JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

معظم الجينات التعبير القياسات سحابة خلية فردية الاختلافات في الخلية غير المتجانسة السكان. هنا، يمكننا وصف بروتوكول تحليل التعبير الجيني كيف خلية واحدة وفهرس الفرز بالتنوير تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) ويمكن الجمع بين تحديد عدم التجانس وإيمونوفينوتيبيكالي تميز سكان الخلية جزيئيا متميزة.

Abstract

قد استخدمت منذ فترة طويلة إيمونوفينوتيبيك الوصف والتحليل الجزيئي تحدد عدم التجانس وتعريف السكان خلية متميزة. نظام مراقبة الأصول الميدانية أصلاً مقايسة خلية واحدة، لكن السابقة للتحليل الجزيئي، الخلايا الهدف غالباً مستقبلي معزولة بكميات كبيرة، وبالتالي فقدان القرار خلية واحدة. تحليل التعبير الجيني خلية واحدة يوفر وسيلة لفهم الاختلافات الجزيئية بين خلايا فردية في الخلية غير المتجانسة السكان. في جل خلية تحليل النتائج التمثيل المفرط لنوع الخلية متميزة في التحيزات وانسداد إشارات من خلايا نادرة مع الأهمية البيولوجية. باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز الفهرس بالإضافة إلى تحليل التعبير الجيني خلية واحدة، يمكن التحقيق السكان دون فقدان القرار خلية واحدة بينما هي أيضا القبض على الخلايا مع الخلايا الوسيطة التعبير علامة السطحية، مما يتيح تقييم أهمية التعبير علامة السطحية المستمرة. هنا، يمكننا وصف نهج يجمع بين النسخ العكسي خلية واحدة الكمي PCR (RT-qPCR) ونظام مراقبة الأصول الميدانية فهرس الفرز في نفس الوقت تميز الجزيئية والتغاير إيمونوفينوتيبيك داخل الخلية السكان.

على النقيض من أساليب تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة، يتيح استخدام qPCR مع التضخيم مستهدفة محددة لقياسات قوية منخفضة-وفرة النصوص مع عدد المنقطعين عن الدراسة، في حين أنه هو مرتبك لا بالقضايا المتصلة بخلية إلى الاختلافات في القراءة العمق. وعلاوة على ذلك، قبل مباشرة خلايا مفردة الفرز الفهرس إلى تفسخ المخزن المؤقت هذا الأسلوب، يسمح لتوليف كدنا ومستهدفة محددة قبل التضخيم تتم في خطوة واحدة، وكذلك فيما يتعلق بارتباط التوقيعات الجزيئية المشتقة في وقت لاحق مع سطح الخلية علامة التعبير. قد وضعت هذا النهج المبين للتحقيق واحد-الخلايا المكونة للدم، ولكن أيضا قد استخدمت بنجاح في أنواع الخلايا الأخرى.

وفي الختام، يسمح النهج المبينة في هذا التقرير لقياس حساسية التعبير مرناً للوحة من جينات محددة مسبقاً مع إمكانية وضع بروتوكولات لعزل المحتملين اللاحقة للفئات السكانية الفرعية جزيئيا متميزة.

Introduction

ويعتقد كل خلية الدم الفردية الموجودة في التسلسل هرمي خلوية، حيث تشكل الخلايا الجذعية قمة على رأس مجموعة من التزام متزايد المتكفل الوسيطة التي تميز في نهاية المطاف الميؤوس من شفائهم في خلايا المستجيب النهائي تحمل محددة 1من الوظائف البيولوجية. الكثير من المعرفة حول كيفية تنظيم نظم الخلايا الجذعية تم إنشاؤها في نظام المكونة للدم، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى القدرة على عزل مستقبلي متميز السكان المكونة للدم العالي التخصيب للخلايا الجذعية أو فروعه المختلفة2 عن طريق فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية. وقد أتاح للعديد من هؤلاء السكان يتم تحليلها وظيفيا أو جزيئيا، في الغالب من خلال التعبير الجيني التنميط3،4. ومع ذلك عندما تحليل التعبير الجيني لمعظم السكان الفروق الفردية بين الخلايا بلغ وفقدت5. وبالتالي، عدم القدرة على الكشف عن الاختلافات خلية إلى خلية داخل الخلية غير متجانسة الكسور قد إرباك فهمنا للعمليات البيولوجية الحرجة إذا كان حساب مجموعات فرعية صغيرة من الخلايا للوظيفة البيولوجية تم استنتاجه من أن السكان6، 7. على العكس من ذلك، التحقيق في التوقيعات التعبير الجيني في القرار خلية واحدة تتيح إمكانية تحديد عدم التجانس والالتفاف حول التأثيرات تحجب من مجموعات فرعية زائداً من الخلايا8.

وقد وضعت العديد من البروتوكولات لتحليل التعبير الجيني خلية واحدة حتى الآن؛ مع كل نهج وبعد التحذيرات الخاصة به. وكان الأسلوب أقرب الحمض النووي الريبي الفلورسنت في الموقع التهجين (الحمض النووي الريبي-الأسماك)، الذي يقيس عدد محدود من النصوص في وقت واحد ولكن هي فريدة من نوعها حيث يسمح للتحقيق في الجيش الملكي النيبالي ومسلم9،11. تطوير أساليب المبكر باستخدام PCR و qPCR للكشف عن واحدة أو نسخ قليلة جداً وكانت أيضا12. ومع ذلك، هذه في الآونة الأخيرة تم استبدال بالأساليب المستندة إلى ميكروفلويديكس التي يمكن تحليل التعبير عن مئات نصوص كل خلية في مئات خلايا عن طريق قبكر في أن واحد وتسمح بالتالي لاستخدام تحليل التباين العالي ثلاثي الأبعاد تحدد مسبقاً الجينات لوحات10،13. مؤخرا التكنولوجيات المستندة إلى تسلسل الحمض النووي الريبي قد أصبحت تستخدم على نطاق واسع لتحليل خلية مفردة، هذه من الناحية النظرية يمكن أن قياس الترنسكربيتوم كامل من خلية وأضفى بعدا استكشافية إلى التغايرية تحليل10، 14. مولتيبليكسيد قبكر تحليل وتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة لها ملامح مختلفة، وبالتالي أن الأساس المنطقي لاستخدام أي من الأساليب يعتمد على السؤال فضلا عن العدد الخلايا في المجموعة السكانية المستهدفة. ومن المستصوب الفائق، وتكلفة منخفضة للخلية جنبا إلى جنب مع خصائص غير منحازة، واستكشافية لتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة عندما يتم التحقيق في الخلية غير معروف أو إعداد كبيرة من السكان. ومع ذلك، هو أيضا منحازة تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة تسلسل النصوص وفرة عالية أكثر تواترا بينما النصوص مع وفرة منخفضة معرضة للانقطاع عن الدراسة. وهذا يمكن أن يؤدي إلى البيانات المعقدة إلى حد كبير أن يضع مطالب عالية على تحليل بيوينفورماتيك للكشف عن الإشارات الجزيئية الهامة التي غالباً ما تكون خفية أو المخفية في الضوضاء التقنية15. وهكذا، للأنسجة تتميز جيدا، قبكر خلية واحدة باستخدام تحليل تحدد مسبقاً التمهيدي لوحات مختارة للجينات وظيفيا هاما أو الواسمات الجزيئية بمثابة نهج حساسية واضحة لتحديد عدم تجانس السكان. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن المقارنة للحمض النووي الريبي خلية واحدة-seq، تكلفة كل خلية أعلى بصفة عامة لأساليب qPCR خلية واحدة. وهنا يصف لنا نهجاً يجمع بين خلية واحدة RT-قبكر (تعديل من تيليس J. et al. 16)، إلى فهرس نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز17 والمعلوماتية الحيوية التحليل18 من أجل في نفس الوقت تميز التغايرية الجزيئية وإيمونوفينوتيبيك ضمن السكان.

في هذا النهج، هو الملون السكان خلية للفائدة، وخلايا مفردة يتم فرزها حسب الأصول مباشرة إلى المخزن المؤقت لتحلل في لوحات بكر 96-جيدا. في نفس الوقت، يتم تسجيل مستويات التعبير من مجموعة إضافية من علامات سطح الخلية لكل خلية واحدة خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية-الفرز، أسلوب الذي يشار إليه كفهرس الفرز. بعد ذلك يتم تضخيمه بتفكيك خلية المواد وتحليل التعبير الجيني لمجموعة مختارة من الجينات مع RT-قبكر، باستخدام منصة موائع جزيئية. تمكن هذه الاستراتيجية التحليل الجزيئي لتوصيف خلية واحدة فضلا عن تزامن مفروزة التعبير علامة الخلية-سطح كل خلية فردية. عن طريق تعيين مجموعات فرعية متميزة جزيئيا من الخلايا مباشرة للتعبير عن علامات مفروزة المفهرسة، يمكن ربطها الفئات السكانية الفرعية إيمونوفينوتيبي محددة التي يمكن استخدامها لعزلتها المحتملين. ويرد الأسلوب خطوة بخطوة في الشكل 1. لوحة جينات محددة سلفا كما يسهم في دقة أعلى تعبير الجينات المستهدفة، حيث أنها تلتف القياس غير ذي صلة الجينات الوفيرة التي يمكن لولا ذلك أوككلودي إشارات التعبير الجيني خفية. وعلاوة على ذلك، يسمح التضخيم مستهدفة محددة، خطوة واحدة النسخ العكسي، وتضخيم لقياس قوة النصوص أعرب منخفضة، مثل عوامل النسخ أو الكشف غير بولي-أدينيلاتيد. الأهم من ذلك، تسمح أساليب qPCR لقياس مرناً من البروتينات الانصهار، ومهمة عند التحقيق في بعض الأمراض الخبيثة19. وأخيراً، التحقيق تركز عدد الجينات، انخفاض معدلات التسرب، والاختلافات التقنية المحدودة بين جعل الخلايا بسهولة تحليل هذا الأسلوب مقارنة بالأساليب الأبعاد أعلى، مثل الحمض النووي الريبي خلية واحدة-ما يليها باتباع البروتوكول، يمكن إجراء تجربة كاملة، من فرز الخلايا لتحليل النتائج، في غضون ثلاثة أيام، مما يجعل هذا طريقة غير معقدة وسريعة لتحليل التعبير الجيني وحيدة الخلية الحساسة، والفائق.

Protocol

1-إعداد لوحات تحلل

  1. استخدام مقعد مجاناً الحمض النووي الريبي/الحمض النووي، إعداد المخزن المؤقت تحلل ما يكفي للآبار 96، مع 10% إضافية، بخلط المياه مجاناً nuclease ميليلتر 390, ميليلتر 17% 10 NP-40، 2.8 دنتب ملم 10 ميليلتر، 10 ميليلتر 0.1 M DTT ومثبط رناسي ميليلتر 5.3 (انظر الجدول للمواد). دوامة وتدور إلى أسفل.
  2. توزيع 4 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت لكل بئر من صفيحة بكر جيدا 96 وختم اللوحات مع الفيلم لاصقة. تدور أسفل أنابيب لجمع السائل في الجزء السفلي من اللوحات. تبقى لوحات على الجليد حتى الخلية الفرز (خلال ال 24 ساعة كحد أقصى).

2-إعداد الخلايا للخلية الفرز

  1. ذوبان الجليد عدد مناسب من الخلايا (هنا، CD34 المخصب الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف) للتجربة. 1 × 106 خلايا تكون مناسبة لفرز حوالي ثلاث لوحات 96-جيدا من خلايا مفردة مع عناصر التحكم.
  2. نقل الخلايا المذابة إلى أنبوب مخروطي 15 مل ثم أضف 1 مل FBS كل 30 ثانية حتى يتم الوصول إلى وحدة تخزين إجمالي 8 مل. تدور الخلايا في أجهزة الطرد مركزي في 350 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية.
  3. ريسوسبيند الخلايا في 8 مل تلطيخ المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني مع 2% FBS) والطرد المركزي في 350 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية.
  4. المخزن المؤقت ريسوسبيند الخلايا في تلطيخ 200 ميليلتر وإزالة الخلايا لمراقبة البقع.
  5. جعل Fluorescence ناقص واحد عناصر التحكم (فموس) لكل فلوروفوري، تلطيخ جزء صغير من خلايا في 50 ميليلتر تلطيخ المخزن المؤقت. في هذا المثال، يتم استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي 6 مع خلايا 20,000 فموس. علما أن عدد الخلايا ينبغي أن تعدل تبعاً للسكان بالتحقيق. إضافة جميع الأجسام المضادة في تركيز نفسه كما هو الحال في وصمة عار عينة باستثناء حالة واحدة لكل أنبوبة.
  6. جعل البقع واحد لكل فلوروفوري بتلوين جزء بسيط خلايا في 50 ميليلتر العازلة لكل فلوروفوري المستخدمة. في هذا المثال يتم استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي 6 مع خلايا 20,000. علما بأن الهدف المحدد لكل جسم يحتاج إلى التعبير عن طريق الخلايا المستخدمة لعناصر التحكم. إضافة كل جسم في تركيز نفسه كما هو الحال في عينة وصمة عار في أنابيب فردية. بالإضافة إلى ذلك تبقى 20,000 الخلايا أونستينيد في 50 ميليلتر كعنصر تحكم أونستينيد.
  7. نموذج الخلية، إضافة الأجسام المضادة تركيز مناسب. المستخدمة هنا هي CD34-فيتك بتركيز 1/100، CD38-آسيا والمحيط الهادئ 1/50، CD90-بي 1/10، CD45RA-bv421 1/50، CD49F-PECy7 1/50، ومزيج النسب: CD3-PECy5 1/50، CD2-PECy5 1/50، CD19-PECy5 1/50، CD56-PECy5 1/50، CD123-PECy5 1/50، CD14-PECy5 1/50، CD16-PECy5 1/50، و CD235a-PECy5 1/1000.
  8. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام.
  9. تغسل الخلايا مع 3 مل تلطيخ المخزن المؤقت. الطرد المركزي خلايا في 350 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية.
  10. ريسوسبيند الخلايا وكرر الخطوة 2.9.
  11. ريسوسبيند العينة في 500 ميليلتر وفموس في 100 ميليلتر تلطيخ المخزن المؤقت مع خلايا 7AAD وتصفية 1/100 من خلال عامل تصفية 50 ميكرون الحصول على تعليق خلية واحدة.

3-الخلية الفرز

  1. تأكد من أن يتم تعيين الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية حتى بشكل صحيح مع تأخير الإسقاط والإعداد سيتوميتير وتتبع (لجنة العلم والتكنولوجيا) التي تم تنفيذها مؤخرا وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، لضمان أن يتم فرز الخلايا المناسبة. للخلايا المكونة للدم، وينصح استخدام 85 ميكرون فوهة وبأقصى سرعة 4، بينما معدل الحدث الأمثل ما بين 800 و 2000 الأحداث/s.
  2. تصحيح التداخل الطيفي بأداء تعويض الأسفار وتعيين غيتس وفقا لضوابط FMO أو الضوابط الداخلية السلبية.
  3. إجراء تحليل للسكان المستهدفين بفرز الخلايا الهدف على الأقل 100 في أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة مع 100 ميليلتر من المخزن المؤقت وصمة عار. نظام مراقبة الأصول الميدانية تحليل الخلايا تم فرزها بتسجيل العينة تم فرزها والتأكد من أن أنها في نهاية المطاف في بوابة الفرز.
  4. إنشاء لوحة خلية واحدة الفرز حسب تركز الانخفاض في A1 جيدا في صفيحة جيدا 96. عندما يتم توسيطه، فرز 50 – 100 6 ميكرومتر الجسيمات في جميع الآبار حول حافة صفيحة جيدا 96 فارغة التأكد من أن جميع الآبار سوف تحصل على خلية في المركز من كل بئر.
  5. إذا كان ذلك ممكناً، يمكن إضافة عنصر تحكم إضافية لضمان أن يتم فرز الخلايا قابلة للاستمرار بفرز الخلايا وحيدة للنمو في المختبر . يمكن زراعة خلايا الدم في لوحات 96 يو-أسفل جيدا في 100 ميليلتر سفيم مع 1% البنسلين والستربتوميسين، 100 نانوغرام/مل FLT3L، ومنظمات ترويج التجارة، وصندوق إنقاذ الطفولة. تحليل كل بئر بعد 3 أيام في الثقافة للمستعمرات الخلية باستخدام مجهر.
  6. إزالة الفيلم لاصقة من لوحات. تنشيط نوع خلية واحدة من الفائدة (هنا لين-CD34 + CD38-الخلايا) إلى 92 من الآبار 96، فهرس الفرز في الأصول فرز البرامج لحفظ التشكيل الجانبي إيمونوفينوتيبيك لعلامات أخرى للفائدة (هنا CD45RA و CD49f و CD90) لكل خلية مفردة.
  7. فرز بئرين مع الخلايا 10 و 20 على التوالي لعناصر التحكم الخطي في التضخيم PCR. عادة ما تستخدم الآبار H1 و H2.
  8. إبقاء اثنين من الآبار دون أي الخلايا كقالب لا عناصر تحكم، عادة ما تكون آبار H3 و H4.
  9. ختم اللوحات مع الفيلم لاصقة واضحة وتدور اللوحات في 300 x ز لمدة 1 دقيقة قبل الأداة التجميد على الثلج الجاف.
  10. تخزين ألواح مجمدة في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: نقطة توقف آمنة. يمكن الاحتفاظ بفرزها وتفكيك الخلايا في-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

4-عكس النسخ والتضخيم مستهدفة محددة

  1. إعداد ميكس التمهيدي لجميع الجينات 96 الأهداف بإضافة 2 ميليلتر لكل زوج التمهيدي، بما في ذلك التدبير المنزلي الجينات الإشعال والإشعال لارتفعت في مراقبة الجيش الملكي النيبالي، في 1.5 مل من أنبوب رناسي مجاناً على مقعد مجاناً في الجيش الملكي النيبالي/الحمض النووي. في حالة استخدام أجهزة الإشعال أقل من 96، إضافة وحدة تخزين ما يعادل nuclease المياه مجاناً للإشعال مفقود. كبسولة تفجير مرتبة كل على حدة بحيث تتطابق مع الفريق الجينات المرغوبة.
  2. جعل النسخ العكسي والتضخيم مستهدفة محددة المزيج بإضافة ميليلتر 632.5 2 x ميكس رد فعل، ميليلتر 101.2 بوليميراز/سوبيرسكريبتيي و 151.8 ميليلتر التمهيدي مزيج ميليلتر 0.7 ارتفعت في السيطرة على الجيش الملكي النيبالي. التشكيل هذه الخطوة على مقعد مجاناً الحمض النووي. مزيج من فورتيكسينج وتدور وصولاً إلى جمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب. الحفاظ على الجليد حتى بالإضافة إلى العينة.
  3. جعل النسخ العكسي لا تحكم المزيج لأربعة آبار بخلط ميليلتر 27.5 2 x ميكس رد فعل، وميليلتر 1.76 إنزيم بوليميراز، 6.6 ميليلتر من التمهيدي مزيج وميليلتر 2.64 نوكلاس المياه مجاناً. سبايك في السيطرة على الجيش الملكي النيبالي. تنفيذ هذه الخطوة على مقعد مجاناً الحمض النووي. دوامة وتدور وصولاً إلى جمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب والحفاظ على الجليد حتى بالإضافة إلى عينة.
  4. ذوبان الجليد لوحات ليستي على الجليد. إضافة ميليلتر 8.75 النسخ العكسي معدّة مسبقاً ومزيج التضخيم مستهدفة محددة إلى 92 بئرا، بما في ذلك عناصر التحكم الخطي ولا القالب. إضافة ميليلتر 8.75 من النسخ العكسي لا تحكم المزيج إلى الآبار الأربعة المتبقية. ختم لوحات مع الفيلم لاصقة واضحة وتدور وصولاً إلى جمع السائل في الجزء السفلي من اللوحات.
  5. التشكيل النسخ العكسي والتضخيم مستهدفة محددة عن طريق تشغيل اللوحة في جهاز PCR طبقاً لبرنامج preamp؛ الخطوة 01:50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، الخطوة 2:95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، والخطوة 3:95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، الخطوة 4:60 درجة مئوية لمدة 4 دقائق، كرر الخطوات 3-4 24 مرات وأخيراً الخطوة 5:8 درجة مئوية إلى الأبد.
  6. بعد اكتمال الاسترداد، تبقى اللوحة 8 درجة مئوية للتخزين على المدى القصير و-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
    ملاحظة: نقطة توقف آمنة. يمكن الاحتفاظ بمواد تضخيم 8 درجة مئوية للتخزين القصير الأجل وإلى-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

5-إعداد نماذج ولوحات الفحص لتحليل التعبير الجيني موائع جزيئية متعدد

  1. إعداد المقايسة تحميل لوحة بيبيتينج 3 ميليلتر المقايسة تحميل كاشف لكل بئر من صفيحة جيدا 96. إضافة 3 ميليلتر من كل التمهيدي إلى الآبار الفردية في مقايسة تحميل لوحة.
  2. ختم اللوحة مع الفيلم لاصقة وتدور وصولاً إلى جمع السائل في الجزء السفلي من اللوحات.
  3. إعداد لوحة تمييع حلول ميليلتر 8 بيبيتينج من نوكلياسي المياه مجاناً إلى جميع الآبار من صفيحة جيدا 96. إضافة 2 ميليلتر من عينة تضخيم للوحة إضعاف، مما يجعل إضعاف نهائي من 1:5.
  4. ختم اللوحة مع الفيلم لاصقة، ومزيج من لوحة فورتيكسينج لمدة 10 ثانية، وأخيراً تدور وصولاً إلى جمع السائل في الجزء السفلي من اللوحات.
  5. إعداد مزيج تحميل العينة بعناية خلط ميليلتر 352 من مزيج الرئيسي مع 35.2 ميكروليتر من عينة تحميل كاشف. إعداد نموذج تحميل لوحة اليقوتينج 3.3 ميليلتر من تحميل ميكس لكل بئر من صفيحة جيدا 96.
  6. إضافة ميليلتر 2.7 من العينة المخففة في كل من العينة تحميل لوحة جيدا.
  7. ختم اللوحة مع الفيلم لاصقة وتدور وصولاً إلى جمع السائل في الجزء السفلي من اللوحات.

6-تحميل رقاقة موائع جزيئية

  1. تأخذ بها رقاقة موائع جزيئية 96 × 96 جديدة. إعداد المداخل بدس لهم مع المحاقن مع غطاء على للتأكد من أنه يمكن نقلها.
  2. إزالة فقاعات من المحاقن. إضافة الحجم الكامل للمحاقن لكل صمام بينما إمالة الرقاقة 45 درجة والضغط الصمام. رئيس الوزراء رقاقة مع وحدة تحكم المؤسسة المالية الدولية.
  3. تحميل كل مدخل المقايسة مع 4.25 ميليلتر من كل من الآبار في مقايسة تحميل لوحة. تجنب الفقاعات. في حالة ظهور فقاعات في البئر، إزالتها مع تلميح ماصة.
  4. متابعة تحميل كل مدخل العينة مع 4.25 ميليلتر من كل من الآبار في العينة تحميل لوحة وتجنب فقاعات، وإذا لم تظهر فقاعات، إزالتها مع تلميح ماصة.
  5. تحميل رقاقة مع وحدة تحكم المؤسسة المالية الدولية.
  6. تحقق من أن الرقاقة تبدو حتى وأن تم تحميلها بجميع الدوائر. إزالة الغبار من على سطح رقاقة بلمسها مع الشريط. تشغيل شرائح في منهاج التعبير الجيني متعدد موائع جزيئية.

7-تشغيل شريحة على منصة التعبير متعدد الجينات موائع جزيئية

  1. بعد تحميل رقاقة في منهاج التعبير الجيني موائع جزيئية متعدد، اسم العينة.
  2. تعيين روكس كصبغة سلبية. تعيين المسبار واحد والاتحاد الماليزي-مغب الأسفار. استخدام v2 قياسي 96 × 96 كبروتوكول. بدء تشغيل.
  3. رقاقة إزالة عند تشغيل كاملة.

8-أولية تحليل تشغيل شريحة

  1. تحميل البيانات إلى برمجيات تحليل PCR الوقت الحقيقي.
  2. تحميل أسماء الجينات والخلايا عن طريق لصق التخطيطات الخلية والجينات من ملف محدد بعلامة جدولة.
  3. فتح طريقة عرض الصورة وحدد روكس كصبغ. تحقق إذا كانت جميع الآبار قد صبغ روكس السلبي.
  4. التحقيق إذا كان جميع التضخيم مؤامرات تبدو موافق، مع منحنى تضخيم سلس مع لا طفرات (مشابه الرقم 3E).
  5. تكفل لكل واحد-الخلايا التعبير ارتفعت في مراقبة الحمض النووي الريبي للتأكد من أن كل شيء قد جرى تحميلها بشكل صحيح.
  6. التأكد من أن كافة الخلايا التعبير الجيني التدبير المنزلي، وهكذا تم فرز بشكل صحيح.
  7. تضمن 10 و 20 من عناصر التحكم الخطي الخلية حوالي CT 1 الفرق للتحقق من صحة التضخيم الخطي.
  8. التحقق من ما إذا كان هناك تعبير في عينات مراقبة نورت. إذا تم الكشف عن التعبير في نورت بعين الاعتبار تغيير المسابير للتحقيقات التي لم يكشف المجينية الحمض النووي لتشغيل اللاحقة.
  9. تصدير البيانات في ملفات csv لمزيد من التحليل.

9-خلية واحدة التحليل باستخدام سسيكسف

ملاحظة: هذا فيلم تمهيدية هو الحالي20 إدخال الأداة. ويرد هنا، توصية قصيرة لكيفية القيام بالتحليل باستخدام عناصر التحكم الموجودة في البروتوكول.

  1. الاتصال ب موقع على شبكة الإنترنت سسيكسف20.
  2. تحميل ملفات CSV المصدرة.
  3. اختيار مراقبة ارتفعت في الجيش الملكي النيبالي كمراقبة إيجابية. قم بإزالة أي خلية الذي يحتوي على عنصر تحكم CT الحمض النووي الريبي أعلى من 25. تطبيع البيانات للتعبير الوسيط لمراقبة الجيش الملكي النيبالي.
  4. انقر فوق "هنا--> تحليل". إزالة نورت، نوتيمبلاتي، 10 و 20 من عناصر الخلية في استبعاد خيار خلية.
  5. كتلة الخلايا مع النهج التجميعي الاختيار مع العدد المتوقع من المجموعات. قيم الصادرات التي تم تحليلها.

10-فهرس الفرز التحليل

  1. نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل البرمجيات المفتوحة وتحميل العينات مفهرسة.
  2. فتح محرر البرامج النصية وقم بتشغيل البرنامج النصي متاح من كوين J. et al. 21
  3. الآن أنه ينبغي جعلت البرنامج تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية بوابة لكل خلية واحدة، افتح محرر تخطيط ولون الخلايا وفقا لهذا التجمع من سسيكسف (متوفرة في الملف المسمى "Sample_complete_Data.xls").

النتائج

بروتوكول وصف سريعة، وتنفيذه بسهولة وموثوق بها للغاية. ويرد في الشكل 1لمحة عامة عن الإعداد التجريبية. يمكن تنفيذ البروتوكول كاملة، من الفرز من خلايا مفردة، إلى التضخيم مستهدفة محددة، وقياسات التعبير الجيني وتحليل أولى في غضون ثلاثة أيام. مثال على تحليل ال...

Discussion

وفي السنوات الأخيرة، أصبح تحليل التعبير الجيني خلية واحدة إضافة قيمة لتعريف عدم تجانس السكان خلية مختلفة23. ظهور التكنولوجيات تسلسل الحمض النووي الريبي نظرياً يوفر إمكانية قياس الترنسكربيتوم كامل من خلية، لكن هذه الأساليب هي تعقدت الاختلافات في أعماق تسلسل خلية إلى خلية، وا...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذا العمل معتمد من المنح المقدمة من الجمعية السويدية لمكافحة السرطان، ومجلس البحوث السويدية، المجتمع السويدي للأبحاث الطبية، ومؤسسة سرطان الطفولة السويدية، راغنار سودربيرغ المؤسسة، وكنوت ومؤسسة والنبرغ أليس

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CD14 PECY5eBioscience15-0149-42Clone: 61D3
CD16 PECY5Biolegend302010Clone: 3G8
CD56 PECY5Biolegend304608Clone: MEM-188
CD19 PECY5Biolegend302210Clone: HIB19
CD2 PECY5Biolegend300210Clone: RPA-2.10
CD3 PECY5Biolegend300310Clone: HIT3a
CD123 PECY5Biolegend306008Clone: 6H6
CD235A PECY5BD Pharma559944Clone GAR2
CD34 FITCBiolegend343604Clone: 561
CD38 APCBiolegend303510Clone: Hit2
CD90 PEBiolegend328110Clone: 5E10
CD45RA BV421BD bioscience560362Clone: HI100
CD49f Pecy7eBioscience25-0495-82Clone: eBioGOH3
FBSHyCloneSV30160.3
PBSHyCloneSH30028.02
96-well u-bottom PlateVWR10861-564
SFEMStem cell technologies9650
Penicillin streptomycinHyCloneSV30010
TPOPeprotech300-18
SCFPeprotech300-07
FLT3LPeprotech300-19
Falcon Tube 15 mLSarstedt62.554.502
Eppendorph tubeSarstedt72.690.001
CST beadsBD642412
Accudrop BeadsBD3452496 µm particles 
Adhesive film ClearThermo scientific AB-1170
Adhesive film FoilThermo scientific AB-0626
96 well PCR plateAxygenPCR-96M2-HS-C
PCR 1.5 mL tubeAxygenMCT-150-L-C
T100 PCR cyclerBioRad186-1096
10% NP40Thermo scientific 85124
10 mM dNTPTakara4030
0.1 M DTTInvitrogenP2325
RNAsoutInvitrogen10777-019RNAse inhibitor
CellsDirect One-Step qRT-PCR KitInvitrogen11753-100
Neuclease free waterInvitrogen11753-100from CellsDirect kit
2x Reaction MixInvitrogen11753-100from CellsDirect kit
SuperScript III RT/Platinum Taq MixInvitrogen11753-100from CellsDirect kit
Platinum Taq DNA PolymeraseInvitrogen10966026
TaqMan Cells-to-CT Control KitInvitrogen4386995
Xeno RNA ControlInvitrogen4386995From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression AssayInvitrogen4386995From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCsFluidigmBMK-M10-96.96
2x Assay Loading ReagentFluidigmFrom 96.96 Sample/Loading Kit
20x GE Sample Loading ReagentFluidigmFrom 96.96 Sample/Loading Kit
Control line fluid FluidigmFrom 96.96 Sample/Loading Kit
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystems4369016
BioMark HDFluidigmBMKHD-BMKHD
96.96 Dynamic Array IFCFluidigmBMK-M10-96.96GT
ExcelMicrosoftMicrosoft
FlowJo V10TreeStarTreeStar
Fluidigm real time PCR analysisFluidigmFluidigm
CD179a.VPREB1Thermofisher scientificHs00356766_g1
ACEThermofisher scientificHs00174179_m1
AHRThermofisher scientificHs00169233_m1
BCR_ABL.52Thermofisher scientificHs03043652_ft
BCR_ABL41Thermofisher scientificHs03024541_ft
BMI1Thermofisher scientificHs00995536_m1
CCNA2Thermofisher scientificHs00996788_m1
CCNB1Thermofisher scientificHs01030099_m1
CCNB2Thermofisher scientificHs01084593_g1
CCNCThermofisher scientificHs01029304_m1
CCNE1Thermofisher scientificHs01026535_g1
CCNFThermofisher scientificHs00171049_m1
CCR9Thermofisher scientificHs01890924_s1
CD10.MMEThermofisher scientificHs00153510_m1
CD11aThermofisher scientificHs00158218_m1
CD11c.ITAXThermofisher scientificHs00174217_m1
CD123.IL3RAThermofisher scientificHs00608141_m1
CD133.PROM1Thermofisher scientificHs01009250_m1
CD151Thermofisher scientificHs00911635_g1
CD220.INSRThermofisher scientificHs00961554_m1
CD24.HSAThermofisher scientificHs03044178_g1
NCOR1Thermofisher scientificHs01094540_m1
CD26.DPP4Thermofisher scientificHs00175210_m1
CD274Thermofisher scientificHs01125301_m1
CD276Thermofisher scientificHs00987207_m1
CD32.FCGR2BThermofisher scientificHs01634996_s1
CD33Thermofisher scientificHs01076281_m1
CD34Thermofisher scientificHs00990732_m1
CD344.FZD4Thermofisher scientificHs00201853_m1
CD352.SLAMF6Thermofisher scientificHs01559920_m1
CD38Thermofisher scientificHs01120071_m1
CD4Thermofisher scientificHs01058407_m1
CD41.ITGA2BThermofisher scientificHs01116228_m1
CD49f.ITGA6Thermofisher scientificHs01041011_m1
CD56.NCAM1Thermofisher scientificHs00941830_m1
CD9Thermofisher scientificHs00233521_m1
CD97Thermofisher scientificHs00173542_m1
CD99Thermofisher scientificHs00908458_m1
CDK6Thermofisher scientificHs01026371_m1
CDKN1AThermofisher scientificHs00355782_m1
CDKN1BThermofisher scientificHs01597588_m1
CDKN1CThermofisher scientificHs00175938_m1
CEBPaThermofisher scientificHs00269972_s1
CSF1rThermofisher scientificHs00911250_m1
CSF2RAThermofisher scientificHs00531296_g1
CSF3RAThermofisher scientificHs01114427_m1
E2A.TCF3Thermofisher scientificHs00413032_m1
EBF1Thermofisher scientificHs01092694_m1
ENGThermofisher scientificHs00923996_m1
EPORThermofisher scientificHs00959427_m1
ERGThermofisher scientificHs01554629_m1
FLI1Thermofisher scientificHs00956711_m1
FLT3Thermofisher scientificHs00174690_m1
FOXO1Thermofisher scientificHs01054576_m1
GAPDHThermofisher scientificHs02758991_g1
GATA1Thermofisher scientificHs00231112_m1
GATA2Thermofisher scientificHs00231119_m1
GATA3Thermofisher scientificHs00231122_m1
GFI1Thermofisher scientificHs00382207_m1
HES1Thermofisher scientificHs01118947_g1
HLFThermofisher scientificHs00171406_m1
HMGA2Thermofisher scientificHs00171569_m1
HOXA5Thermofisher scientificHs00430330_m1
HOXB4Thermofisher scientificHs00256884_m1
ID2Thermofisher scientificHs04187239_m1
IGF2BP1Thermofisher scientificHs00198023_m1
IGF2BP2Thermofisher scientificHs01118009_m1
IKZF1Thermofisher scientificHs00172991_m1
IL1RAPThermofisher scientificHs00895050_m1
IL2RGThermofisher scientificHs00953624_m1
IRF8Thermofisher scientificHs00175238_m1
ITGB7Thermofisher scientificHs01565750_m1
KITThermofisher scientificHs00174029_m1
Lin28BThermofisher scientificHs01013729_m1
LMO2Thermofisher scientificHs00153473_m1
LYL1Thermofisher scientificHs01089802_g1
Meis1Thermofisher scientificHs01017441_m1
mKi67Thermofisher scientificHs01032443_m1
MPLThermofisher scientificHs00180489_m1
MPOThermofisher scientificHs00924296_m1
NFIBThermofisher scientificHs01029175_m1
Notch1Thermofisher scientificHs01062011_m1
PtenThermofisher scientificHs02621230_s1
RAG2Thermofisher scientificHs01851142_s1
RPS18Thermofisher scientificHs01375212_g1
RUNX1Thermofisher scientificHs00231079_m1
Shisa2Thermofisher scientificHs01590823_m1
Spi1Thermofisher scientificHs02786711_m1
Sterile.IgHThermofisher scientificHs00378435_m1
TAL1Thermofisher scientificHs01097987_m1
THY1Thermofisher scientificHs00264235_s1
Tim.3.HAVCR2Thermofisher scientificHs00958618_m1
VWFThermofisher scientificHs00169795_m1

References

  1. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
  2. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  3. Ye, F., Huang, W., Guo, G. Studying hematopoiesis using single-cell technologies. Journal of Hematology & Oncology. 10, 27 (2017).
  4. Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).
  5. Wills, Q. F., et al. Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments. Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).
  6. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  7. Wilson, N. K., Nicola, K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  8. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
  9. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of Single RNA Transcripts in Situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  10. Kalisky, T., et al. A brief review of single-cell transcriptomic technologies. Briefings in Functional Genomics. , elx019 (2017).
  11. Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nature Reviews Genetics. 16, 57 (2014).
  12. Bengtsson, M., Ståhlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).
  13. Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., Ståhlberg, A. Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise. BMC Molecular Biology. 9 (1), 63 (2008).
  14. Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, 1096 (2013).
  15. Tung, P. -. Y., et al. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies. Scientific Reports. 7, 39921 (2017).
  16. Teles, J., Enver, T., Pina, C. Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis. Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).
  17. Hayashi, T., et al. Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its "index sorting" function for stem cell research. Development, Growth, & Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).
  18. Lang, S., et al. SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data. BMC Bioinformatics. 16 (1), 320 (2015).
  19. de Klein, A., et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).
  20. . indexed-sorting Available from: https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting (2016)
  21. Warfvinge, R., et al. Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML. Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).
  22. Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
  23. Breton, G., et al. Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs. The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).
  24. Alberti-Servera, L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors. The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).
  25. Giustacchini, A., et al. Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia. Nature Medicine. 23, 692 (2017).
  26. Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow. Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).
  27. Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
  28. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved