. منحنى قياسي جيل من المعايير. إذا كان يكرر التقنية السيرة ذاتية قيمة أكبر من 5%، كرر التحليل تلك العينات.

4-عزل جلوميرولي

ملاحظة: يمكن أن تكون معزولة Glomeruli لتقييم نفاذية glomeruli الفردية السابقين فيفو، فضلا عن التعبير عن البروتين محددة وعلامات مرناً للمرض الكبيبي.

1. تأخذ الأنسجة الكلي في الحل الثدييات المسابقة مع جيش صرب البوسنة 1% وتشريح جلوميرولي استخدام معيار النخل تقنية¹³. بإيجاز، كومة 70 ميكرومتر (أسفل)، 100 ميكرومتر، 125 ميكرومتر، ميكرومتر 175، 250 ميكرون، وثقب سيتا (العلوي) ميكرومتر 425 إلى كوب زجاج.
2. الهريس في الكلي، واستخدام المكبس المحاقن، إلى ميكرومتر 425 منخل والدفع من خلال استخدام الحل للجليد الباردة الثدييات في المسابقة مع جيش صرب البوسنة 1%. من خلال دفع البتات الكلي، إزالة غربال أعلى والمضي قدما للقيام بنفس الشيء على التالي. كرر حتى فقط 100 ميكرومتر و 70 ميكرومتر ثقب سيتا البقاء.
3. نقل الحصاد الكبيبي الإبقاء 100 ميكرومتر و 70 ميكرومتر ثقب سيتا إلى 10 مل من محلول المسابقة الثدييات جديدة مع جيش صرب البوسنة 1%، على الجليد.
   ملاحظة: إذا كان عدد glomeruli كل حل مل المسابقة القليلة، تقليص حجم الحل للمسابقة المستخدمة لجمع في جلوميرولي من ثقب سيتا الأخيرتين.
4. إزالة 5 مل الحل الذي يحتوي على جلوميرولي في أنابيب منفصلة اثنين (2.5 مل في كل) وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية وتجميد الأداة جلوميرولي في السائل ن₂ قبل تخزينها في-80 درجة مئوية للبروتين واستخراج الحمض النووي الريبي في وقت لاحق.
5. ضع الحل المتبقية المحتوية على جلوميرولي في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لقياس الكبيبي L_pA/V_أناالسابقين فيفو. كاملة داخل ح 3 من إزالة الكلي.

5-نفاذية المياه الكبيبي (L_pA/V_أنا)

ملاحظة: الكبيبي L_pA/V_أنا المقايسة تمكن السابقين فيفو قياس نفاذية glomeruli الفردية في استنساخه بطريقة سريعة. زيادة الكبيبي L_pA/V_أنا يشير إلى تعطل جفب، وتوحي بمرض كلوي.

1. إعداد الكبيبي L_pA/V_أنا تلاعب كما هو موضح في سمك السلمون وآخرون¹⁰. يرجى الرجوع إلى الشكل 1 لرسم تخطيطي مفصل لتعيين لأعلى.
2. إعداد الحلول التالية: حل الثدييات المسابقة مع جيش صرب البوسنة 1% (درجة الحموضة 7.4) وحل الثدييات المسابقة مع جيش صرب البوسنة 8% (درجة الحموضة 7.4). الدافئة على حد سواء إلى 37 درجة مئوية.
3. سحب ميكروبيبيتيس من أنابيب شعرية زجاجية (الكثافة البصرية: 1.2 مم). إنشاء تلميح 5-8 ميكرومتر فتحه بقطع ميكروبيبيتي تحت مجهر.
4. استخدام الكبيبي L_pA/V_أنا تلاعب للقبض على جلوميرولي الفردية سليمة خالية من كبسولة بومان الشعبية وشظايا أنبوبي على ميكروبيبيتي استخدام الشفط. تم العثور على ملخص مفصل للانزيم أونكوميتريك في سمك السلمون وآخرون¹⁰. وباختصار، عندما اشتعلت الكبيبة والمضمونة في ميكروبيبيتي الشفط، بدء تسجيل فيديو الكبيبة تحت المجهر.
5. أولاً، حجته الكبيبة في الحل المسابقة 1% جيش صرب البوسنة لمدة 30 ثانية قبل التبديل بريفوست حل المسابقة جيش صرب البوسنة 8% مركزة 10 s. ثم التبديل بريفوست إلى حل لجيش صرب البوسنة في المسابقة 1% وإيقاف التسجيل.
6. يغسل في الكبيبة وكرر العملية 10-15 جلوميرولي الواحدة والماوس. التأكد من أن معدلات تدفق بريفوست متطابقة ولا بسرعة (10 مل/دقيقة) حتى لا يؤدي إلى تشويه هيكل الكبيبي.
7. قياس معدل انكماش الكبيبي لحساب نفاذية المياه الكبيبي (L_pA) تطبيع حجم الكبيبي (الخامس_أنا) الأولى. يمكن الاطلاع على معلومات مفصلة بشأن التحليل في¹⁰من سمك السلمون وآخرون.

6-حامض الدوري Schiff (PAS) وصمة عار

ملاحظة: سوف تبرز وصمة عار نظام تقييم الأداء الأغشية الطابق السفلي من الحلقات الشعرية الكبيبي وظهاره أنبوبي. أنه يمكن التصور مفصلة الخلايا الكبيبي و mesangial مصفوفة وإمكانية التوسع، والتغيرات المحتملة الخليج للحاسبات الآلية (أي، وسماكة المخالفات).

1. الفرع قشرة الكلي جزءا لا يتجزأ من البارافين، ومنهاج عمل بيجين--الثابتة باستخدام مبضع في 5 ميكرون سمك على الشرائح بولي-L-يسين المغلفة. الجافة في 37 درجة مئوية حاء 1 ضمان القسم لا يحتوي على أي طيات أو الثقوب، التي يمكن أن تشوه مورفولوجية تحت المجهر.
2. ديبارافينيزي الشرائح التي تفرخ مرتين في زيلين نفط (تنبيه، مهيجة؛ والاستخدام في مجلس الوزراء الدخان) لمدة 3 دقائق، مرتين في 100% EtOH لمدة 3 دقائق، ومرة واحدة ثم في 95% و 70% و 50% EtOH لدقيقة 3 كل، كلها في درجة حرارة الغرفة. إعادة هيدرات الشرائح الموجودة في العرض dH₂o.
3. احتضان الشرائح في حل حامض الدوري (تنبيه، مهيجة؛ والاستخدام في مجلس الوزراء الدخان) (1 غ/دل) لمدة 5 دقائق، وشطف ثم استخدام الشرائح في عدة تغييرات dH₂سين حاوية مع 100 مل dH₂س في درجة حرارة الغرفة.
   تنبيه: حمض الدوري الحل: مهيجة؛ استخدم في مجلس الوزراء الدخان
4. احتضان الشرائح في شيف لكاشف (HCl باراسوانيليني ز 6/لتر والصوديوم بيروكبريتيت 4 ٪ في HCl 0.25 مول/لتر) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغسل شرائح في إدارة مياه الحنفية لمدة 5 دقائق.
5. كونتيرستين مع توضع 3 s قبل الشطف دقة الشرائح في إدارة مياه الحنفية لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: قد تتطلب بعض التحسين لتحديد الوقت الأمثل لتلوين الهيماتوكسيلين.
6. يذوي الشرائح باستخدام على عكس بروتوكول ديبارافينيزيشن في الخطوة 6، 2. إنهاء مع زيلين نفط.
7. الشرائح الهواء الجاف وجبل مع الوسائط المستندة إلى زيلين نفط المتصاعدة.
8. الصورة على مجهر ضوء على 400 X التكبير لتقييم هياكل الكبيبي. تقييم ما يلي: مخالفات الخليج للحاسبات الآلية، وسماكة تنهار الحلقات الشعرية، أنسجة تليفية، والتصلب، وانتشار الهاتف الخلوي (بطانية، بودوسيتي، وميسانجيال، أو الخلايا التحريضية التسلل إلى خصل).
   ملاحظة: لإجراء تقييم شامل للفيزيولوجيا المرضية الكبيبي، الآفات في أماكن أخرى في الكلي ينبغي أن يكون تقييمها، مثل الأنابيب.

7-مجهر إلكتروني (TEM)

ملاحظة: تيم يسمح بدراسة التشوهات الهيكلية فائقة في الكلي، مثل الخليج للحاسبات الآلية، والعمليات بودوسيتي سيرا على الأقدام، وفينيستريشنز بطانية، التي لا تظهر بالفحص المجهري الخفيفة. هذا أمر مهم في نماذج فيها الضرر الكلوي لا حتى يشتد (أي، لا بيله، والتشوهات الهيكلية الرئيسية).

1. تأخذ 2.5% جلوتيرالديهديي--الثابتة مكعبات الكلي وبعد إصلاحها في أكسيد أوزميوم 1% حاء 1 يغسل في 50 مل من 0.1 م كاكوديلاتي المخزن المؤقت (7.3 درجة الحموضة)، ومن ثم 50 مل من dH₂س (التغييرات 3 × 15 دقيقة).
   تنبيه: 2.5 ٪ glutaraldehyde: السامة، محسس، مهيجة؛ استخدم في خزانة الأبخرة. 0.1 كاكوديلاتي الصوديوم M: استخدام في خزانة الأبخرة السامة
2. يذوي مع EtOH وتضمين في الراتنج أرالديتي.
3. قطع المقاطع في سمك 50-100 نانومتر ووصمة عار مع خلات اليورانيل (مائي) 3% وحل سترات الرصاص رينولدز.
4. تأخذ ميكروجرافس الرقمية عبر عدة مناطق من الكبيبة في 940 X، 1250 X، و 6200 العاشر للتأكد بودوسيتيس، جينكس، الخليج للحاسبات الآلية، وميسانجيوم يمكن التعرف.
5. استخدم إيماجيج لتحليل glomeruli أعمى. ضبط المقياس لكل صورة مجهرية 6200 العاشر من رسم خط بين نقطتين من المسافة المعروفة، مثل مسطرة. الانتقال إلى تحليل ثم قم بتعيين المقياس، حيث سيتم عرض طول الخط بالبكسل. اكتب المسافة المعروفة ووحدات القياس. استخدام البروتوكولات المذكورة أدناه لقياس كل معلمة.
   ملاحظة: يتطلب هذا التحليل اليوم حوالي 1 لكل الماوس. لقوة إحصائية كافية، استخدام قياسات متوسط من 3 جلوميرولي من الفئران 3.
   1. الخليج للحاسبات الآلية، إدراج شبكة رقمية ثابتة (10 × 10) على صورة مجهرية 6200 العاشر وقياس سمك الخليج للحاسبات الآلية في النقطة التي تعبر فيها خطوط الشبكة في الخليج للحاسبات الآلية. قياس من غشاء الخلية القاعدية بطانية لغشاء الخلية القاعدية بودوسيتي العملية سيرا على الأقدام في ظل عمودي لغشاء الخلية البطانية باستخدام أداة الخط المستقيم. تحديد قياس متوسط لكل الكبيبة من القياسات الفردية 10.
   2. عدد التثقب بطانية، قياس طول الخليج للحاسبات الآلية الموجودة في صورة مجهرية 6200 العاشر وحساب عدد فينيستريشنز بطانية كل وحدة طول الخليج للحاسبات الآلية. يستغرق في متوسط من ميكروجرافس على الأقل 4 في الكبيبة.
   3. بودوسيتي القدم عملية العرض، أدخل شبكة رقمية ثابتة (10 × 10) على صورة مجهرية 6200 العاشر. قياس عرض العمليات بودوسيتي سيرا على الأقدام عبر خطوط الشبكة. قياس العرض في الجزء أوسع عملية سيرا على الأقدام حيث تجتمع في الخليج للحاسبات الآلية؛ التأكد من الخط عمودي على المماس للغشاء القاعدي بودوسيتي. تحديد قياس متوسط لكل الكبيبة من القياسات الفردية 10.
   4. بودوسيتي شق العرض، بإدراج شبكة رقمية ثابتة (10 × 10) على صورة مجهرية 6200 العاشر. قياس عرض أغشية الشق بودوسيتي أن عبر خطوط الشبكة. هذه هي المرحلة التي يتم فيها عمليات القدم أقرب معا، في الجزء أوسع عملية سيرا على الأقدام، وكل من بودوسيتي الغشاء للغشاء. تأكد من القياس عمودي على المماس للغشاء القاعدي بودوسيتي. تحديد قياس متوسط لكل الكبيبة من القياسات الفردية 10.
   5. لعدد بودوسيتي القدم العمليات وقياس طول الخليج للحاسبات الآلية الموجودة في صورة مجهرية 6200 العاشر وحساب عدد العمليات القدم بودوسيتي كل وحدة طول الخليج للحاسبات الآلية. يستغرق في متوسط من ميكروجرافس على الأقل 4 في الكبيبة.
   6. لتغطية مساحة sub-بودوسيتي، راجع الطريقة المفصلة في نيل et al. ¹⁴.
6. استخدام ميكروجرافس X 940، دراسة جلوميرولي لوجود بنية غير طبيعية، والودائع، وتتسرب بالعين المجردة.

8-الفلورة بودوسيتي وعلامات غشائي

ملاحظة: يسمح Immunostaining تصور أنماط التعبير البروتين، مثل الحلقات الشعرية بطانية، ويمكن أن تنهار في أمراض الكبيبي.

1. ضع أكتوبر-القالب يحتوي على الكلي المجمدة في-20 درجة مئوية ح 2 قبل تمزيقها. ضمان قطع سطح الكلي يوضع بعناية ضد الجزء السفلي من أكتوبر-العفن تمكين قطاعات النسيج الموجه.
2. استخدام كريوستات، قسم الأنسجة في سمك 5 ميكرومتر إلى بولي-L-يسين المغلفة الشرائح.
   ملاحظة: ضمان لا توجد الطيات أو ثقوب في قسم الأنسجة، التي يمكن أن تشوه مورفولوجية.
3. عند إزالة من كريوستات، إصلاح الشرائح في 4% الشرائح منهاج عمل بيجين للحد الأدنى 10 يغسل 3 × 5 دقيقة في حاوية مع 100 مل من dH₂o.
   تنبيه: 4% منهاج عمل بيجين: مثبت، الاستخدام في مجلس الوزراء الدخان
4. لتقليل الكمية من الأجسام المضادة المستخدمة، رسم حول الأقسام بقلم مسعور. لا تدع الأجزاء الجافة.
5. احتضان في عرقلة حل (BSA 3% والمصل العادي 5% في برنامج تلفزيوني x 1) ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
6. إزالة الحل حظر مع المضخة واحتضان الأقسام مع جسم الابتدائي (نيفرين أو بودسين أو بيكم-1) المخفف 1: 250 (3% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني س 1). وضع الشرائح في دائرة هوميديفيد في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. إذا لم يتوفر دائرة رطبة، خفيفة ضع شريط صغير من بارافيلم على الشريحة المغلفة بالأجسام المضادة. العناية عند إزالة في اليوم التالي فيما يتعلق بعدم تعطيل القسم.
7. تغسل شرائح 3 x 5 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1 x.
8. احتضان مع جسم الثانوي الفلورسنت المناسب تمييع 1: 1000 (BSA 3% في برنامج تلفزيوني 1 x) عن ح 2 في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
9. تغسل شرائح 3 x 5 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1 x. جبل مع الفلورسنت تصاعد الوسائط التي تحتوي على DAPI.
10. صورة الشرائح مع مجهر فلوري في 400 X التكبير لعرض glomeruli. ضمان هذا هو أعمى لتجنب التحيز.
11. استخدام إيماجيج لتحليل كثافة المصبوغة، تطبيع لمنطقة الكبيبي، ونمط تلطيخ، أي، عدد الحلقات الشعرية تطبيع إلى منطقة الكبيبي، على نحو أعمى.

9-البروتين الاستخراج والنشاف الغربية

ملاحظة: النشاف الغربية يسمح لنا بتقييم تعبير البروتينات من المعروف أن dysregulated في أمراض الكلي. على سبيل المثال، انخفاضا في التعبير بودسين ونيفرين تشير إلى فقدان بودوسيتي.

1. استخراج البروتين من قشرة الكلي وينخل glomeruli؛ البروتوكول هو نفسه بالنسبة لكل منهما، ويتم ضبط حجم المخزن المؤقت لتحلل كمية الأنسجة.
2. ذوبان الجليد الكلي/جلوميرولي على الجليد قبل إضافة تحلل NP-40 المخزن المؤقت مثبطات البروتياز والفوسفاتيز المحتوية على (150 مم كلوريد الصوديوم، 1% التي أرستها-40، 50 مم تريس pH 8). مجانسة العينة لمدة 30 ثانية.
3. احتضان هذه العينات المتجانس على الجليد لمدة 30 دقيقة، فورتيكسينج على فترات منتظمة.
4. الطرد المركزي العينات في 10,000 ز س لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
5. إزالة المادة طافية على أنبوب جديد على الجليد.
   ملاحظة: نتوقع لاسترداد حوالي 1 ملغ بروتين كل عينة.
6. تؤذي البروتينات باستخدام المخزن المؤقت x Laemmli 4 القياسية. يغلي الخليط في 95-100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
7. تقييم تعبير البروتينات علامة الخلية الكبيبي (نيفرين، بودسين، بيكم-1، إلخ.) والفسفره والتعبير عن البروتينات المعروفة باسم/الفرضية قد تكون غيرت في الكلي/جلوميرولي الطراز المرض باستخدام الغربية النشاف ( الأسلوب القياسي؛ محمود ويانغ¹⁵).
   ملاحظة: تتنوع البروتوكول تبعاً لحجم ووفرة من بروتين الفائدة.

10-الجيش الملكي النيبالي الاستخراج وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)

ملاحظة: تحليل التعبير مرناً يسمح لنا بتحديد كيف ينظم الجينات في الأمراض الكلوية، مثل التغيرات في التعبير الجيني والربط بديلة.

1. بينما لا يزال يتم تجميد قشرة الكلي، دقة طحن في 3 مل كاشف الفينول باستخدام مدقة وهاون. في حالة استخدام مقتطفات الكبيبي، أضف 1 مل كاشف الفينول ومجانسة العينة لمدة 30 ثانية.
   تنبيه: تريزول كاشف: مهيجة؛ استخدم في مجلس الوزراء الدخان
2. القيام باستخراج الحمض النووي الريبي استخدام الطريقة الموصوفة ب تشومكزينسكي وساكي¹⁶.
   ملاحظة: تتوفر مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي التجارية كبديل لهذا الأسلوب.
3. تقييم كمية ونوعية للجيش الملكي النيبالي الحصول عليها باستخدام أحد الأساليب المختلفة المتاحة. الجيش الملكي النيبالي اليكووتيد والمخزنة في-80 درجة مئوية في هذه المرحلة. تجنب تكرار تجميد ذوبان الجليد.
   ملاحظة: إذا كان جديداً على هذا الأسلوب، التحقق من جودة الجيش الملكي النيبالي قبل المتابعة إلى الخطوة التالية عن طريق تشغيل الجيش الملكي النيبالي على [اغروس] هلام لضمان 28S واضحة والفرقة ريبوسومال 18S. ويتوقع لاسترداد بين 2 إلى 5 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي باستخدام هذا الأسلوب.
4. علاج الدناز 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي (جعل حجم ما يصل إلى 10 ميليلتر مع المياه خالية من رناسي زائد 1 ميليلتر من الدناز و 1 ميليلتر من المخزن المؤقت الدناز) ح 1 في 37 درجة مئوية. التوقف عن رد فعل مع 1 ميليلتر الدناز وقف الحل عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
5. إضافة 0.5 ميليلتر اليغو (dT) وكبسولة تفجير عشوائي. تبني على 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
6. إخماد فورا على الجليد لمدة 5 دقائق.
7. يضاف ما يلي؛ ملف إنزيم المنتسخة العكسية (400 ش؛ واستبدال مع ديبك ح₂س في الرايت-نموذج عنصر تحكم)، ملف المخزن المؤقت (س 1)، دنتب ميكس (0.5 ملم)، و ribonuclease المانع (40 ش)؛ أن يصل إلى 50 ميليلتر ماء ديبك.
8. احتضان ميكس رد فعل في 37 درجة مئوية ح 1 تليها 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإلغاء تنشيط الإنزيم.
   ملاحظة: لتوليد عائد أعلى من كدنا، احتضان في 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 ساعات.
9. تقييم كمية ونوعية كدنا استخدام الأساليب المختلفة المتاحة.
10. استخدام PCR لتقييم أنماط التعبير والربط مرناً للجينات الافتراض بأن تكون dysregulated في نموذج المرض الكبيبي. البروتوكول يختلف حسب الجينات للفائدة.

النتائج

وجمعت البول استخدام الأقفاص الأيضية من نوع البرية (WT) الخاصة بودوسيتي فيجف-أ ضرب إيندوسيبلي (فيجفا كو) والفئران ب₁₆₅فيجفا كو X نيف-VEGF (الفئران "فيجفا كو" الإفراط تعبر عن isoform ب البشرية VEGF-أ₁₆₅في بودوسيتيس في طريقة التأسيسي). عند قياس نسبة كرياتينين الزلال البولي في الأسابيع 0, 4 و 10 و 14 بعد تحريض الدوكسي "كو فيجفا"، وضعت الفئران "فيجفا كو" بيله التدريجي قبل 10 أسابيع مقارنة بوزن ليتيرماتي عناصر التحكم. يمكن أن ينظر إليه القيم المطلقة في الشكل 2 ألف، وتم تسويتها بخط الأساس لكل قيم الماوس في الشكل 2. بيله في لا تراعي في الفئران ب₁₆₅فيجفا X نيف-فيجف-أ (الشكل 2)، مما يشير إلى أن فيجف-أ₁₆₅ب غير الواقية في نموذج بيله⁵.

الكبيبي ل_فAV_أنا كان قياس glomeruli الفردية غربلة من وزن، فيجفا كو، والكلى ب₁₆₅نف س فيجفا-فيجف-أ. مثال عن كيف يتم صيده من الكبيبة والانكماش لاحظ عندما بيريفوسيد مع جيش صرب البوسنة 8% ويرد في الشكل 3A. ثم يتم استخدام هذا الانكماش لتحديد الكبيبي L_pA/V_أنا لكل الكبيبة (الشكل 3B). فيجف-أ كو الفئران قد زيادة كبيرة الكبيبي L_pA/V_أنا في 14 أسبوعا آخر التعريفي VEGF-كو جلوميرولي التحكم بالوزن بالمقارنة مع. على الرغم من أن أقل في فيجفا س نيف-فيجف-أ₁₆₅ب الفئران، L الكبيبي زيادة_فA/V_أنا لم يمنع من التعبير المفرط عن VEGF-أ₁₆₅ب 14 أسبوعا⁵.

PAS تلطيخ أبواب قشرة الكلي 14 أسبوعا بعد تحريض "كو فيجفا" لم تكشف عن أي شذوذ هيكلية الكبيبي في كو فيجفا أو فيجفا X نيف-فيجف-أ الفئران ب₁₆₅(الشكل 4 أ). بيد بناء على تحليل للهيكل الترا الكبيبي عن طريق م، "كو فيجفا" الفئران قد نمواً زيادة عرض الخليج للحاسبات الآلية وانخفض عدد fenestrae بطانية، انخفاض التغطية النباتية، وزاد متوسط بودوسيتي شق العرض (الشكل 4-4F ). عملية القدم بودوسيتي متوسط العرض وعدد من الشقوق وظلت دون تغيير (الشكل 3B والجيل الثالث 3g). منع التغييرات إلى الخليج للحاسبات الآلية التعبير المفرط عن ب VEGF-أ₁₆₅في الفئران "فيجفا كو" وشق العرض (الشكل 4 و 4F). بيد أنه فيجف-A₁₆₅ب أي تأثير على عدد فينسترا المعدلة والصحة والصحة النباتية التغطية (الشكل 4 و 4E)⁵.

RT-PCR تجري على الحمض النووي الريبي المستخرج من glomeruli ينخل كشفت أن ب₁₆₅ألف VEGF البشرية مرناً موجودة فقط في الفئران ب₁₆₅فيجفا كو X نيف-فيجف-أ (الشكل 5A). عند استخراج البروتين من glomeruli ينخل وتقييم مستويات البروتينات عن طريق النشاف الغربية، تعبير البروتين الكبيبي فيجفر-2 وجد أن يكون قد انخفض في الفئران "فيجفا كو"، الذي منعت بسبب الإفراط في التعبير عن VEGF-أ₁₆₅ب ( الشكل 5B وج 5)⁵.

الشكل 1. إعداد البيانية من تلاعب نفاذية الكبيبي (L_pA)- (أ) يتم القبض عليه في الكبيبة في (ب) ميكروبيبيتي داخل حامل استخدام الشفط، التي فرضت على جبل للاستقرار. (ج) ميكروسليدي مستطيلة. (د) الهدف X 4 مجهر مع كاميرا فيديو. (ه) درجة حرارة حل جيش صرب البوسنة 1% إلى 37 درجة مئوية. (و) تحسنت حل جيش صرب البوسنة 8 ٪ إلى 37 درجة مئوية. (ز) بعد الاستفادة من تأثير هذين الخطين المحتوية على بريفوست، الذي يسمح بتبادل بريفوست السريع. (ح) مسار بريفوست نحو ميكروسليدي، الذي ثم تستحم في الكبيبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2. نسبة كرياتينين الزلال البولي. (أ) القيم أواكر في الأسابيع 0, 4 و 10 و 14 بعد تحريض "كو فيجفا" في الفئران ب₁₆₅WT فيجفا كو ونف س فيجفا-فيجف-أ. (ب) تطبيع نفس القيم أواكر إلى قيمة خط الأساس (الأسبوع 0) كل الماوس الفردية. أواكر زيادة كبيرة في الفئران "فيجفا كو" في الأسابيع 10 و 14 مقارنة WT ليتيرماتي عناصر التحكم، التي منعت في الفئران ب₁₆₅فيجفا X نيف-فيجف-أ (* p < 0.05؛ ثنائية الاتجاه ANOVA، تصحيح للمقارنة بين أزواج; n = 4-12 الفئران كل الوقت نقطة؛ أشرطة الخطأ: الخطأ المعياري للوسط [SEM]). وقد تم تعديل هذا الرقم من ستيفنز وآخرون⁵. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3. قياس نفاذية المياه الكبيبي. (أ) يتم القبض عليه في الكبيبة في ميكروبيبيتي عن طريق شفط؛ يتم تبديل بريفوست من جيش صرب البوسنة 1% (منظمة العفو الدولية) إلى 8% جيش صرب البوسنة (أخي)، ويلاحظ تقلص الكبيبي. (ب) تستخدم القياسات المتخذة قبل وبعد رمز التبديل جيش صرب البوسنة 8% لتحديد الكبيبي L_pA/V_أنا. (ج) وضع الفئران "كو فيجفا" زيادة الكبيبي L_pA/V_أنا في الأسابيع 14 وظيفة تحريض "كو فيجفا" مقارنة بضوابط WT. وهذا لم يمنع إلى حد كبير في الفئران ب₁₆₅فيجفا X نيف-فيجف-أ (* p < 0.05؛ طريقة واحدة ANOVA، تصحيح بونفيروني للمقارنة بين أزواج; n = 4-9 الفئران، جلوميرولي 15-30؛ أشرطة الخطأ: وزارة شؤون المرأة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4. التحليل الهيكلي الكبيبي. (أ) PAS تلطيخ من قشرة الكلي لم تشر إلى أي شذوذ هيكلية في جلوميرولي من وزن، فيجفا كو ونيف س فيجفا-فيجف-أ₁₆₅ب الفئران (منظمة العفو الدولية-ثالثا). م كشف التشوهات الهيكلية فائقة في جلوميرولي "كو فيجفا" (Aiv-سادسا). (ب) لم تتغير الخطة الإطارية للمرأة متوسط بين المجموعات. (ج) زيادة "الخليج للحاسبات الآلية" في glomeruli "كو فيجفا"، التي منعت VEGF-أ₁₆₅باء (د) قد انخفض عدد فينسترا في جلوميرولي "فيجفا كو"، الذي ظل دون تغيير بالتغطية "الصحة والصحة النباتية" (ه) باء-فيجف-A₁₆₅ وقد انخفض في جلوميرولي "فيجفا كو"، الذي أيضا لم يتغير VEGF-أ₁₆₅باء (و) زاد متوسط شق العرض في جلوميرولي "كو فيجفا"، والتي منعت بسبب VEGF-أ₁₆₅ب (ز) عدد الشق لم يتغير بين المجموعات الثلاث (* p < 0.05؛ طريقة واحدة ANOVA، تصحيح بونفيروني للمقارنة بين أزواج; n = 3 الفئران، جلوميرولي 9؛ أشرطة الخطأ: وزارة شؤون المرأة). وقد تم تعديل هذا الرقم من ستيفنز وآخرون⁵. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 5. التعبير مرناً والبروتين من علامات. (أ) RT-PCR أظهر أن₁₆₅ألف VEGF البشرية ب مرناً التعبير فقط واضحة في glomeruli ينخل من الفئران ب₁₆₅فيجفا كو X نيف-فيجف-أ. (ب) النشاف غربية أشارت إلى أن التعبير البروتين فيجفر-2 أسفل-ينظم glomeruli "كو فيجفا"، التي منعت في فيجفا كو X نيف-فيجف-أ جلوميرولي ب₁₆₅(* p < 0.05؛ طريقة واحدة ANOVA، تصحيح بونفيروني للمقارنة بين أزواج; n = 3-6 فئران؛ أشرطة الخطأ: وزارة شؤون المرأة). وقد تم تعديل هذا الرقم من ستيفنز وآخرون⁵. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

ويصف هذا البروتوكول عمل الكلي كامل متابعة التي ينبغي الاضطلاع بها في نماذج الماوس من المرض الكبيبي، تمكين كمية هائلة من المعلومات المتعلقة بالكلى ودالة الكبيبي يمكن الحصول عليها من ماوس واحدة. الخطوات الحاسمة في كل أسلوب يسمح بتحليل الوظيفية والهيكلية والميكانيكية المفصلة للدالة الكبيبي، بما في ذلك تقييم نفاذية الكلي ككل (أواكر والبلازما، كرياتينين القياسات)، النفاذية جلوميرولي الفردية (الكبيبي L_pA/V_أنا)، دراسة التعديلات الهيكلية (نظام تقييم الأداء، تريتشرومي الأزرق، وطب الطوارئ)، البروتين التعريب (إذا كان)، والتعبير الجيني الكبيبي (RT-PCR والنشاف الغربية). هذه الأساليب هي المفتاح إلى تقييم كامل للدالة الكبيبي في نماذج الماوس لأمراض الكلي.

عند تقييم نفاذية جفب، اختارت العديد من الدراسات على استخدام معدل إفراز الزلال أواكر أو ح 24 التقليدية ك تدبير فعال^17،18. على الرغم من أن هذه التقنيات تسمح بتقييم نفاذية جفب ككل، فإنه لا يسمح بتقييم نفاذية الكبيبي الفردية والتباين بين glomeruli. وقد وجدت الدراسات السابقة قياس الكبيبي L_pA/V_i لتكون مقياسا أكثر حساسية للتغيرات إلى^5،نفاذية جفب⁹. في الواقع، في نتائج الممثل أظهر في هذه الورقة، في 14 أسبوعا بعد تحريض "كو فيجفا"، والفئران ب₁₆₅فيجفا كو X نيف-فيجف-أ أواكر أقل بكثير مقارنة بالفئران "كو فيجفا"؛ غير أن هذه النتيجة لا ينعكس في الكبيبي L_pA/V_أنا القياسات، حيث VEGF-أ₁₆₅ب لا يمنع إلى حد كبير يزيد في جفب النفاذية (الشكل 1 و الشكل 2)⁵. وهذا يبين أهمية استخدام فحوصات عدة لتقييم نفاذية الكلي ونفاذيه glomeruli الفردية. وعلاوة على ذلك، الكبيبي L_pA/الإنزيم أونكوميتريك_أنا الخامس تقترح أن نفاذية glomeruli الفردية من نفس الكلي يمكن أن تختلف إلى حد كبير، ونماذج خاصة المرض^{105،، 19}. حد واحد لقياس الكبيبي L_pA/V_أنا أنه يمكن فقط أداؤها في نقطة النهاية التجريبية؛ وهكذا، ملزمون بالقياسات أواكر العادية تعطي مؤشرا لنقطة النهاية التجريبية.

وبالإضافة إلى تقييم النمط الظاهري الوظيفية، تشجع الأسلوب الحالي أيضا تقييم النمط الظاهري الهيكلية و ultrastructural. يمكن أن يتم ذلك باستخدام مجموعة مختارة من البقع مثل نظام تقييم الأداء، تريتشرومي، والبقع الفضية؛ كل منهما لتقييم الجوانب المختلفة مورفولوجية الكبيبي. في نماذج الحادة من مرض الكبيبي، الذي غالباً ما يكون الحال في نماذج الماوس، يمكن أن يكون من الصعب على الكشف عن أي شذوذ هيكلية كبرى استخدام هذه البقع إلا إذا كنت أخصائي الكلي مدربين. ولذلك، يقترح إجراء م لتقييم أولتراستروكتوري جفب، مما يسمح القياس الكمي للمعلمات مثل الخليج للحاسبات الآلية، وحجم فينسترا بطانية وعدد وخصائص بودوسيتي. يتطلب الحد الأدنى من التدريب لأداء هذه القياسات وتمكن المحقق لتحديد الخلية-الأنواع/الهياكل المتضررة في نموذج مرض. في المثال المعروض في نتائج تمثيلية، تم العثور على الماوس "فيجفا كو" يكون نموذج معتدل للمرض الكبيبي، وهكذا، لا شذوذ هيكلية رئيسية حاضرين عند تلطيخ PAS. بيد الخاصة بودوسيتي "فيجفا كو" تحدث تغييرات إلى الخليج للحاسبات الآلية، بودوسيتيس، وخلايا بطانية عند دراسة هيكل الترا الكبيبي⁵. ولسوء الحظ، لا يمكن إعداد الكلي م الموصوفة في الأسلوب الحالي للكشف عن جليكوكاليكس بطانية، ومن المعروف أيضا أن تكون لها آثار على نفاذية جفب¹⁹. ولقياس عمق جليكوكاليكس بدقة، ينبغي الكلي نتخلل-ثابتة مع 2.5 ٪ glutaraldehyde مع 1% السيان الأزرق لوضع العلامات جليكوكاليكس بطانية، كما هو موضح في أولتين وآخرون¹⁹.

مرة واحدة وقد قسمت النمط الظاهري الوظيفية والهيكلية، يمكن تقييم أنماط التعبير/تفعيل جينات مختلفة ومسارات ثم على وجه التحديد في glomeruli. تقييم هيكلية فائقة مسبق يمكن أن يعطي بعض المعلومات فيما يتعلق بالخلية الكبيبي/أنواع الهياكل المعنية، التي تشير إلى ما إذا كان ينبغي دراسة الجينات/مسارات محددة بودوسيتي أو بطانية. على سبيل المثال، في نتائج تمثيلية من الفئران "فيجفا كو"، لوحظ انخفاضا في عدد fenestrae غشائي (3D الشكل)؛ ولذلك، كان بحث تعبير البروتين الكبيبي علامة غشائي المعروفة للمشاركة في مسار VEGF-أ؛ فيجفر-2 (الشكل 4)⁵. بالإضافة إلى التعبير عن البروتينات في جلوميرولي، الترجمة يمكن أيضا تصور استخدام إذا. في دراسة أجرتها تشانغ وآخرون²⁰، أكدت الخاصة بودوسيتي overexpression من GLUT1 في بودوسيتيس إذا شارك تعريب GLUT1 زيادة مع بودسين.

بالمقارنة مع طرق بديلة عرضت في الأدب لتقييم دالة الكبيبي، يتيح استخدام الطريقة المبينة في هذه الورقة لتقييم وظائف الكلي في نماذج الماوس من المرض الكبيبي النمط الظاهري الكبيبي تقييمه بشكل كامل من جوانب متعددة. باستخدام هذا الأسلوب، الباحث قادراً على تحديد النمط الظاهري الكلي للنموذج وتقييم الآلية بشأن لماذا يتطور النمط الظاهري. هذه المعلومات الحيوية عن الآلية المرض مطلوب عند دراسة السبل العلاجية المحتملة في هذه النماذج. يمكن تطبيق هذا الأسلوب بسهولة للتحقيقات مستقبلا في وظيفة الكبيبي سواء في التقييم تعمل المرض والعلاجات المحتملة.

وفي الختام، يصف هذا البروتوكول عام وقابلة للتكيف الكلي كامل عمل الهاتفي لنماذج الماوس من المرض الكبيبي، تمكين كمية هائلة من المعلومات المتعلقة بالكلى ودالة الكبيبي يمكن الحصول عليها من ماوس واحدة. الأساليب التي يسمح بإجراء تحليل الوظيفية والهيكلية والميكانيكية مفصلة وظيفة الكبيبي، والتي يمكن تطبيقها على جميع نماذج الماوس من المرض الكبيبي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Metabolic Cages	Harvard Apparatus	52-6731
Tris buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	T5912-1L
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2058
Mouse Albumin ELISA Quantitation Set	Bethyl Laboratories	E90-134
TMB ELISA Substrate solution	ThermoFisher Scientific	34028
Sulphuric acid	Sigma-Aldrich	339741
SPECTRstar nano	BMG Labtech	SPECTRstar nano or equivalent
RNAlater stabilisation solution	ThermoFisher Scientific	AM7020
4-15% precast protein gel	BIORAD	4568084
4x Laaemmli Sample buffer	BIORAD	161-0747
Mini Trans-Blot cell	BIORAD	1703930
10x Tris running buffer	BIORAD	1610732
Coomassie Brilliant Blue Dye	ThermoFisher Scientific	20278
Creatinine Companion	Exocell	1012 Strip Plate
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G5882
Sodium Cacodylate	Sigma-Aldrich	C0250
10x Phosphate Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	AM9625
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium Phosphate	Sigma-Aldrich	342483
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C5670
D(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
EDTA Blood Collection tubes	BD	367835
23-25G Needle	BD	PMC0735
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
10 ml Glass Vial	Thomas Scientific	0914X10
Falcon 10 ml Polypropylene Tubes	ThermoFisher Scientific	10110101
0.5 ml Tubes	ThermoFisher Scientific	10681894
Disposable Tissue Molds	ThermoFisher Scientific	22-363-553
Mouse Surgical Disection Kit	ThermoFisher Scientific	13-005-204
Optimal Cutting Medium	ThermoFisher Scientific	23-730-571
4% Paraformaldehyde	ThermoFisher Scientific	AAJ19943K2
Glass Capillary Tubes	Harvard Apparatus	EC1 64-0770
Glomerular Permeability Rig	Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available	Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol
Stainless Steel Sieves	Cole-Parmer	WZ-59984
Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System	Sigma-Aldrich	395B-1KT
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136
Xylene	MerckMillipore	108298
Poly-Prep Slides	Sigma-Aldrich	P0425-72EA
Mounting Medium	ThermoFisher Scientific	8030
Osmium tetroxide solution	Sigma-Aldrich	75632
Aradite Resin	Agar Scientific	CY212
Uranyl Acetate	Agar Scientific	AGR1260A
Lead Citrate	Agar Scientific	AGR1210
Cryostat	ThermoFisher Scientific	e.g. 957000H
Hydrophobic Pen	Abcam	ab2601
Nephrin (1243-1256) Antibody	Acris	BP5030
Anti-Podocin	Sigma-Aldrich	P0372-200UL
Anti-CD31	BD Biosciences	550274
Alexa Fluor Secondary Antibody	ThermoFisher Scientific	A32732
Vectashield Mounting Medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
NP40 Cell Lysis Buffer	ThermoFisher Scientific	FNN0021
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	ThermoFisher Scientific	78437X4
10x Transfer Buffer	BIORAD	1610734
PVDF Membrane	ThermoFisher Scientific	LC2002
HRP-Conjugated Secondary Antibodies	Abcam	ab6721
ECF Substrate for Western Blotting	Fisher	10713387
TRIzol	ThermoFisher Scientific	15596018
Dnase I	New England Biolabs	M0303S
M-MLV Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M053S
Oligo dT	ThermoFisher Scientific	18418012
Random Primers	ThermoFisher Scientific	48190011
dNTP	ThermoFisher Scientific	18427088
Ribonuclease Inhibitor	ThermoFisher Scientific	10777019
DEPC Water	ThermoFisher Scientific	AM9915G
Fluorescent Light Miscroscope	Leica Microsystems
Image J Analysis Software	Image J
PCR Thermocycler	ThermoFisher Scientific
TEM Microscope	Britannica