Uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o Molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de Progenitor

Resumo

Granel gene expressão medições nuvem célula individual diferenças nas populações de células heterogêneas. Aqui, descrevemos um protocolo para análise de expressão do gene como unicelular e índice classificação por Florescence ativado celular classificação (FACS) pode ser combinado para delinear a heterogeneidade e immunophenotypically caracterizam populações de células molecularmente distinta.

Resumo

Caracterização imunofenotípica e análise molecular tem sido muito utilizados para delinear a heterogeneidade e definir populações de células distintas. FACS é inerentemente um ensaio de célula única, no entanto antes da análise molecular, as células de destino são isoladas frequentemente prospectivamente a granel, perdendo assim a resolução de célula única. Análise da expressão de gene de célula única fornece um meio para compreender diferenças moleculares entre células individuais em populações de células heterogêneas. Na análise de células em massa uma sobre-representação de um tipo de células distintas resulta em preconceitos e oclusões de sinais de células raras com importância biológica. Utilizando o FACS índice classificação acoplado a análise da expressão de gene de célula única, populações podem ser investigadas sem perda de resolução de célula única enquanto células com expressão de marcador de superfície de célula intermediária também são capturadas, permitindo a avaliação de a relevância da expressão do marcador de superfície contínua. Aqui, descrevemos uma abordagem que combina célula única transcrição reversa quantitativo PCR (RT-qPCR) e FACS índice classificação para caracterizar simultaneamente o molecular e imunofenotípica heterogeneidade dentro de populações de células.

Em contraste com os métodos de sequenciamento de RNA célula única, o uso de qPCR com amplificação de destino específico permite para medições robustas de baixa abundância transcrições com menos interrupções, enquanto isso não é confundido por questões relacionadas às variações de célula para célula em leitura profundidade. Além disso, por diretamente esse método de buffer de ordenação de índice único-células em Lise, permite para a síntese do cDNA e pré-amplificação alvo específico para ser executada em uma única etapa, bem como quanto à correlação de assinaturas moleculares posteriormente derivadas com superfície celular expressão do marcador. A abordagem descrita foi desenvolvida para investigar single-células hematopoiéticas, mas também têm sido utilizados com sucesso em outros tipos de células.

Em conclusão, a abordagem aqui descrita permite medição sensível da expressão de RNAm para um painel de genes pré-selecionados com a possibilidade para desenvolver protocolos para isolamento prospectivo subsequente de subpopulações molecularmente distintas.

Introdução

Cada célula individual do sangue é acreditada para residir em uma hierarquia de celular, onde as células-tronco formam o ápice em cima de uma série de progenitores intermediários cada vez mais comprometidos que eventualmente terminal se diferenciar em células efetoras final carregando específicas funções biológicas¹. Muito do conhecimento sobre como os sistemas de células-tronco são organizados foi gerado no sistema hematopoiético, em grande parte devido a capacidade de isolar prospectivamente distintas populações hematopoiéticas altamente enriquecidas para células-tronco ou progenitoras vários² , classificando o FACS. Isto permitiu para muitas dessas populações a serem analisados funcionalmente ou molecularmente, predominantemente através da expressão do gene de perfil^3,4. No entanto quando analisando a expressão gênica das diferenças individuais de em massa das populações entre as células são em média para fora e perdeu⁵. Assim, incapacidade para detectar variações de célula para célula dentro frações heterogêneas célula pode confundir nosso entendimento de processos biológicos críticos se pequenos subconjuntos de células esclarecem a função biológica inferida do que a população^{6, 7}. Por outro lado, investigação das assinaturas de expressão do gene na célula única resolução oferecem uma possibilidade de delinear a heterogeneidade e contornar a sombra influências de sobre-representados subconjuntos de células⁸.

Até à data têm sido desenvolvidos muitos protocolos para análise de expressão do gene de célula única; com cada abordagem tendo suas próprias limitações. O método mais antigo foi RNA fluorescente em situ hibridação (RNA-FISH), que mede um número limitado de transcrições de cada vez, mas é o único que permite a investigação de RNA localização^9,11. Início métodos usando PCR e qPCR para detectar que um único ou poucos transcrições foram também desenvolvidos¹². No entanto, estas ultimamente foram substituídas por métodos baseados em microfluídica que podem analisar simultaneamente a expressão de centenas de transcrições por célula em centenas de células através da qPCR e assim permitir para o uso de análise dimensional elevada heterogeneidade Pre-determinado gene painéis^10,13. Recentemente tecnologias baseadas em sequenciamento de RNA tem tornar-se amplamente utilizadas para análise de célula única, como estes teoricamente podem medir a transcriptoma inteira de uma célula e, assim, adicionar uma dimensão exploratória a heterogeneidade análise^{10, 14}. análise de qPCR multiplexados e sequenciamento de RNA de célula única têm características diferentes, assim, a justificativa para usar um dos métodos depende a pergunta, bem como o número de células na população-alvo. A alta produtividade e baixo custo por célula juntamente com características imparciais, exploratórias de sequenciamento de RNA de célula única são desejáveis quando célula desconhecida ou grandes populações são investigadas. No entanto, a sequenciação do ARN de célula única também é inclinada para sequenciamento transcrições abundantes altas mais frequentemente enquanto transcrições com baixa abundância são propensas a desistentes. Isso pode levar a dados consideravelmente complexos que coloca exigências de alta na análise de bioinformatic revelar importantes sinais moleculares que são muitas vezes sutis ou ocultas em ruído técnica¹⁵. Assim, para tecidos bem caracterizados, qPCR célula única análise usando pre-determinada painéis cartilha selecionados para funcionalmente importantes genes ou marcadores moleculares podem servir como uma abordagem sensível, simples para determinar a heterogeneidade de um população. No entanto, deve notar-se que em relação à célula única RNA-seq, o custo de cada célula é geralmente maior para métodos de célula única qPCR. Aqui, descrevemos uma abordagem que combina monocelulares RT-qPCR (modificado de J. Teles et al ¹⁶), índice de FACS classificação¹⁷ e bioinformática análise¹⁸ para simultaneamente caracterizam a heterogeneidade molecular e imunofenotípica dentro das populações.

Nesta abordagem, a população de células de interesse está manchada, e single-células são classificadas por FACS diretamente em tampão de Lise em placas de PCR de 96 poços. Simultaneamente, os níveis de expressão de um conjunto adicional de marcadores de superfície celular são registrados para cada célula única durante FACS-classificação, um método que é conhecido como índice de classificação. O material de lisados celulares é posteriormente amplificado e a expressão do gene de um conjunto selecionado de genes analisados com RT-qPCR, usando uma plataforma microfluidic. Esta estratégia permite a análise molecular da caracterização de célula única, bem como simultânea classificada de expressão do cada célula marcador da pilha-superfície. Mapeando diretamente molecularmente distintos subconjuntos de células para a expressão dos marcadores classificadas de indexado, as subpopulações podem ser vinculadas a um imunofenótipo específico que pode ser usado para seu isolamento em perspectiva. O método é descrito passo a passo na Figura 1. Um painel pre-determinado gene mais contribui para uma maior resolução da expressão do gene alvo, desde que contorna a medição dos genes abundantes irrelevantes que caso contrário pode ocluir os sinais de expressão do gene sutil. Além disso, a amplificação de destino específico, transcrição reversa de um passo e amplificação permite a medição robusta de baixas transcrições expressadas, como factores de transcrição ou RNAs não-poli-adenylated. Importante, qPCR métodos permitem a medição de mRNA de proteínas da fusão, que são importantes na investigação de determinadas doenças malignas,¹⁹. Finalmente, o foco número dos genes investigados, baixas taxas de abandono, e limitado as diferenças técnicas entre as células fazem este método facilmente analisado em comparação com métodos dimensionais mais elevados, como célula única RNA-Seq Seguindo o protocolo, pode ser realizada uma experiência inteira, de classificação células para resultados analisados, no prazo de três dias, tornando este um método simples e rápido para análise de expressão do gene de célula única sensível, elevado-throughput.

Protocolo

1. preparação das placas de Lise

1. Usando um banco livre de RNA/DNA, prepare o suficiente do lysis para 96 poços, com 10% extra, misturando 390 água livre da nuclease µ l, 17 µ l de 10% NP-40, 2,8 µ l 10 mM dNTP, 10 µ l 0,1 M DTT e inibidor de RNAse 5,3 µ l (ver Tabela de materiais). Vórtice e spin-down.
2. Distribuir 4 µ l de tampão de Lise para cada poço de uma placa PCR bem 96 e selar as placas com película adesiva. Spin para baixo os tubos para coletar o líquido na parte inferior das placas. Mantém as placas no gelo até a célula classificação (máximo 24 h).

2. preparação de células para triagem de célula

1. Descongele o número adequado de células (aqui, CD34 enriquecido tronco hematopoiético e células progenitoras) para o experimento. 1 x 10⁶ células são apropriadas para aproximadamente três placas de 96 poços de single-células com controles de classificação.
2. Transferência de células descongeladas para um tubo cônico de 15 mL e adicionar 1 mL FBS cada 30 s até um volume total de 8 mL é atingido. Girar as células em uma centrífuga a 350 x g durante 10 minutos a 4 ° C e remover o sobrenadante.
3. Ressuspender as células em 8 mL de tampão de coloração (PBS com 2% FBS) e centrifugar a 350 x g durante 10 minutos a 4 ° C e remover o sobrenadante.
4. Os eritrócitos de coloração, 200 µ l de buffer e remover células para manchas de controle.
5. Fazer fluorescência menos um controles (FMO) para cada fluoróforo, manchando uma fração das células em 50 µ l de tampão de coloração. Neste exemplo, 6 tubos de microcentrifuga com 20.000 células são usados como FMOSs. Observe que o número de células deve ser ajustado dependendo da população investigada. Adicione todos os anticorpos na mesma concentração como a mancha de amostra, com exceção de um para cada tubo.
6. Fazer manchas única para cada fluoróforo manchando uma fração de células no buffer de 50 µ l de cada fluoróforo usado. Neste exemplo são utilizados 6 tubos microcentrifuga com 20.000 células. Observe que o destino de cada anticorpo precisa ser expresso pelas células usadas para controles. Adicione cada anticorpo na mesma concentração como a mancha de amostra em tubos individuais. Além disso, manter 20.000 células imaculadas em 50 µ l como um controle imaculado.
7. Para a amostra de célula, acrescente os anticorpos em sua concentração adequada. Usados aqui são CD34-FITC numa concentração de 1/100, 1/50, CD38-APC CD90-PE 1/10, 1/50 CD45RA-bv421, CD49F-PECy7 1/50 e Mix de linhagem: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, 1/50 de CD56-PECy5, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, e CD235a-PECy5 1/1000.
8. Incube as células com anticorpos por 30 min no gelo no escuro.
9. Lavam-se células com 3 mL de tampão de coloração. Centrifugar as células a 350 x g durante 10 minutos a 4 ° C e remover o sobrenadante.
10. Ressuspender as células e repita o passo 2.9.
11. Resuspenda amostra em 500 µ l e FMO em 100 µ l de tampão com células 7AAD e filtro de 1/100 de coloração através de um filtro de 50 µm para obter uma suspensão de célula única.

3. célula de triagem

1. Certifique-se de que a máquina de FACS é definida corretamente com atraso de entrega e instalação do citômetro e rastreamento (CST) que recentemente foram executados de acordo com as instruções do fabricante, para garantir que as células adequadas são classificadas. Para células hematopoiéticas, é recomendado o uso do mícron 85 bocal e máxima velocidade de 4, enquanto a taxa de evento ideal é entre 800 e 2000 eventos/s.
2. Corrigir para sobreposição espectral, realizando a compensação de fluorescência e conjunto de portões de acordo com FMO controles ou controles internos negativos.
3. Execute a reanálise da população alvo, classificando a pelo menos 100 células de destino em um novo tubo de microcentrifuga com 100 µ l de tampão de mancha. FACS analisar as células classificadas pela gravação da amostra classificada e certifique-se de que eles acabam na porta do tipo.
4. Instalação placa de célula simples classificação por centrar a queda no poço A1 em um prato bem 96. Quando está centrado, tipo 50 – 100 6 µm de partículas em todos os poços em torno da borda de um prato vazio de 96 bem para garantir que todos os poços terá uma cela no centro de cada poço.
5. Se possível, um controle adicional para garantir que as células viáveis são classificadas pode ser adicionado, classificando single-células para crescimento em vitro . As células hematopoiéticas podem ser cultivadas em placas bem de fundo U 96 em 100 µ l SFEM com estreptomicina de penicilina de 1%, 100 ng/mL, FLT3L, TPO e SCF. Analise cada poço após 3 dias na cultura para colônias de célula, usando um microscópio.
6. Remova a película adesiva de placas. Tipo uma única célula de interesse (aqui Lin-CD34 + CD38-células) em 92 de 96 poços, ativar índice-classificação-nos FACS classificação software para salvar o perfil imunofenotípica para outros marcadores de interesse (aqui CD45RA, CD49f e CD90) para cada célula única.
7. Classificar dois poços com células de 10 e 20, respectivamente para controles de linearidade na amplificação por PCR. Poços de H1 e H2 são usados geralmente.
8. Manter dois poços sem quaisquer células como não-modelo controla, geralmente poços H3 e H4.
9. Selar as placas com película adesiva e girar as placas a 300 x g por 1 min antes snap congelando em gelo seco.
10. Armazenar as placas congeladas a-80 ° C.
    Nota: Ponto de parada segura. Classificada e lisadas células podem ser mantidas a-80 ° C para armazenamento a longo prazo.

4. inverter a transcrição e a amplificação de destino específico

1. Prepare a mistura de cartilha para todos os destinos do gene 96 adicionando 2 µ l de cada par de primer, incluindo limpeza gene primers e primers para cravado no controle do RNA, em um 1,5 mL tubo livre de RNAse num banco livre de RNA/DNA. Se usar menos de 96 cartilhas, adicione uma quantidade equivalente de água livre de nuclease para os primers faltando. As primeiras demão são ordenadas separadamente para combinar com o painel do gene desejado.
2. Fazer a transcrição reversa e amplificação de destino específico mistura adicionando 632.5 µ l 2 x a mistura de reação, 101.2 µ l Taq/SuperscriptIII, mistura de Primer 151.8 µ l e 0,7 µ l cravado no controle do RNA. Pré-forma esta etapa em um banco de DNA gratuito. Mix por num Vortex e spin para baixo para coletar o líquido no fundo do tubo. Manter-se no gelo até adição à amostra.
3. Faça transcrição reversa-não mistura de controle por quatro poços misturando 27,5 µ l da mistura de reação de 2x, 1.76 µ l da enzima Taq, 6.6 µ l de mistura da primeira demão e 2.64 µ l de água livre de nuclease. Spike no controle do RNA. Execute esta etapa em um banco de DNA gratuito. Vórtice e spin para baixo para coletar o líquido na parte inferior do tubo e manter em gelo até adição de amostra.
4. Descongele o lisado placas no gelo. Adicione 8,75 µ l da transcrição reversa previamente preparada e mistura de amplificação de destino específico para 92 poços, incluindo os controles de linearidade e não-modelo. Adicione 8,75 µ l do mix de controle não-reverso transcrição nos quatro poços restantes. Selar as placas com película adesiva e rotação para baixo para coletar líquido na parte inferior das placas.
5. Pré-forma transcrição reversa e amplificação de destino específico, executando a placa em uma máquina PCR de acordo com o programa do pré-amplificador; Passo 01:50 ° C por 60 min, passo 2: 95 ° C por 2 min, passo 3: 95 ° C por 15 s, passo 4: 60 ° C por 4 min, repetir os passos 3 – 4 24 vezes e finalmente passo 5: 8 ° C para sempre.
6. Depois de PCR está completo, manter a placa a 8 ° C para armazenamento de curto prazo e -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
   Nota: Ponto de parada segura. Material amplificado pode ser mantido a 8 ° C para armazenamento de curto prazo e a-20 ° C para armazenamento a longo prazo.

5. preparação da amostra e placas de ensaio para análise da expressão de Gene de Microfluidic Multiplex

1. Preparar o ensaio carregando a placa por pipetagem 3 reagente de carregamento do ensaio µ l de cada poço de uma placa bem 96. Adicione 3 µ l de cada primer para poços individuais no ensaio de placa de carregamento.
2. Placa com película adesiva e spin para baixo para coletar líquido na parte inferior das placas do selo.
3. Prepare a placa de diluição por pipetagem µ l 8 de nuclease água livre em todos os poços de uma placa bem 96. Adicione 2 µ l de amostra amplificada para a placa de diluição, tornando uma diluição final de 1:5.
4. Placa com película adesiva do selo, misture por placa num Vortex para 10 s e finalmente girar para baixo para coletar líquido na parte inferior das placas.
5. Prepare a mistura de carregamento da amostra misturando cuidadosamente 352 µ l do mix mestre com 35,2 µ l de reagente de carregamento de amostra. Prepare a placa de carregamento da amostra por alíquotas 3.3 µ l de mistura para cada poço de uma placa bem 96 a carregar.
6. Adicione 2,7 µ l da amostra diluída em cada poço da amostra carregando a placa.
7. Placa com película adesiva e spin para baixo para coletar líquido na parte inferior das placas do selo.

6. carregamento de Microfluidic Chip

1. Tire um novo chip de microfluidic 96 x 96. Prepare entradas, picando-os com uma seringa com tampa em ter a certeza de que eles podem ser movidos.
2. Remova as bolhas de seringas. Adicione o volume completo de seringas para cada válvula enquanto o chip de inclinação de 45 graus e pressionando para baixo a válvula. O primeiro chip com o controlador da IFC.
3. Carrega a cada entrada de ensaio com 4,25 µ l de cada um dos poços no ensaio de placa de carregamento. Evite bolhas. Se as bolhas aparecem no poço, removê-los com a ponta da pipeta.
4. Continuar a carregar a cada entrada de amostra com 4,25 µ l de cada um dos poços na amostra carregando a placa, evitar bolhas e se aparecem bolhas, remova-os com a ponta da pipeta.
5. Carregar o chip com o controlador da IFC.
6. Verifique se o chip parece mesmo e que todas as câmaras foram carregadas. Remova o pó da superfície do chip por tocá-lo com fita adesiva. Execute o chip na plataforma de expressão do gene microfluidic multiplex.

7. executando o Chip na plataforma de expressão do Gene de Microfluidic Multiplex

1. Depois de carregar o chip para a plataforma de expressão do gene microfluidic multiplex, o nome da amostra.
2. Definir ROX como corante passiva. Conjunto único teste e FAM-MGB como fluorescência. Use padrão 96x96 v2 como protocolo. Inicie-executar.
3. Chip de remover quando executar é completa.

8. preliminar análise da gerência de Chip

1. Carregar dados no software de análise de PCR em tempo real.
2. Carregar o gene nomes e nomes de células colando layouts de célula e o gene de um arquivo delimitado por tabulação.
3. Abra o Visualizador de imagens e selecione ROX como corante. Verifique se todos os poços tem tintura passiva ROX.
4. Investiga se todas as parcelas de amplificação olhem okey, com uma curva suave de amplificação com sem espinhos (semelhantes a Figura 3E).
5. Certifique-se de que todos os single-células têm expressão de cravado no controle do RNA para certificar-se de que todos foram carregados corretamente.
6. Certifique-se de que todas as células têm expressão de gene das tarefas domésticas e, portanto, foram classificadas corretamente.
7. Certifique-se que 10 a 20 controles de linearidade de célula tem aproximadamente 1 CT diferença para validar a amplificação linear.
8. Verifique se há expressão nas amostras controle noRT. Se a expressão for detectado no noRT considere mudar sondas para pontas de prova que não detecta o DNA genômico para execuções subsequentes.
9. Exporte dados em ficheiros csv para posterior análise.

9. célula única análise usando SCExV

Nota: Um filme introdutório é presente²⁰ para introduzir a ferramenta. Aqui, uma recomendação curta de como fazer a análise usando os controles introduzidos no protocolo é apresentada.

1. Ligue para o SCexV site²⁰.
2. Upload de arquivos CSV exportados.
3. Escolheu o controle cravado no RNA como controle positivo. Remova qualquer célula que tem um controle de RNA CT acima de 25. Normalize os dados de expressão mediana do controle do RNA.
4. Clique em "aqui -> Analyze". Remova noRT, notemplate, controles de célula de 10 e 20 na opção excluir células.
5. Aglomerado de células com a abordagem de clusterização de escolha com o número esperado de clusters. Valores de exportação analisado.

10. classificação de índice de análise

1. Abra o software de análise de FACS e carregar as amostras indexadas.
2. Abra o editor de scripts e execute o script disponível de Quinn J. et al . ²¹
3. Agora que o software de análise de FACS deveria ter feito um portão para cada uma das células simples, abra o editor de layout e cor das células de acordo com o agrupamento de SCexV (disponível no arquivo chamado "Sample_complete_Data.xls").

Resultados

O protocolo descrito é rápida, facilmente realizada e altamente confiável. Uma visão geral sobre a montagem experimental está apresentada na Figura 1. O protocolo inteiro, desde a triagem de single-células, a amplificação de destino específico, medições de expressão de gene e análise preliminar pode ser realizado em três dias. Um exemplo dos resultados analisados sob a forma de um mapa de calor que representa dados analisados preliminares da an?...

Discussão

Nos últimos anos, a análise da expressão de gene de célula única tornou-se uma adição valiosa para definir a heterogeneidade de várias populações de nível²³. O advento das tecnologias de sequenciamento de RNA teoricamente fornece a possibilidade de medir a transcriptoma inteira de uma célula, no entanto, esses métodos são complicados por variações em profundidades de sequenciamento de célula para célula e abandono. Célula única qPCR oferece uma análise sensível e robusta da e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD14 PECY5	eBioscience	15-0149-42	Clone: 61D3
CD16 PECY5	Biolegend	302010	Clone: 3G8
CD56 PECY5	Biolegend	304608	Clone: MEM-188
CD19 PECY5	Biolegend	302210	Clone: HIB19
CD2 PECY5	Biolegend	300210	Clone: RPA-2.10
CD3 PECY5	Biolegend	300310	Clone: HIT3a
CD123 PECY5	Biolegend	306008	Clone: 6H6
CD235A PECY5	BD Pharma	559944	Clone GAR2
CD34 FITC	Biolegend	343604	Clone: 561
CD38 APC	Biolegend	303510	Clone: Hit2
CD90 PE	Biolegend	328110	Clone: 5E10
CD45RA BV421	BD bioscience	560362	Clone: HI100
CD49f Pecy7	eBioscience	25-0495-82	Clone: eBioGOH3
FBS	HyClone	SV30160.3
PBS	HyClone	SH30028.02
96-well u-bottom Plate	VWR	10861-564
SFEM	Stem cell technologies	9650
Penicillin streptomycin	HyClone	SV30010
TPO	Peprotech	300-18
SCF	Peprotech	300-07
FLT3L	Peprotech	300-19
Falcon Tube 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Eppendorph tube	Sarstedt	72.690.001
CST beads	BD	642412
Accudrop Beads	BD	345249	6 µm particles
Adhesive film Clear	Thermo scientific	AB-1170
Adhesive film Foil	Thermo scientific	AB-0626
96 well PCR plate	Axygen	PCR-96M2-HS-C
PCR 1.5 mL tube	Axygen	MCT-150-L-C
T100 PCR cycler	BioRad	186-1096
10% NP40	Thermo scientific	85124
10 mM dNTP	Takara	4030
0.1 M DTT	Invitrogen	P2325
RNAsout	Invitrogen	10777-019	RNAse inhibitor
CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen	11753-100
Neuclease free water	Invitrogen	11753-100	from CellsDirect kit
2x Reaction Mix	Invitrogen	11753-100	from CellsDirect kit
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix	Invitrogen	11753-100	from CellsDirect kit
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966026
TaqMan Cells-to-CT Control Kit	Invitrogen	4386995
Xeno RNA Control	Invitrogen	4386995	From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay	Invitrogen	4386995	From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs	Fluidigm	BMK-M10-96.96
2x Assay Loading Reagent	Fluidigm		From 96.96 Sample/Loading Kit
20x GE Sample Loading Reagent	Fluidigm		From 96.96 Sample/Loading Kit
Control line fluid	Fluidigm		From 96.96 Sample/Loading Kit
TaqMan Gene Expression Master Mix	Applied Biosystems	4369016
BioMark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD
96.96 Dynamic Array IFC	Fluidigm	BMK-M10-96.96GT
Excel	Microsoft	Microsoft
FlowJo V10	TreeStar	TreeStar
Fluidigm real time PCR analysis	Fluidigm	Fluidigm
CD179a.VPREB1	Thermofisher scientific	Hs00356766_g1
ACE	Thermofisher scientific	Hs00174179_m1
AHR	Thermofisher scientific	Hs00169233_m1
BCR_ABL.52	Thermofisher scientific	Hs03043652_ft
BCR_ABL41	Thermofisher scientific	Hs03024541_ft
BMI1	Thermofisher scientific	Hs00995536_m1
CCNA2	Thermofisher scientific	Hs00996788_m1
CCNB1	Thermofisher scientific	Hs01030099_m1
CCNB2	Thermofisher scientific	Hs01084593_g1
CCNC	Thermofisher scientific	Hs01029304_m1
CCNE1	Thermofisher scientific	Hs01026535_g1
CCNF	Thermofisher scientific	Hs00171049_m1
CCR9	Thermofisher scientific	Hs01890924_s1
CD10.MME	Thermofisher scientific	Hs00153510_m1
CD11a	Thermofisher scientific	Hs00158218_m1
CD11c.ITAX	Thermofisher scientific	Hs00174217_m1
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CD151	Thermofisher scientific	Hs00911635_g1
CD220.INSR	Thermofisher scientific	Hs00961554_m1
CD24.HSA	Thermofisher scientific	Hs03044178_g1
NCOR1	Thermofisher scientific	Hs01094540_m1
CD26.DPP4	Thermofisher scientific	Hs00175210_m1
CD274	Thermofisher scientific	Hs01125301_m1
CD276	Thermofisher scientific	Hs00987207_m1
CD32.FCGR2B	Thermofisher scientific	Hs01634996_s1
CD33	Thermofisher scientific	Hs01076281_m1
CD34	Thermofisher scientific	Hs00990732_m1
CD344.FZD4	Thermofisher scientific	Hs00201853_m1
CD352.SLAMF6	Thermofisher scientific	Hs01559920_m1
CD38	Thermofisher scientific	Hs01120071_m1
CD4	Thermofisher scientific	Hs01058407_m1
CD41.ITGA2B	Thermofisher scientific	Hs01116228_m1
CD49f.ITGA6	Thermofisher scientific	Hs01041011_m1
CD56.NCAM1	Thermofisher scientific	Hs00941830_m1
CD9	Thermofisher scientific	Hs00233521_m1
CD97	Thermofisher scientific	Hs00173542_m1
CD99	Thermofisher scientific	Hs00908458_m1
CDK6	Thermofisher scientific	Hs01026371_m1
CDKN1A	Thermofisher scientific	Hs00355782_m1
CDKN1B	Thermofisher scientific	Hs01597588_m1
CDKN1C	Thermofisher scientific	Hs00175938_m1
CEBPa	Thermofisher scientific	Hs00269972_s1
CSF1r	Thermofisher scientific	Hs00911250_m1
CSF2RA	Thermofisher scientific	Hs00531296_g1
CSF3RA	Thermofisher scientific	Hs01114427_m1
E2A.TCF3	Thermofisher scientific	Hs00413032_m1
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