Beurteilung der Nierenfunktion in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine vollständige Niere Aufarbeitung, die in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung durchgeführt werden soll. Die Methoden können für funktionelle, strukturelle und mechanistische Detailanalyse der glomerulären Funktion, die auf alle Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung angewendet werden kann.

Zusammenfassung

Die Verwendung von murinen Modellen um menschliche Nierenerkrankung zu imitieren ist immer häufiger. Unsere Forschung konzentriert sich auf die Beurteilung der glomerulären Funktion bei diabetischer Nephropathie und hemolytic-spezifische VEGF-A Knock-out-Mäusen; Dieses Protokoll beschreibt daher die vollständige Niere Aufarbeitung in unserem Labor verwendet werden, um diese Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung, ermöglichen eine große Menge an Informationen über Niere und glomerulären Funktion aus einem einzigen Mausklick zu bewerten. Im Vergleich zu alternativen Methoden in der Literatur zur Beurteilung der glomerulären Funktion vorgestellt ermöglicht die Nutzung der in diesem Artikel beschriebene Methode den glomerulären Phänotyp vollständig unter mehreren Gesichtspunkten ausgewertet werden. Mithilfe dieser Methode kann der Forscher den Niere Phänotyp des Modells ermitteln und bewerten den Mechanismus, warum der Phänotyp entwickelt. Diese wichtigen Informationen über den Mechanismus der Krankheit ist erforderlich, wenn mögliche therapeutische Wege in diesen Modellen untersucht. Die Methoden können detaillierte funktionale Bewertung der glomerulären Filtration Barriere durch Messung der Harn Albumin-Kreatinin-Verhältnis und individuelle glomerulären Wasserdurchlässigkeit sowie Struktur- und Ultra-strukturelle Prüfung mit Hilfe der Perjodsäure Schiff Fleck und Elektronenmikroskopie. Darüber hinaus ermöglicht die Analyse von Genen Dysregulated Ebene der mRNA und Protein mechanistischen Analyse der glomerulären Funktion. Dieses Protokoll beschreibt die generische aber anpassungsfähigeren Methoden, die alle Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung angewendet werden können.

Einleitung

Die Verwendung von murinen Modellen um menschliche Nierenerkrankung zu imitieren ist immer häufiger. Solchen murinen Modellen gehören spontane Modelle wie spontan Hypertensive Ratten (SHR)¹, Streptozocin (STZ)-induzierte diabetischen Ratten und Mäuse²und die Db/Db Typ II diabetischen Mäusen³, gentechnisch hergestellten Modelle wie primäre hemolytic-spezifische fokal segmentale glomeruläre Sklerose (FSGS) Modelle⁴, den hemolytic-spezifische vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF-A) Knock Out (VEGF-A KO) Modell⁵, und Alport-Syndrom⁶Modelle und erworben Modelle wie die 5/6 Nephrektomie⁷ und die einseitige Harnleiter Obstruktion (UUO) Modell⁸. Bei der Beurteilung der verschiedenen Aspekte der glomerulären Funktion in diesen Modellen stehen verschiedene Techniken zur Verfügung. Diese Methode Papier soll eine umfassende Aufarbeitung zu demonstrieren, die in Mausmodellen der Nierenerkrankung durchgeführt werden sollte, um der glomerulären Funktion umfassend zu bewerten.

Die Gründe für die Verwendung dieser Methode ist, dass es den glomerulären Phänotyp vollständig unter mehreren Gesichtspunkten ausgewertet werden kann. Dabei bewerten die glomeruläre Permeabilität, Protein und Wasser, die glomeruläre strukturelle Anomalien und Änderungen in den Ausdruck/Spleißen von mRNAs und Proteinen für normale glomerulären Funktion wesentlich. Mithilfe dieser Methode kann der Forscher den Niere Phänotyp des Modells ermittelt und bewertet den Mechanismus, warum der Phänotyp entwickelt. Dies ist wichtige Informationen über den Mechanismus der Krankheit, die erforderlich ist, wenn mögliche therapeutische Wege in diesen Modellen untersucht.

In der Literatur ist es ein gemeinsames Auftreten mit einem Maus-Modell der glomerulären Erkrankung vorgestellt werden wobei der Phänotyp durch ein erhöhtes Maß an Albumin im Urin bestimmt wird. Allerdings gibt es Hinweise darauf, dass eine einzelne Methode zur Bestimmung der glomerulären Funktion nicht immer wirksam ist; Messung der Harn Albumin-Ausscheidung Rate oder der Harn Albumin-Kreatinin-Verhältnis (uACR) informiert nur auf die gesamte Nierenfunktion, und nicht der einzelne Glomeruli. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Durchlässigkeit in verschiedenen Glomeruli aus den gleichen Niere^5,9,10variieren kann. Darüber hinaus beurteilt die Durchlässigkeit der einzelnen Glomeruli ein empfindlicher Weise zur Beurteilung der glomerulären Funktion; die Technik zur Messung der individuellen glomerulären Wasserdurchlässigkeit (L_pA / V_ich) hat gezeigt, dass empfindlicher auf Veränderungen in der glomerulären Funktion werden als bei der Messung der uACR⁹. Dieser Assay ist vorteilhaft in Mausmodellen, Proteinurie, wie Sie auf einem Hintergrund c57BL/6¹¹resistent sind. Der Vorteil des vorliegenden Papiers Methode ist, dass es sowohl die total renal Durchlässigkeit an Albumin als auch die einzelnen glomeruläre Permeabilität für Wasser untersucht.

Prüfung der glomerulären strukturelle Anomalien wird oft durch eine Batterie von Flecken wie Perjodsäure Schiff (PAS), trichrome, und Silber Flecken beurteilt. Diese ermöglichen eine ausgebildete renal Pathologe, das Niveau der Nierenerkrankung über ein scoring-Methode zu bewerten. Obwohl alle gute Methoden, Veränderungen der glomerulären Makro-Struktur in nicht immer eingehalten werden Modelle akuten Nierenversagens Verletzungen¹². Diese Methode schlägt vor, dass neben der Durchführung der oben beschriebenen renal Histologie-Techniken, die glomeruläre Ultra-Struktur auch über Elektronenmikroskopie (EM) zu beurteilen. Gefärbten Glomerulus kann unter einem normalen Lichtmikroskop relativ normal aussehen; jedoch wird bei der Bewertung mit EM, kleine Änderungen in der glomerulären Basalmembran (GBM) Breite hemolytic Fuß Prozess Auslöschung, endotheliale Fenestrationen und die Sub-hemolytic Raum Berichterstattung analysiert. Daher ist es wichtig, dass die glomeruläre Ultra-Struktur und die Mikro-Struktur wird bewertet, um den Mechanismus der glomerulären Dysfunktion zu bestimmen.

Neben der Beurteilung der glomerulären struktureller Anomalien, sollten Änderungen in mRNA und Protein-Expression und Spleißen, sowie Protein-Aktivierung (z.B. Phosphorylierung), untersucht werden, um die Mechanismen der glomerulären Erkrankungen weiter aufzuklären. Bei der Betrachtung der glomerulären Erkrankung oder z. B. beim KO/over-expressing ein Gen gezielt in glomerulären Zellen, z. B. in der hemolytic-spezifische VEGF-A KO Maus⁵, es wichtig ist, dass die Protein- und mRNA-Änderungen nur innen geprüft werden die glomeruläre Zellen, und nicht die ganze Niere. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die Glomeruli sind isoliert von der Maus Niere Kortex, und dann die Protein/RNA isoliert sind. Dadurch können spezifische Analyse von Protein/mRNA Dysregulation in der Glomeruli das Krankheitsmodell.

Dieses Protokoll beschreibt eine vollständige Niere Aufarbeitung, die in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung, ermöglichen eine große Menge an Informationen über Niere und glomerulären Funktion aus einem einzigen Mausklick durchgeführt werden soll. Die Methoden können für funktionelle, strukturelle und mechanistische Detailanalyse der glomerulären Funktion, die auf alle Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung angewendet werden kann.

Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Gesetzgebung des Vereinigten Königreichs und lokale Ethikkommission Genehmigung durchgeführt. Tierexperimentellen Studien wurden von der Universität von Bristol Research Ethics Committee genehmigt.

(1) Harn Albumin-Kreatinin-Verhältnis (uACR)

Hinweis: Die uACR wird verwendet, um die Durchlässigkeit der GFB an Albumin zu beurteilen. Das Vorhandensein von Albumin im Urin weist erhöhten Durchlässigkeit in der GFB, die auf Kreatinin zu steuern für Variationen im Urin Durchflussmenge normalisiert ist. Albuminurie ist eine gemeinsame Marke für chronische Nierenerkrankungen.

1. Sammeln Sie Urin auf der experimentellen Grundlinie und in regelmäßigen Abständen (einmal wöchentlich, einmal monatlich) bis zu den experimentellen Endpunkt.
2. Richten Sie Maus metabolische Käfige mit Wasser und Bereicherung Ernährung. Mäuse (männlich, im Alter von 6-8 Wochen) in einzelne Käfige für 6 h in einem ruhigen Raum zu platzieren.
3. Rückkehr Mäuse, um regelmäßige Gehäuse und sammeln Urin aus den leeren Käfigen. Ein Minimum von 50 µL ist erforderlich.
   Hinweis: Wenn die Maus in der vorgegebenen Zeit nicht Urin produzieren, an einem anderen Tag in einem wärmeren Raum wiederholen.
4. Zentrifugieren der Urin bei 500 X g für 10 min. sammeln die Urin und behalten Sediment um hemolytic Verlust zu beurteilen. Speichern Sie den Urin bei-20 ° C kurzfristig an dieser Stelle.
5. Verdünnen Sie den Urin in 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in 1 X Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS pH 7,5) bei einer 1: 500, Verdünnung 1: 10000, je nach Schweregrad der Albuminurie.
   Hinweis: Das Ende-Laufwerk sollte > 400 µL optimieren, um festzustellen, die richtige Verdünnung zu jeder Zeit zeigen.
6. Der Harn albumingehalt mithilfe eines Maus Albumin Enzym verknüpften Immunosorbentprobe Assays (ELISA) gemäß den Herstellerangaben zu quantifizieren.
   1. Kurz Mantel der ELISA-Platte, die für die Proteinbindung mit 100 µL Anti-Maus-Albumin Primärantikörper (10 µg/mL 0,5 M Karbonat-Bicarbonat pH 9,6) für 1 h bei Raumtemperatur optimiert ist.
   2. Wash überschüssige Antikörper aus dem Brunnen fünfmal mit 1 X TBS plus 0,05 % Tween (pH 8,0), und fügen Sie 200 µL Lösung (1 X TBS mit 1 % BSA pH 8.0) über Nacht bei Raumtemperatur zu blockieren.
7. Waschen Platte fünfmal und 100 µL der Standards (serielle Verdünnung: 2000 µg/mL 15,63 µg/ml in 1 X TBS mit 1 % BSA, pH 8,0), die leer sind und die verdünnten Proben in dreifacher Ausfertigung. Lassen Sie für 1 h bei Raumtemperatur, dann waschen Sie Platte fünfmal.
   1. Fügen Sie 100 µL HRP detektionsantikörper in jede Vertiefung (10 ng/mL im 1xTBS mit 1 % BSA, pH 8,0 hinzu) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 h.
   2. Waschen der Plattenrandes fünfmal und 100 µL der Enzym-Substrat-Lösung in jede Vertiefung. Lassen Sie die Platte in der Dunkelheit zu entwickeln für 15 min und stoppen die Reaktion durch Zugabe von 100 µL von 0,18 M Schwefelsäure (H₂SO₄).
      Achtung: H₂SO₄ ätzend ist.
8. Bestimmen der albumingehalt jeder Probe durch die Lektüre der Platte an eine Extinktion von 450 nm. Verwenden der Standardkurve, um in jeder Probe Albumin zu quantifizieren. Haben wiederholt der technischen einen CV-Wert größer als 5 %, wiederholen Sie den Test für die Proben.
9. Alternativ, bewerten Sie die Harn Albumin-Konzentration mit Elektrophorese. 15 µL Urin 5 µL 4 x Probenpuffer laden Eiweiß hinzufügen. Erwärmen Sie Proben zu 95 ° C für 10 min. und laden Sie zu einem 4-12 % Tris Fertigteile Gel.
   1. Führen Sie das Gel bei 100 V und Fleck über Nacht in Coomassie blau pro des Herstellers Protokoll.
   2. Verwenden Sie nachdem das Gel imaging Densitometrie um Falte Änderung albumingehalt relativ zum Steuerelement zu beurteilen.
      Hinweis: Wenn keine Bands für Albumin als erwartet beobachtet werden, bewerten die Proteinkonzentration des Urins und die Lautstärke des Urins hinzugefügt, um das Gel.
10. Verdünnen Sie die rohen Urinprobe in dH₂O am 01:10, 1:1 und 1:5.
    Hinweis: Das Ende-Laufwerk sollte > 70 µL. optimieren, um die richtige Verdünnung jeder Probe zu bestimmen.
11. Der Harn Kreatininkonzentration mit einer chemischen Assay pro Kit Anweisungen zu quantifizieren. Kurz, laden Sie 20 µL Kreatinin Normen, leer oder verdünnter Urin zu einer 96-well-Platte in dreifacher Ausfertigung.
12. Die Kreatininkonzentration von jeder Probe zu bestimmen, durch das Lesen der Platte an eine Extinktion von 490 nm vor und nach der Zugabe der sauren Lösung (Vorsicht, ätzend; Hautkontakt vermeiden).
    Hinweis: Der Unterschied zwischen den Werten der Absorption ist direkt proportional zu der Kreatininkonzentration in jeder Probe. Eine Standardkurve ist Generation von Standards. Haben wiederholt der technischen einen CV-Wert größer als 5 %, wiederholen Sie den Test für die Proben.
13. Die uACR (µg/mg) zu generieren. Die Daten auf den Ausgangswert von jeder Maus für grafische Darstellung zu normalisieren.

(2) Gewebe und Blutentnahme

Hinweis: Die Niere und glomerulären Gewebe lässt sich beurteilen, Struktur-, Protein- und mRNA Ausdruck Marker für Nierenerkrankungen. Das Blut kann verwendet werden, um Marker der Nierenfunktion, wie z.B. Kreatinin, beurteilen die in Nierenerkrankungen, zeigt einen Rückgang der Filterkapazität der Glomeruli bis geregelt werden können.

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen: frische 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natrium Cacodylate (pH 7,3), 4 % Paraformaldehyd in 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), Säugetier-Ringer-Lösung (115 mM Natriumchlorid (NaCl), 10 mM Natriumacetat (CH₃COONa) 1,2 mM Natriumphosphat (Na₂HPO₄), 25 MM Natriumbicarbonat (Nahco3₃), 1,2 mM Magnesium-Sulfat (MgSO₄), 1 mM-Kalzium-Chlorid (CaCl₂), 5,5 mM D (+) Glucose, pH 7.4) mit 1 % BSA und 1 X PBS.
   Achtung: 2,5 % Glutaraldehyd: giftig, sensibilisierend, reizend; Verwenden Sie in einem Schrank Rauch. 0,1 M Natrium Cacodylate: giftig, Einsatz in einem Rauch-Schrank. 4 % PFA: Fixiermittel, Einsatz in Rauch Schrank
2. Bereiten Sie die folgenden Materialien: Isofluran, kleine Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA)-beschichtete Röhrchen Blut, 23-25G-Nadeln, 5 mL EDTA beschichtet Spritzen, 10 mL Glasfläschchen, Kunststoff 10 mL Fläschchen, 0,5 mL-Kunststoff-Rohre, Einweg-Gewebe Formen, Trockeneis, Flüssigkeit N ₂, chirurgische mauswerkzeuge und optimale schneidmedium (OCT).
3. Platzieren Sie den Mauszeiger in tiefen Narkose, die von der Maus nicht mehr reagiert, eine Nadel stechen um die Fußauflage mit einer Isofluran-Kammer oder gleichwertigen Routen der terminal Anästhesie wie injizierbare Anästhetika (Pentobarbital, 50 mg/kg wird überprüft intraperitoneal [IP]; Avertin, 240 mg/kg IP) oder Kohlendioxid (CO₂) Exposition (75 % CO₂25 % O₂).
4. Keulen Sie Maus über Herzpunktion in den linken Ventrikel zu und sammeln Sie so viel Blut wie möglich. Übertragen Sie auf das Rohr beschichtet, EDTA Blut für bis zu 4 h. Falls gewünscht, können Mäuse durch zervikale Dislokation mit Sorgfalt nicht an der Halsschlagader platzen gekeult werden.
5. Sezieren Sie, die Nieren durch den Bauch und Waschen mit Eis kalt 1 X PBS-Puffer.
6. Prüfung der kortikalen Glomeruli, einen Pol der Niere Kortex zu entfernen und in 1 mm³ Stücke schneiden. Um die tief Juxta medulläre Glomeruli zu untersuchen, wiederholen Sie die gleiche Technik mit Gewebe aus der Medulla. Legen Sie in 5 mL 2,5 % Glutaraldehyd Lösung in ein Glas EM Fläschchen. Shop bei 4 ° C.
   Achtung: 2,5 % Glutaraldehyd Lösung: giftig, sensibilisierend, reizend; Verwenden Sie in einem Schrank Rauch
   Hinweis: Prozess innerhalb von 1 Monat für die besten Ergebnisse.
7. Für Histologie, entfernen Sie das obere Drittel einer Niere, um sicherzustellen, kortikale und Juxta medulläre Glomeruli werden anwesend sein, und Fix in 5 mL 4 % Paraformaldehyd bei 4 ° C für 24 h Transfer bis 5 mL 70 % EtOH 24 Stunden vor dem Einbetten in Paraffin.
   Achtung: 4 % PFA: Fixiermittel, Einsatz in Rauch Schrank
8. Platz für Immunfluoreszenz, ein Drittel der Niere, um sicherzustellen, kortikale und medulläre Glomeruli werden anwesend sein, in das Gewebe Schimmel und Mantel im Oktober auf Trockeneis, Einfrieren und lagern bei-80 ° C.
9. Für Proteine und RNA Einfrieren Platz 3 x 2 mm³ Stücke der Niere Kortex in 0,5 mL-Kunststoff-Rohre und Snap in Flüssigkeit N₂. Shop bei-80 ° C. Für die Langzeitlagerung Gewebe für RNA Gewebe in 5 Bänden der RNA-Stabilisierung-Lösung und bei-80 ° c Lagern
10. Zur Isolierung der Glomeruli die restlichen nierengewebe zerschneiden und in 5 mL Säugetier-Ringer-Lösung mit 1 % BSA auf Eis legen. Bereiten Sie die Glomeruli sofort durch ein Sieb.

3. Plasma Kreatinin

Hinweis: Plasma Kreatinin kann bis in Nierenerkrankungen, zeigt einen Rückgang der Filterkapazität der Glomeruli geregelt werden. Die Blutspiegel für Harnstoff-Stickstoff (BUN) können auch beurteilt werden, obwohl das Protokoll hier nicht beschrieben ist.

1. Zentrifugieren der Blutprobe bei 500 X g für 15 min bei 4 ° C.
2. Sammeln Sie das Plasma, das bei-20 ° C kurzfristig an dieser Stelle gespeichert werden kann.
3. Die Plasmakonzentration Kreatinin mit einem chemischen Kreatinin-Assay gemäß der Anleitung oben für Harn Kreatinin im Protokoll 1.11 zu quantifizieren.
4. Die Kreatininkonzentration von jeder Probe zu bestimmen, durch das Lesen der Platte an eine Extinktion von 490 nm vor und nach der Zugabe der sauren Lösung.
   Hinweis: Der Unterschied zwischen diesen Werten Absorption ist direkt proportional zu der Kreatininkonzentration in jeder Probe. Eine Standardkurve ist Generation von Standards. Haben wiederholt der technischen einen CV-Wert größer als 5 %, wiederholen Sie den Test für die Proben.

4. Isolierung der Glomeruli

Hinweis: Glomeruli können isoliert werden, um die Durchlässigkeit der einzelnen Glomeruli ex Vivo, sowie der Ausdruck von spezifischen Proteins und mRNA-Marker der glomerulären Erkrankung zu bewerten.

1. Nehmen Sie das nierengewebe in Säugetieren Ringer-Lösung mit 1 % BSA platziert und sezieren Sie die Glomeruli mit einem Standard-Siebung Technik¹³. Kurz, stapeln Sie 70 µm (unten), 100 µm, 125 µm, 175 µm, 250 µm und 425 µm (oben) Siebe auf ein Becherglas.
2. Zerdrücken der Niere, mit einem Spritzenkolben in 425 µm Sieb und mit Eis kalt Säugetier-Ringer Lösung mit 1 % BSA durchzusetzen. Da die Bits der Niere durchgesetzt werden, anschließend das obere Sieb und dasselbe am nächsten. Wiederholen, bis nur die 100 µm und 70 µm Siebe bleiben.
3. Übertragen die glomeruläre Ernte behielt die 100 µm bis 70 µm Siebe auf 10 mL frisches Säugetier-Ringer-Lösung mit 1 % BSA auf Eis.
   Hinweis: Ist die Anzahl der Glomeruli pro mL Ringer-Lösung einigen, reduzieren Sie die Lautstärke des Ringer Lösung verwendet, um die Glomeruli aus den letzten beiden Siebe zu sammeln.
4. 5 mL der Lösung mit Glomeruli in zwei getrennten Röhren (2,5 mL) und Zentrifuge bei 1.000 x g für 10 min bei 4 ° c zu entfernen Entfernen des Überstands und Snap Einfrieren der Glomeruli in Flüssigkeit N₂ vor der Lagerung bei-80 ° C für Proteine und RNA-Extraktion zu einem späteren Zeitpunkt.
5. Legen Sie die restliche Lösung mit Glomeruli in einem Wasserbad bei 37 ° C für die Messung der glomerulären L_pA / V_ichex Vivo. Füllen Sie innerhalb von 3 h die Niere zu entfernen.

(5) glomeruläre Wasserdurchlässigkeit (L_pA / V_ich)

Hinweis: Die glomeruläre L_pA / V_ich Test ermöglicht es, die ex Vivo Messung der Durchlässigkeit der einzelnen Glomeruli in einem schnellen reproduzierbar. Eine Erhöhung der glomerulären L_pA / V_ich zeigt Störung der GFB ist suggestiv von Nierenerkrankungen.

1. Richten Sie die glomeruläre L_pA / V_ich rig wie Lachs Et Al¹⁰beschrieben. Eine detaillierte Darstellung der Einrichtung finden Sie in Abbildung 1 .
2. Bereiten Sie die folgenden Lösungen: Säugetier-Ringer-Lösung mit 1 % BSA (pH 7,4) und Säugetieren Ringer-Lösung mit 8 % BSA (pH 7,4). Beide auf 37 ° c warm
3. Ziehen Sie Mikropipetten aus Glas-Kapillarröhrchen (optische Dichte: 1,2 mm). Generieren Sie ein 5-8 µm Blende Tipp durch Schneiden der Mikropipette unter dem Mikroskop.
4. Verwenden Sie die glomeruläre L_pA / V_ich rig intakt einzelne Glomeruli zu fangen, die frei von Bowman's Kapsel und röhrenförmigen Fragmente auf die Mikropipette mit Absaugung. Ein detaillierter Überblick über die Oncometric-Assay ist in Lachs Et Al¹⁰gefunden. Kurz gesagt, sobald ein Glomerulus abgefangen und sich am Sauger Mikropipette sicherte, beginnen Sie die Videoaufnahme des Glomerulus unter dem Mikroskop.
5. Erstens equilibrate der Glomerulus in der 1 % BSA Ringer-Lösung für 30 s vor der Umstellung der Perifusate auf die konzentrierte 8 % BSA Ringer Lösung für 10 s. Dann die Perifusate wieder auf 1 % BSA Ringer-Lösung und beenden Sie die Aufzeichnung.
6. Waschen Sie der Glomerulus Weg, und wiederholen Sie den Vorgang für 10-15 Glomeruli per Mausklick. Sicherzustellen, dass die Perifusate Durchflussmengen sind identisch und nicht zu schnell (10 mL/min), um nicht die glomeruläre Struktur zu verzerren.
7. Messen Sie die erste Rate der glomerulären Schrumpfung der glomerulären Wasserdurchlässigkeit (L_pA) normiert auf die glomeruläre Volumen (V_ich) zu berechnen. In Salmon Et Al¹⁰finden Sie detaillierte Informationen über die Analyse.

6. Perjodsäure Schiff (PAS) Fleck

Hinweis: Der PAS Fleck markiert den Keller Membranen der glomerulären Kapillaren Schleifen und das röhrenförmige Epithel. Es ermöglicht die detaillierte Visualisierung der glomerulären Zellen, Erweiterung der mesangialen Matrix und Potenzial und mögliche Veränderungen der GBM (d.h., Verdickung und Unregelmäßigkeiten).

1. Abschnitt 5 µm Dicke auf Poly-L-Lysin beschichtete Folien ein Mikrotom mit Paraffin-eingebetteten, PFA-behoben: Niere Kortex. Trocken bei 37 ° C für 1 h Vergewissern Sie sich im Abschnitt enthält keine keine Falten oder Löcher, die die Morphologie unter dem Mikroskop verzerren können.
2. Deparaffinize Folien durch Inkubation zweimal in Xylol (Vorsicht, reizend; Einsatz in Rauch Schrank) für 3 min, zweimal in 100 % EtOH 3 min und dann einmal in 95 %, 70 % und 50 % EtOH 3 min jeweils alle bei Raumtemperatur. Re-Hydrat Folien in dH₂O.
3. Inkubieren Sie die Folien in Perjodsäure Lösung (Vorsicht, reizend; Einsatz in Rauch Schrank) (1 g/dL) für 5 min und dann spülen verwenden Sie die Folien in mehreren Änderungen von dH₂O. einen Behälter mit 100 mL dH₂O bei Raumtemperatur.
   Achtung: Perjodsäure Lösung: reizend; Verwenden Sie im Rauch Schrank
4. Inkubieren Sie Folien in Schiff's Reagenz (Parasoaniline HCl 6 g/L und Natrium Metabisulfite 4 % HCl 0,25 Mol/L) für 15 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie Objektträger in fließendem Leitungswasser für 5 min.
5. Gegenfärbung mit Hämatoxylin für 3 s vor dem Rutschen in fließendem Leitungswasser für 15 min gründlich spülen.
   Hinweis: Einige Optimierungen müssen die optimale Zeit für Färbung Hämatoxylin bestimmen.
6. Folien mit der Rückseite des Protokolls 4.Wenn in Schritt 6.2 zu entwässern. Finish mit Xylol.
7. Luft trocken Folien und Mount mit Xylol-basierte Montage Medien.
8. Bild auf einem Lichtmikroskop bei 400 X Vergrößerung glomeruläre Strukturen zu beurteilen. Folgendes zu bewerten: Verdickung und Unregelmäßigkeiten der GBM, einstürzenden Kapillare Schlingen, fibrotische Gewebe, Sklerose, Zellproliferation (Endothelzellen, hemolytic und mesangialen oder Entzündungszellen infiltriert die Büschel).
   Hinweis: Für eine umfassende Bewertung der glomerulären Pathophysiologie Läsionen an anderer Stelle in der Niere sollte bewertet, wie z. B. die Tubuli.

7. die Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM)

Hinweis: TEM ermöglicht die Auseinandersetzung mit der Ultra-strukturelle Anomalien in der Niere, z. B. die GBM hemolytic Fuß Prozesse und endotheliale Fenestrationen, die nicht mit Lichtmikroskopie sichtbar sind. Dies ist wichtig bei Modellen wo Nierenschädigung nicht so (d. h., keine Albuminurie und strukturellen Fehlbildungen) ausgeprägt ist.

1. Nehmen Sie die 2,5 % Gluteraldehdye - feste gewürfelte Niere und Post-fix in 1 % Osmium ausgefällt für 1 h Waschen in 50 mL 0,1 M Cacodylate-Puffer (pH 7,3) und dann 50 mL dH₂O (3 x 15 min Änderungen).
   Achtung: 2,5 % Glutaraldehyd: giftig, sensibilisierend, reizend; Verwenden Sie in einem Schrank Rauch. 0,1 M Natrium Cacodylate: giftig, Einsatz in einem Rauch-Schrank
2. Mit EtOH entwässern und in Harz Araldite einbetten.
3. Abschnitten bei 50-100 nm Dicke schneiden und Färben mit 3 % (wässrigen) Uranyl Acetat und Reynolds' Lead Citrat-Lösung.
4. Mehrere Bereiche des Glomerulus bei 940 X digitale mikrographen übernehmen, 1250 X und 6200 X um sicher zu sein Podocytes, GEnCs, GBM und Mesangium können identifiziert werden.
5. Verwenden Sie ImageJ verblindeten Glomeruli zu analysieren. Legen Sie den Maßstab für jede 6200 X Schliffbild durch Ziehen einer Linie zwischen zwei Punkten des bekannten Abstand, z. B. ein Lineal. Gehen Sie um zu analysieren, und dann Maßstab, wo wird die Länge der Linie in Pixel angezeigt werden. Geben Sie in der bekannten Abstand und Maßeinheiten. Verwenden Sie die Protokolle für die Messung der einzelnen Parameter aufgeführt.
   Hinweis: Diese Analyse erfordert ca. 1 Tag pro Maus. Verwenden Sie für angemessene statistische Aussagekraft die durchschnittlichen Messwerte aus 3 Glomeruli aus 3 Mäuse.
   1. Legen Sie für GBM einen festen digitale Raster (10 x 10) über 6200 X Schliffbild und Messen Sie die Dicke der GBM an der Stelle, wo die Gitterlinien der GBM kreuzen. Messen Sie von der Basalmembran der endothelialen Zellen an der Zellmembran von basalen hemolytic Fuß Prozess in eine senkrechte Tangente an der endothelialen Zellmembran mit geraden Linien-Werkzeug. Bestimmen Sie das mittlere Maß für jede Glomerulus aus 10 Einzelmessungen.
   2. Messen Sie für die Anzahl der Endothelzellen Fenestration die Länge der GBM in 6200 X mikrograph vorhanden und die Anzahl der Endothelzellen Fenestrationen pro Längeneinheit der GBM. Nehmen Sie einen Durchschnitt von mindestens 4 mikrographen pro Glomerulus.
   3. Für die hemolytic Fuß breite Prozess, legen Sie einen festen digitale Raster (10 x 10) über 6200 X Schliffbild. Messen Sie die Breite der hemolytic Fuß Prozesse, die die Rasterlinien kreuzen. Messen Sie die Breite an der breitesten Stelle des Fußes Prozesses es die GBM trifft; sicherstellen Sie, dass die Linie senkrecht zu der Tangente von der Basalmembran hemolytic ist. Bestimmen Sie das mittlere Maß für jede Glomerulus aus 10 Einzelmessungen.
   4. Hemolytic Schnittbreite legen Sie in einem festen digitale Raster (10 x 10) über 6200 X Schliffbild. Messen Sie die Breite der hemolytic Schlitz Membranen, die die Rasterlinien kreuzen. Dies ist der Punkt, wo der Fuß Prozesse zusammen, an der breitesten Stelle jedes Prozesses Fuß aus hemolytic Membran zu Membran am nächsten sind. Sicherstellen Sie, dass die Messung senkrecht zu der Tangente von der Basalmembran hemolytic ist. Bestimmen Sie das mittlere Maß für jede Glomerulus aus 10 Einzelmessungen.
   5. Für die Anzahl der hemolytic Fuß Prozesse, Messen Sie die Länge der GBM in 6200 X mikrograph vorhanden und die Anzahl der hemolytic Fuß Prozesse pro Längeneinheit der GBM. Nehmen Sie einen Durchschnitt von mindestens 4 mikrographen pro Glomerulus.
   6. Für die Sub-hemolytic Raum Abdeckung siehe detaillierte Methode in Neal Et Al. ¹⁴.
6. Anhand der 940 X mikrographen, untersuchen Sie Glomeruli auf das Vorhandensein von abnormen Struktur, Einlagen und Infiltrate vom Auge.

8. die Immunfluoreszenz für Hemolytic und endotheliale Marker

Hinweis: Immunostaining erlaubt Visualisierung der Ausdruck Proteinmuster wie endotheliale Kapillare Schlaufen, welche in glomerulären Erkrankung zusammenbrechen können.

1. Legen Sie die OCT-Form mit gefrorenen Niere bei-20 ° C für 2 h vor dem Schneiden. Stellen Sie sicher, daß die Schnittfläche der Niere sorgfältig gegen den Boden der OCT-Form gut ausgerichteten Gewebeschnitte ermöglichen.
2. Mit einem Kryostaten, beschichtet Abschnitt Gewebe bei einer 5 µm Dicke auf Poly-L-Lysin Folien.
   Hinweis: Stellen Sie sicher, es gibt keine Falten oder Löcher in die Gewebe, die die Morphologie verfälschen können.
3. Bei der Entnahme aus der Kryostat, fix Folien PFA für 10 min. Wash Folien in 4 % 3 x 5 min in einem Behälter mit 100 mL dH₂O.
   Achtung: 4 % PFA: Fixiermittel, Einsatz in Rauch Schrank
4. Zeichnen Sie zur Minimierung des Antikörpers verwendet, um Abschnitte mit einem hydrophoben Stift. Lassen Sie sich nicht in den Abschnitten zu trocknen.
5. In blocking-Lösung (3 % BSA und 5 % normalem Serum mit 1 X PBS-Puffer) für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Entfernen Sie die blockierende Lösung mit einer Absauganlage und inkubieren Sie Abschnitte mit Primärantikörper (Nephrin, Podocin oder PECAM-1) verdünnt 1: 250 (3 % BSA mit 1 X PBS-Puffer). Legen Sie Folien in eine Feuchte Kammer bei 4 ° C über Nacht. Wenn eine Feuchte Kammer nicht verfügbar ist, legen Sie einen schmaler Streifen Parafilm leicht über der Antikörper-beschichtete Folie. Vorsicht beim Entfernen von am nächsten Tages, den Abschnitt nicht zu stören.
7. Waschen Sie Objektträger 3 x 5 min in 1 X PBS.
8. Mit entsprechenden fluoreszierende Sekundärantikörper Verdünnung 1: 1000 (3 % BSA mit 1 X PBS-Puffer) für 2 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
9. Waschen Sie Objektträger 3 x 5 min in 1 X PBS. Mit Leuchtstofflampen mit DAPI Montage montieren.
10. Bildfolien mit einem fluoreszierenden Mikroskop bei 400 X Vergrößerung der Glomeruli anzeigen. Sicherzustellen Sie, dass diese geblendet wird, um Verzerrungen zu vermeiden.
11. Verwendung ImageJ zu analysieren, die Färbung Intensität, normiert auf die glomeruläre Bereich und das Muster der Färbung, d. h., die Anzahl der Kapillare Schlingen normalisiert zum Bereich glomerulären in gewissem Sinne geblendet.

9. Proteingewinnung und Western Blotting

Hinweis: Western blotting ermöglicht uns, die Ausdruck-Proteine bekannt Dysregulated Nierenerkrankungen zu beurteilen. Zum Beispiel zeigt ein Rückgang der Podocin und Nephrin Ausdruck hemolytic Verlust.

1. Extrahieren Sie Protein aus Niere Kortex und gesiebten Glomeruli; das Protokoll ist für jeden gleich und die Lautstärke der Lyse Puffer ist für die Menge der Gewebe.
2. Tauen Sie Niere/Glomeruli auf dem Eis vor dem Hinzufügen von NP-40 Lyse Puffer (150 mM NaCl, 1 % NP-40, 50 mM Tris pH 8) enthaltenden Protease und Phosphatase-Inhibitoren. Homogenisieren die Probe für 30 s.
3. Inkubieren Sie die homogenisierten Proben für 30 min, Vortexen in regelmäßigen Abständen auf Eis.
4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 x g für 15 min bei 4 ° C.
5. Den überstand zu einem frischen Schlauch auf dem Eis zu entfernen.
   Hinweis: voraussichtlich ca. 1 mg Protein pro Probe zu erholen.
6. Denaturieren Sie die Proteine, die mit dem standard 4 X Laemmli-Puffer. Kochen Sie die Mischung bei 95-100 ° C für 5 min.
7. Bewerten der Ausdruck der glomerulären Zelle Marker-Proteine (Nephrin, Podocin, PECAM-1)und der Phosphorylierung und Expression von Proteinen bekannt/Hypothese in der Niere/Glomeruli der das Krankheitsmodell mit Western Blot () geändert werden Standard-Methode; Mahmood und Yang (¹⁵).
   Hinweis: Das Protokoll variiert je nach Größe und Fülle des Proteins des Interesses.

10. RNA-Extraktion und Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Hinweis: mRNA Ausdruck Analyse lässt sich bestimmen, wie Gene bei Nierenerkrankungen, wie Veränderungen in der Genexpression und alternatives Spleißen reguliert werden.

1. Während die Nieren Rinde noch gefroren ist, mahlen Sie gründlich in 3 mL Phenol-Reagenz mit einem Stößel und Mörser. Wenn glomerulären Extrakte zu verwenden, fügen Sie 1 mL der Phenol-Reagenz und homogenisieren die Probe für 30 s.
   Achtung: TRIzol Reagenz: reizend; Verwenden Sie im Rauch Schrank
2. Führen Sie eine RNA-Extraktion mit der Methode von Chomczynski und Sacchi¹⁶beschrieben.
   Hinweis: Kommerzielle RNA Extraktion Kits sind erhältlich als Alternative zu dieser Methode.
3. Beurteilen Sie die Quantität und Qualität der RNA unter Verwendung eines der verschiedenen Methoden zur Verfügung. RNA ist an dieser Stelle regelmäñig und bei-80 ° C gelagert. Vermeidung von Wiederholung Einfrieren, Auftauen.
   Hinweis: Wenn Sie neu in diese Methode, überprüfen Sie die Qualität der RNA bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren durch Ausführen der RNS auf ein Agarosegel um einen klaren 28 s und 18 s ribosomalen Band. Erwarten Sie zwischen 2 bis 5 µg RNA mit dieser Methode zu erholen.
4. DNase behandeln 1 µg RNA (machen Volumen bis zu 10 µL mit RNase-freies Wasser plus 1 µL DNase und 1 µL Puffer DNase) für 1 h bei 37 ° C. Die Reaktion mit 1 µL DNase-Stopp-Lösung bei 65 ° C für 10 min zu stoppen.
5. Fügen Sie 0,5 µL Oligo (dT) und zufällige Primer. Bei 70 ° C für 10 min inkubieren.
6. Sofort für 5 min auf Eis zu stillen.
7. Fügen Sie die folgenden; MMLV Reverse-Transkriptase-Enzym (400 U; ersetzen mit DEPC H₂O in der RT - Kontrollprobe), MMLV-Puffer (1 X), dNTP-Mix (0,5 mM) und Ribonuklease-Inhibitor (40 U); machen Sie bis zu 50 µL mit DEPC-Wasser.
8. Inkubieren Sie Reaktion Mischung bei 37 ° C für 1 h, gefolgt von 95 ° C für 5 min um das Enzym zu deaktivieren.
   Hinweis: Um eine höhere Ausbeute der cDNA zu generieren, Inkubation bei 37 ° C für bis zu 3 h.
9. Beurteilen Sie die Quantität und Qualität der cDNA mit den verschiedenen Methoden zur Verfügung.
10. Verwendung PCR zu beurteilen, die mRNA Ausdruck und Spleißen Muster der Gene Hypothese Dysregulated in der glomerulären Krankheitsmodell sein. Das Protokoll ist das Gen des Interesses abhängig.

Ergebnisse

Urin wurde gesammelt, mit metabolischen Käfige aus Wildtyp (WT), induzierbaren hemolytic-spezifische VEGF-A Knock-out (VEGF-A KO) und VEGF-A KO X Neph-VEGF₁₆₅b Mäuse (VEGF-A KO Mäusen, die die menschlichen VEGF-A₁₆₅b Isoform in der Podocytes in over Ausdrücken ein konstitutiven Weise). Bei der Messung der Harn Albumin Kreatinin Ratio 0, 4, 10 und 14 Wochen nach Doxycyclin Induktion der VEGF-A KO entwickelt VEGF-A KO Mäusen progressive Albuminurie von 10 Wochen im Vergleich zum WT stellt Steuerelemente. Die absoluten Werte sehen in Abbildung 2Aund normalisierte die Grundlinie jeder Maus-Werte in Abbildung 2 b. Albuminurie in beobachtet nicht in die VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b Mäuse (Abbildung 2), ist jedoch darauf hinweist, dass VEGF-A₁₆₅b schützende im Modell der Albuminurie⁵.

Die glomeruläre L_pAV_ich wurde in einzelne Glomeruli gesiebt von WT VEGF-A KO und VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b Nieren gemessen. Ein Beispiel dafür wie ein Glomerulus gefangen ist und die Schrumpfung beobachtet, wenn Perifused mit 8 % BSA in Abbildung 3Aangezeigt wird. Diese Schrumpfung dient dann zur Bestimmung der glomerulären L_pA / V_ich für jedes Glomerulus (Abb. 3 b). VEGF-A KO Mäuse hatten eine signifikant erhöhte glomeruläre L_pA / V_ich bei 14 Wochen post VEGF-KO Induktion im Vergleich zu WT Kontrolle Glomeruli. Obwohl niedriger in VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b Mäuse, die erhöhte glomeruläre L_pA / V_ich nicht durch Überexpression des VEGF-A₁₆₅b bei 14 Wochen⁵verhindert wurde.

PAS Färbung der Niere Kortex Abschnitte 14 Wochen nach Induktion der VEGF-A KO ergab glomerulären strukturelle Anomalien in der VEGF-A KO oder VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b Mäuse (Abb. 4A). Jedoch bei der Analyse der glomerulären Ultra-Struktur über EM VEGF-A KO Mäusen hatte entwickelt eine erhöhte GBM-Breite, verringerte Zahl der endothelialen Augenhöhlen SPS Abdeckung abgenommen und erhöhte durchschnittliche hemolytic Schnittbreite (Abbildung 4-4F ). Die durchschnittliche hemolytic Fuß verarbeiten Breite und Anzahl der Schlitze blieb unverändert (Abb. 3 b und 3 G). Überexpression des VEGF-A₁₆₅b in den VEGF-A KO-Mäusen verhinderte die Änderungen an der GBM und Schnittbreite (Abbildung 4 und 4F). VEGF-A₁₆₅b hatte jedoch keinen Einfluss auf die veränderten Augenhöhlen Anzahl und SPS Abdeckung (Abbildung 4 und 4E)⁵.

RT-PCR durchgeführt auf RNA aus gesiebten Glomeruli extrahiert ergab, dass die menschliche VEGF-A₁₆₅b mRNA nur in die VEGF-A KO X Neph-VEGF-A₁₆₅b Mäuse (Abbildung 5A) vorhanden ist. Beim Extrahieren von Protein aus gesiebten Glomeruli und Beurteilung der Ebenen von Proteinen über westliche Beflecken, der glomerulären Protein-Expression des VEGFR-2 erwies sich als VEGF-A KO Mäusen verringert werden die Überexpression des VEGF-A₁₆₅b ( verhinderte Abbildung 5 b 5 c)⁵.

Abbildung 1. Schematische Aufbau die glomeruläre Permeabilität (L_pA) Rig. (A) der Glomerulus ist gefangen auf (B) die Mikropipette in einem Halter mit Absaugung, die auf eine Halterung für Stabilität aufgespannt ist. (C) rechteckige Objektträger. (D) 4 X Objektiv des Mikroskops mit einer Videokamera. (E) 1 % BSA Lösung auf 37 ° c erwärmt (F) 8 % BSA Lösung auf 37 ° c erwärmt (G) Fernbedienung, tippen Sie auf Lager Perifusate-haltigen zweizeilig, schnelle Perifusate Austausch ermöglicht. (H) Route des Perifusate in Richtung der Objektträger, die dann den Glomerulus badet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Harn Albumin-Kreatinin-Verhältnis. (A) die uACR Werte auf 0, 4, 10 und 14 Wochen nach Induktion der VEGF-A KO bei WT, VEGF-A KO und VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b-Mäusen. (B) die gleichen uACR Werte normiert auf den Ausgangswert (Woche 0) von jedem einzelnen Mausklick. Die uACR deutlich erhöht bei VEGF-A KO Mäusen in den Wochen 10 und 14 im Vergleich zur WT stellt Steuerelemente, die in den VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b Mäusen verhindert wurde (* p < 0,05; Zwei-Wege-ANOVA, Korrektur für den Vergleich zwischen Paaren; n = 4-12 Mäuse pro Zeitpunkt; Fehlerindikatoren: Standardfehler des Mittelwerts [SEM]). Diese Zahl wurde von Stevens Et al.⁵geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3. Messung der glomerulären Wasserdurchlässigkeit. (A) der Glomerulus ist gefangen auf die Mikropipette über Absaugung; die Perifusate von 1 % BSA (Ai), 8 % BSA (Aii) umgeschaltet, und glomerulären Schrumpfung wird beobachtet. (B) Messungen vor und nach dem 8 % BSA Schalter sind zur Ermittlung der glomerulären L_pA / V_ich. (C) VEGF-A KO Mäuse entwickeln eine erhöhte glomeruläre L_pA / V_ich bei 14 Wochen post Induktion von VEGF-A KO im Vergleich zu WT Kontrollen. Dies verhinderte nicht deutlich in VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b Mäuse (* p < 0,05; One way ANOVA, Bonferroni-Korrektur für den Vergleich zwischen Paaren; n = 4-9 Mäuse, 15-30 Glomeruli; Fehlerindikatoren: SEM). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4. Glomeruläre Strukturanalyse. (A) PAS Färbung der Rinde der Niere keinen Hinweis auf eine strukturellen Anomalien in den Glomeruli von WT, VEGF-A KO und VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b Mäusen (Ai - Iii). EM offenbart Ultra-strukturelle Anomalien in der VEGF-A KO Glomeruli (Aiv - vi). (B) die durchschnittliche FPW änderte sich nicht zwischen den Gruppen. (C) der GBM erhöht in der VEGF-A KO Glomeruli, die verhinderte VEGF-A₁₆₅b (D) , die die Anzahl der Augenhöhlen in VEGF-A KO Glomeruli zurückgegangen war die von VEGF-A₁₆₅B. (E) der SPS Abdeckung unverändert war in VEGF-A KO Glomeruli, die auch von VEGF-A₁₆₅b. (F) unverändert die durchschnittliche Schnittbreite im VEGF-A KO Glomeruli erhöht blieb wurde verringert, die durch VEGF-A₁₆₅b. (G) die Schlitz-Nummer verhindert wurde blieb unverändert zwischen den drei Gruppen (* p < 0,05; One way ANOVA, Bonferroni-Korrektur für den Vergleich zwischen Paaren; n = 3 Mäuse, 9 Glomeruli; Fehlerindikatoren: SEM). Diese Zahl wurde von Stevens Et al.⁵geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5. mRNA und Protein-Expression von Markern. (A) RT-PCR ergab, dass menschliche VEGF-A₁₆₅b mRNA Ausdruck nur in den gesiebten Glomeruli von VEGF-A KO X Neph-VEGF-A₁₆₅b Mäusen zeigte. (B) Western blotting darauf hingewiesen, dass VEGFR-2-Protein-Expression in VEGF-A KO Glomeruli nach unten geregelt war, wurde in VEGF-A KO X Neph-VEGF-A₁₆₅b Glomeruli verhindert (* p < 0,05; One way ANOVA, Bonferroni-Korrektur für den Vergleich zwischen Paaren; n = 3 - 6 Mäuse; Fehlerindikatoren: SEM). Diese Zahl wurde von Stevens Et al.⁵geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine vollständige Niere Aufarbeitung, die in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung, ermöglichen eine große Menge an Informationen über Niere und glomerulären Funktion aus einem einzigen Mausklick durchgeführt werden soll. Die entscheidenden Schritte in jeder Methode ermöglichen detaillierte funktionelle, strukturelle und mechanistischen Analyse der glomerulären Funktion, einschließlich der Beurteilung der Durchlässigkeit der Nieren als Ganzes (uACR und Plasma Kreatinin Messungen), die Durchlässigkeit der einzelne Glomeruli (glomerulären L_pA / V_ich), Prüfung der baulichen Veränderungen (PAS, Trichrome blau und EM), Protein-Lokalisierung (IF) und der glomerulären Genexpression (RT-PCR und Western blotting). Diese Methoden sind der Schlüssel für die vollständige Beurteilung der glomerulären Funktion in Mausmodellen Nierenerkrankung.

Bei der Beurteilung der Durchlässigkeit von der GFB haben viele Studien entschieden, um die herkömmliche uACR oder 24 h-Albumin Ausscheidung Rate als eine wirksame Maßnahme^17,18zu verwenden. Obwohl diese Techniken der GFB Durchlässigkeit als Ganzes bewerten, erlaubt es nicht für einzelne glomeruläre Permeabilität Bewertung und Variation unter den Glomeruli. Frühere Studien haben gefunden, Messung der glomerulären L_pA / V-_i , ein empfindlicher Maß von Änderungen an der GFB Durchlässigkeit^5,9. In der Tat in die repräsentativen Ergebnisse in diesem Beitrag gezeigt, bei 14 Wochen nach Induktion der VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A₁₆₅b Mäuse haben einen deutlich geringeren uACR im Vergleich zu VEGF-A KO Mäusen; Dieses Ergebnis spiegelt sich jedoch nicht in der glomerulären L_pA / V_ich Messungen, wo VEGF-A₁₆₅b deutlich verhinderte nicht erhöht in der GFB Durchlässigkeit (Abbildung 1 und Abbildung 2)⁵. Dies zeigt die Bedeutung des Einsatzes mehrerer Assays, um die Niere Durchlässigkeit und die Durchlässigkeit der einzelnen Glomeruli zu beurteilen. Darüber hinaus die glomeruläre L_pA / V_ich Oncometric Assay deutet darauf hin, dass die Durchlässigkeit der einzelnen Glomeruli aus der gleichen Niere kann stark variieren, insbesondere Krankheit Modelle^{5,10, 19}. eine Einschränkung zur Messung der glomerulären L_pA / V_ich ist, dass es nur auf den experimentellen Endpunkt; durchgeführt werden kann So sind regelmäßige uACR Messungen erforderlich, um einen Hinweis auf den experimentellen Endpunkt geben.

Neben der Beurteilung des funktionellen Phänotyps, fördert das vorliegende Verfahren auch die Bewertung der strukturellen und Ultrastrukturforschung Phänotyp. Dies kann mit einer Auswahl an Flecken wie PAS, trichrome, und silbernen Flecken; jeweils zu verschiedene Aspekten der glomerulären Morphologie zu beurteilen. In akuten Modellen der glomeruläre Erkrankung, die oft in Maus-Modellen der Fall ist, ist schwierig sein kann, großen strukturelle Anomalien diese Flecken zu verwenden, es sei denn, du eine ausgebildete renal Pathologen bist zu erkennen. Daher wird EM Durchführung vorgeschlagen, um die Ultrastruktur der GFB ermöglicht die quantitative Messung von Parametern wie der GBM, endotheliale Augenhöhlen Größe und Anzahl und hemolytic Merkmale zu beurteilen. Solche Messungen erfordern minimale Schulung durchzuführen und ermöglicht die Ermittler zu bestimmen, die Zelle-Typen/Strukturen in ein Krankheitsmodell betroffen. Im Beispiel in die repräsentativen Ergebnisse die VEGF-A KO Maus fand ein mildes Modell der glomerulären Erkrankung sein waren somit keine großen strukturellen Anomalien auf PAS Färbung. Hemolytic-spezifische VEGF-A KO jedoch Änderungen an der GBM, Podocytes und Endothelzellen auslösen, bei der Prüfung der glomerulären Ultra-Struktur⁵. Die Vorbereitung der Niere für die EM in dem vorliegenden Verfahren beschrieben aktivieren leider nicht Erkennung von endothelialen Glycocalyx, die auch bekannt ist, mit erheblichen Auswirkungen auf die Durchlässigkeit des GFB¹⁹. Um die Glycocalyx Tiefe genau zu messen, sollte die Niere mit 2,5 % Glutaraldehyd mit 1 % Alcian blau zur Kennzeichnung von endothelialen Glycocalyx durchspülen-fixiert sein Oltean Et Al¹⁹beschrieben.

Sobald der funktionelle und strukturelle Phänotyp beurteilt wurden, können der Ausdruck/Aktivierungsmuster von verschiedenen Genen und Wege dann gezielt in den Glomeruli beurteilt werden. Ultra-strukturellen Bewertung könnte einige Informationen über die Zelle Arten/glomeruläre Strukturen beteiligt, gibt an, ob hemolytic oder Endothel-spezifische Gene/Wege geprüft werden sollte. Beispielsweise wurde eine Verringerung der Zahl der endothelialen Augenhöhlen in die repräsentativen Ergebnisse von den VEGF-A KO-Mäusen (Abbildung 3D) beobachtet; Daher wurde der glomerulären Protein-Expression eine endotheliale Marker bekannt, in dem VEGF-A Weg einbezogen untersucht; VEGFR-2 (Abbildung 4 b)⁵. Neben der Expression von Proteinen in den Glomeruli kann ihre Lokalisierung auch mit wenn visualisiert werden. In einer Studie von Zhang Et Al²⁰wurde hemolytic-spezifische Überexpression des GLUT1 in der Podocytes von bestätigt, wenn die erhöhte GLUT1 mit Podocin Co lokalisieren.

Im Vergleich zu alternativen Methoden in der Literatur zur Beurteilung der glomerulären Funktion vorgestellt ermöglicht den Einsatz der Methode skizziert in diesem Papier auf die Nierenfunktion in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung den glomerulären Phänotyp aus vollständig ausgewertet werden mehrere Aspekte. Mithilfe dieser Methode kann der Forscher den Niere Phänotyp des Modells ermittelt und bewertet den Mechanismus, warum der Phänotyp entwickelt. Diese wichtigen Informationen über den Mechanismus der Krankheit ist erforderlich, wenn mögliche therapeutische Wege in diesen Modellen untersucht. Diese Methode kann leicht auf zukünftige Untersuchungen glomerulären Funktion bei der Bewertung von Krankheit Phänotypen und mögliche Therapie angewendet werden.

Abschließend beschreibt diese generischen und anpassungsfähige Protokoll einen vollständige Niere Work-Up für Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung, ermöglichen eine große Menge an Informationen über Niere und glomerulären Funktion aus einem einzigen Mausklick abgerufen werden. Die Methoden können für funktionelle, strukturelle und mechanistische Detailanalyse der glomerulären Funktion, die auf alle Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung angewendet werden kann.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Metabolic Cages	Harvard Apparatus	52-6731
Tris buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	T5912-1L
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2058
Mouse Albumin ELISA Quantitation Set	Bethyl Laboratories	E90-134
TMB ELISA Substrate solution	ThermoFisher Scientific	34028
Sulphuric acid	Sigma-Aldrich	339741
SPECTRstar nano	BMG Labtech	SPECTRstar nano or equivalent
RNAlater stabilisation solution	ThermoFisher Scientific	AM7020
4-15% precast protein gel	BIORAD	4568084
4x Laaemmli Sample buffer	BIORAD	161-0747
Mini Trans-Blot cell	BIORAD	1703930
10x Tris running buffer	BIORAD	1610732
Coomassie Brilliant Blue Dye	ThermoFisher Scientific	20278
Creatinine Companion	Exocell	1012 Strip Plate
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G5882
Sodium Cacodylate	Sigma-Aldrich	C0250
10x Phosphate Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	AM9625
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium Phosphate	Sigma-Aldrich	342483
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C5670
D(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
EDTA Blood Collection tubes	BD	367835
23-25G Needle	BD	PMC0735
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
10 ml Glass Vial	Thomas Scientific	0914X10
Falcon 10 ml Polypropylene Tubes	ThermoFisher Scientific	10110101
0.5 ml Tubes	ThermoFisher Scientific	10681894
Disposable Tissue Molds	ThermoFisher Scientific	22-363-553
Mouse Surgical Disection Kit	ThermoFisher Scientific	13-005-204
Optimal Cutting Medium	ThermoFisher Scientific	23-730-571
4% Paraformaldehyde	ThermoFisher Scientific	AAJ19943K2
Glass Capillary Tubes	Harvard Apparatus	EC1 64-0770
Glomerular Permeability Rig	Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available	Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol
Stainless Steel Sieves	Cole-Parmer	WZ-59984
Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System	Sigma-Aldrich	395B-1KT
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136
Xylene	MerckMillipore	108298
Poly-Prep Slides	Sigma-Aldrich	P0425-72EA
Mounting Medium	ThermoFisher Scientific	8030
Osmium tetroxide solution	Sigma-Aldrich	75632
Aradite Resin	Agar Scientific	CY212
Uranyl Acetate	Agar Scientific	AGR1260A
Lead Citrate	Agar Scientific	AGR1210
Cryostat	ThermoFisher Scientific	e.g. 957000H
Hydrophobic Pen	Abcam	ab2601
Nephrin (1243-1256) Antibody	Acris	BP5030
Anti-Podocin	Sigma-Aldrich	P0372-200UL
Anti-CD31	BD Biosciences	550274
Alexa Fluor Secondary Antibody	ThermoFisher Scientific	A32732
Vectashield Mounting Medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
NP40 Cell Lysis Buffer	ThermoFisher Scientific	FNN0021
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	ThermoFisher Scientific	78437X4
10x Transfer Buffer	BIORAD	1610734
PVDF Membrane	ThermoFisher Scientific	LC2002
HRP-Conjugated Secondary Antibodies	Abcam	ab6721
ECF Substrate for Western Blotting	Fisher	10713387
TRIzol	ThermoFisher Scientific	15596018
Dnase I	New England Biolabs	M0303S
M-MLV Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M053S
Oligo dT	ThermoFisher Scientific	18418012
Random Primers	ThermoFisher Scientific	48190011
dNTP	ThermoFisher Scientific	18427088
Ribonuclease Inhibitor	ThermoFisher Scientific	10777019
DEPC Water	ThermoFisher Scientific	AM9915G
Fluorescent Light Miscroscope	Leica Microsystems
Image J Analysis Software	Image J
PCR Thermocycler	ThermoFisher Scientific
TEM Microscope	Britannica