Une approche combinatoire de cellule unique pour caractériser la moléculaire et immunophénotypiques hétérogénéité des souches humaines et des Populations de l’ancêtre

Résumé

En vrac gene expression mesures nuage cellule individuelle différences dans les populations de cellules hétérogènes. Nous décrivons ici un protocole pour analyse de l’expression génique et l’index Comment unicellulaires Tri par Florescence activé cellule Tri (FACS) peut être combiné pour délimiter l’hétérogénéité et immunophenotypically caractériser les populations cellulaires moléculairement distinctes.

Résumé

Immunophénotypiques caractérisation et analyse moléculaire ont longtemps servis à délimiter l’hétérogénéité et de définir les populations cellulaires distincts. FACS est en soi un dosage unicellulaires, toutefois avant l’analyse moléculaire, les cellules cibles sont souvent prospectivement isolées en vrac, perdant ainsi la résolution unicellulaire. Analyse de l’expression génique de la cellule unique fournit un moyen de comprendre les différences moléculaires entre les cellules individuelles dans les populations de cellules hétérogènes. Dans l’analyse de cellules en vrac une surreprésentation d’un type de cellules distinctes donne les préjugés et les occlusions des signaux des cellules rares avec importance biologique. En utilisant FACS indice tri couplé à l’analyse de l’expression génique de la cellule unique, les populations peuvent être étudiées sans la perte de résolution unicellulaire, tandis que les cellules avec l’expression de marqueurs de surface de cellules intermédiaires sont également capturés, permettant l’évaluation de la pertinence de l’expression du marqueur de surface continue. Nous décrivons ici une approche qui combine monocellulaires transcription inverse quantitative PCR (RT-qPCR) et FACS index tri afin de caractériser simultanément le moléculaire et immunophénotypiques hétérogénéité au sein de populations de cellules.

Contrairement aux méthodes de séquençage de l’ARN unicellulaire, l’utilisation de qPCR avec l’amplification de la cible spécifique permet des mesures robustes des transcriptions de faible abondance avec moins d’abandons, alors qu’il n’est pas confondue par les questions liées aux variations de cellule-à lire profondeur. En outre, par directement tri indice unique-cellules en lysis buffer cette méthode, permet pour la synthèse de cDNA et préamplification cible spécifique à effectuer en une seule étape, aussi bien en ce qui concerne la corrélation des signatures moléculaires dérivés par la suite avec la surface de la cellule expression du marqueur. L’approche décrite a été développé pour enquêter sur le single-cellules hématopoïétiques, mais ont aussi été utilisées avec succès sur d’autres types de cellules.

En conclusion, l’approche décrite ci-après permet de mesurer sensible d’expression de l’ARNm pour un groupe de gènes présélectionnés avec la possibilité d’élaborer des protocoles d’isolement éventuels ultérieur de sous-populations moléculairement distinctes.

Introduction

Chaque cellule individuelle de sang est censé résider dans une hiérarchie cellulaire, où les cellules souches forment l’apex au sommet d’une série de plus en plus engagés progéniteurs intermédiaires qui différencient finalement en phase terminale dans les cellules effectrices final porteurs spécifiques fonctions biologiques¹. Une grande partie de la connaissance au sujet de comment sont organisés les systèmes de cellules souches a été générée dans le système hématopoïétique, principalement en raison de la capacité d’isoler prospectivement des populations distinctes de hématopoïétiques hautement enrichies pour les cellules souches ou cellules souches diverses² par un tri de FACS. Cela a permis à bon nombre de ces populations à analyser sur le plan fonctionnel ou moléculairement, principalement à travers l’expression de gènes^3,4. Toutefois lorsque analyser l’expression des gènes de la majeure partie des populations des différences individuelles entre les cellules sont en moyenne et perdu⁵. Ainsi, l’incapacité à détecter les variations de la cellule-cellule au sein des fractions cellulaires hétérogènes peut-être entraîner notre compréhension des processus biologiques critiques si petits sous-ensembles des cellules responsables de la fonction biologique inférée de cette population^{6, 7}. À l’inverse, enquête des signatures d’expression génique à cellule unique résolution offrent une possibilité de délimiter l’hétérogénéité et contourner les influences éclipsa surreprésentés sous-ensembles de cellules⁸.

À ce jour de nombreux protocoles pour l’analyse de l’expression génique de la cellule unique ont été développées ; avec chaque approche ayant ses propres réserves. La première méthode était RNA Fluorescent in situ hybridation (RNA-poisson), qui mesure un nombre limité de relevés de notes à la fois, mais est unique parce qu’elle permet pour enquête de RNA localization^9,11. Méthodes précoces à l’aide de la PCR et qPCR pour détecter qu'un seul ou quelques transcriptions ont été également mis au point¹². Cependant, ils ont dernièrement été remplacés par des méthodes axées sur la microfluidique qui peuvent analyser simultanément l’expression de centaines de transcriptions par cellule chez des centaines de cellules par l’intermédiaire de qPCR et ainsi permettre d’hétérogénéité de grande dimension à l’aide de l’analyse prédéterminé gène panneaux^10,13. Récemment technologies basées sur le séquençage de RNA ont devenu employé couramment pour analyse unicellulaires, puisque ceux-ci peuvent théoriquement mesurer le transcriptome entier d’une cellule et ainsi ajouter une dimension exploratoire à l’hétérogénéité analyse^{10, 14}. multiplexé qPCR analyse et le séquençage de RNA unicellulaires ont des caractéristiques différentes, la justification de l’utilisation de méthodes dépend donc de la question posée ainsi que le nombre de cellules dans la population cible. Le haut débit et à faible coût par cellule ainsi que des caractéristiques non biaisées, exploratoires du séquençage de RNA unicellulaires sont souhaitables lorsque cellule inconnue ou grandes populations ont été étudiées. Cependant, séquençage RNA unicellulaire est également biaisé en faveur de séquençage hautes transcriptions abondantes plus fréquemment tandis que les relevés de notes peu abondantes sont sujettes aux décrocheurs. Cela peut conduire à des données beaucoup complexes qui met haute-exigences sur l’analyse bioinformatique pour révéler les signaux moléculaires importants qui sont souvent subtiles ou masqués en bruit technique¹⁵. Ainsi, pour tissus bien caractérisés, monocellulaires qPCR analyse utilisant prédéterminé panneaux amorces sélectionnées pour fonctionnellement importants gènes ou marqueurs moléculaires peut servir d’une approche sensible, simple pour déterminer l’hétérogénéité d’un population. Toutefois, il est à noter que par rapport à cellule unique RNA-seq, le coût par cellule est généralement plus élevé pour les méthodes qPCR unicellulaires. Nous décrivons ici une approche qui combine single-cell RT-qPCR (modifié d’après J. Teles et al. ( ¹⁶), à l’index de FACS tri simultanément les¹⁷ et bioinformatique analyse¹⁸ afin de caractériser l’hétérogénéité moléculaire et immunophénotypiques au sein des populations.

Dans cette approche, la population de cellules d’intérêt est tachée et single-cellules sont triés par FACS directement dans le tampon de lyse en plaques PCR 96 puits. Simultanément, les niveaux d’expression d’un ensemble de marqueurs de surface cellulaire supplémentaires sont comptabilisés pour chaque cellule unique pendant FACS-tri, une méthode qui est appelée indice de tri. Le matériau à cellules lysées est amplifié par la suite et l’expression de gène d’un ensemble sélectionné de gènes analysés avec la RT-qPCR, utilisant une plate-forme microfluidique. Cette stratégie permet une analyse moléculaire de la caractérisation de cellule unique mais aussi simultanée triée d’expression de marqueurs de surface cellulaire de chaque cellule individuelle. En mappant directement des sous-ensembles moléculairement distinctes des cellules à l’expression des marqueurs triés indexées, les sous-populations peuvent être liées à une immunophenotype spécifique qui peut être utilisé pour leur isolement éventuels. La méthode est décrite étape par étape dans la Figure 1. Outre une Comité pré-déterminé gène contribue à une résolution plus élevée de l’expression du gène ciblé, car il contourne la mesure de non pertinents gènes abondantes qui peuvent autrement occlure des signaux d’expression génique subtile. De plus, l’amplification de la cible spécifique, transcription inverse une étape et amplification permet de mesurer robuste de faibles transcriptions exprimées, comme des facteurs de transcription ou non-poly-adenylated ARN. Ce qui est important, les méthodes de qPCR permettent pour la mesure des ARNm des protéines de fusion, qui sont importants dans les enquêtes sur certaines maladies malignes¹⁹. Enfin, le nombre ciblé des gènes étudiés, faibles taux d’abandon, et limité les différences techniques entre les cellules font cette méthode facilement analysée par rapport aux méthodes dimensionnelles plus élevées, comme unicellulaires RNA-Seq. En suivant le protocole, une expérience entière peut être effectuée, du tri des cellules aux résultats analysés, dans les trois jours, ce qui en fait une méthode simple et rapide pour l’analyse d’expression génique de cellules individuelles sensibles et à haut débit.

Protocole

1. préparation des plaques de lyse

1. À l’aide d’un banc libre ARN/ADN, préparer suffisamment tampon de lyse à 96 puits, avec 10 % de bonus, en mélangeant l’eau libre nucléase µL 390, 17 µL de 10 % NP-40, 2,8 µL 10 mM dNTP, 10 µL 0,1 M DTT et inhibiteur de RNAse 5,3 µL (voir Table des matières). Vortex et la centrifuger.
2. Distribuer 4 µL de tampon de lyse dans chaque puits d’une plaque de PCR 96 puits et les plaques avec du film adhésif d’étanchéité. Tournez en bas tubes pour recueillir le liquide au fond des assiettes. Conservez les plaques sur la glace jusqu'à cellule Tri (maximum 24h).

2. préparation des cellules pour le tri des cellules

1. Décongeler le nombre approprié de cellules (ici, CD34 enrichi souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices) pour l’expérience. 1 x 10⁶ cellules ne conviennent pas pour le tri environ trois plaques à 96 puits de single-cellules avec des contrôles.
2. Transfert de cellules décongelées dans un tube conique de 15 mL et ajouter 1 mL FBS toutes les 30 s jusqu'à ce que soit atteint un volume total de 8 mL. Tourner les cellules dans une centrifugeuse à 350 x g pendant 10 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
3. Remettre en suspension les cellules en 8 mL tampon de coloration (PBS contenant 2 % FBS) et centrifuger à 350 g pendant 10 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
4. Remettre les cellules en coloration de 200 µL tampon et éliminer les cellules pour les taches de contrôle.
5. Faire de Fluorescence moins une commande (OGP) à chaque fluorophore, par coloration une fraction des cellules dans 50 µL de tampon de coloration. Dans cet exemple, 6 tubes de microcentrifuge avec 20 000 cellules sont utilisées comme FMOSs. Notez que le nombre de cellules doit être ajusté selon les populations étudiées. Ajouter tous les anticorps à la même concentration que dans la coloration de l’échantillon sauf un dans chaque tube.
6. Faire des taches unique pour chaque fluorophore par coloration une fraction des cellules dans 50 µL de tampon pour chaque fluorophore utilisé. Dans cet exemple, 6 tubes de microcentrifuge avec 20 000 cellules sont utilisés. Notez que l’objectif pour chacun des anticorps doit être exprimé par les cellules utilisées pour les contrôles. Ajouter chaque anticorps à la même concentration que dans la coloration de l’échantillon dans des tubes individuels. En outre garder 20 000 cellules incolores dans 50 µL comme un contrôle non coloré.
7. Ajouter à l’échantillon cellulaire, anticorps à leur concentration appropriée. Utilisés ici sont CD34-FITC à une concentration de 1/100, 1/50, CD38-APC CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 et lignée Mix : CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, 1/50, CD16-PECy5 et CD235a-PECy5 1/1000.
8. Incuber les cellules avec des anticorps pendant 30 minutes sur la glace dans l’obscurité.
9. Laver les cellules avec 3 mL de tampon de coloration. Centrifuger à 350 x g pendant 10 min à 4 ° C, les cellules et éliminer le surnageant.
10. Remettre en suspension les cellules et répétez l’étape 2,9.
11. Resuspendre échantillon dans 500 µL et OGP dans 100 µL de tampon avec des cellules 7AAD et filtre de 1/100 de coloration à travers un filtre de 50 µm pour obtenir une suspension de cellules individuelles.

3. cellule Tri

1. Assurez-vous que la machine de FACS est réglée correctement avec retard de goutte et cytomètre installation et suivi (CST) qui ont récemment été exécutés conformément aux instructions du fabricant, pour s’assurer que les cellules appropriées sont triés. Pour les cellules hématopoïétiques, l’utilisation de la vitesse de 85 microns buse et maximum de 4 est recommandée, tandis que le taux d’événements optimale est entre 800 et 2000 événements/s.
2. Corriger de chevauchement spectrale par exécuter la compensation de fluorescence et définissez gates selon FMO contrôles ou contrôles négatifs internes.
3. Effectuer une nouvelle analyse de la population cible en triant au moins 100 cellules cibles dans un nouveau tube de microcentrifuge avec 100 µL de tampon de la tache. FACS analyser les cellules triées en enregistrant l’échantillon trié et s’assurer qu’ils se retrouvent dans la porte de la sorte.
4. Mise en place simple plaque cellulaire tri en centrant la chute dans le puits A1 dans une plaque 96 puits. Quand elle est centrée, trier les particules de 50 – 100 6 µm dans tous les puits sur le pourtour d’une assiette bien 96 vide pour s’assurer que tous les puits aura une cellule au centre de chaque puits.
5. Si possible, un contrôle supplémentaire pour s’assurer que les cellules viables sont triés peut être ajouté en triant les single-cellules in vitro la croissance. Cellules hématopoïétiques peuvent être cultivés en fond U 96 plaques puits dans 100 µl SFEM avec 1 % streptomycine de pénicilline, 100 ng/mL FLT3L, TPO et SCF. Analyser chaque puits après 3 jours de culture pour les colonies de cellules à l’aide d’un microscope.
6. Retirer pellicule adhésive de plaques. Trier une seule cellule d’intérêt (ICIS Lin-CD34 + CD38-cellules) en 92 sur les 96 puits, activer INDEX-tri dans les FACS tri logiciel pour sauvegarder le profil immunophénotypiques des autres marqueurs d’intérêt (ici CD45RA, CD49f et CD90) pour chaque cellule.
7. Trier les deux puits avec des cellules de 10 et 20 respectivement pour les contrôles de linéarité dans l’amplification par PCR. Puits H1 et H2 sont habituellement utilisés.
8. Garder deux puits sans n’importe quelle cellule comme modèle de non contrôle, généralement puits H3 et H4.
9. Sceller les plaques avec du film transparent adhésif et tourner les plaques à 300 x g pendant 1 min avant snap gel sur la glace sèche.
10. Stocker des plats congelés à-80 ° C.
    NOTE : Point d’arrêt sécurisé. Cellules triées et lysés peuvent être conservés à-80 ° C pour le stockage à long terme.

4. inverser la Transcription et l’Amplification de la cible spécifique

1. Préparer le mélange de l’apprêt pour toutes les cibles de gène 96 en ajoutant 2 µL de chaque paire d’amorces, y compris amorces pour contrôle dopés à ARN et amorces de gène de ménage dans un tube gratuit de RNAse sur un banc libre ARN/ADN de 1,5 mL. Si vous utilisez moins de 96 amorces, ajouter un volume équivalent d’eau libre nucléase pour les amorces manquants. Amorces sont classés séparément pour faire correspondre le panneau du gène désiré.
2. Faire la transcription inverse et amplification de cible spécifique mélanger en ajoutant 632,5 µL 2 x mélange réactionnel, 101,2 µL Taq/SuperscriptIII, 151,8 µL Amorce mix et 0.7 µL dopés dans control RNA. Préforme cette étape sur un banc libre de l’ADN. Mix de vortex et rotation vers le bas pour recueillir le liquide dans le fond du tube. Rester sur la glace jusqu'à addition à l’échantillon.
3. Marque non-reverse transcription contrôle mix pour quatre puits en mélangeant 27,5 µL de 2 x mélange réactionnel, 1,76 µL d’enzyme Taq, 6,6 µL du mélange de l’apprêt et 2,64 µL d’eau libre nucléase. Spike dans control RNA. Effectuez cette étape sur un banc libre de l’ADN. Vortex et rotation vers le bas pour recueillir le liquide dans le fond du tube et les garder sur la glace jusqu'à l’ajout d’échantillon.
4. Décongeler le lysats plaques sur la glace. Ajouter 8,75 µL de la transcriptase inverse préalablement préparée et cible spécifique amplification mix à 92 Herbert George wells, y compris les contrôles de linéarité et de non-modèle. Ajouter 8,75 µL du mélange de contrôle de non-reverse transcription dans les quatre puits restants. Joint de plaques avec film transparent adhésif et un essorage à frais viré liquide au fond des assiettes.
5. Préforme de la transcriptase inverse et l’amplification de la cible spécifique en exécutant la plaque dans une machine PCR selon le programme de préampli ; étape 01:50 ° C pendant 60 min, étape 2 : 95 ° C pendant 2 min, étape 3 : 95 ° C pendant 15 s, étape 4 : 60 ° C pendant 4 min, répéter les étapes 3 et 4 24 fois et enfin l’étape 5 : 8 ° C pour toujours.
6. Après que PCR est terminée, garder la plaque à 8 ° C pour le stockage à court terme et -20 ° C pour le stockage à long terme.
   NOTE : Point d’arrêt sécurisé. Matériel amplifié peut être conservé à 8 ° C pour le stockage à court terme et à-20 ° C pour le stockage à long terme.

5. préparation de l’échantillon et de plaques d’essai pour Multiplex Microfluidic Gene Expression Analysis

1. Préparer l’essai de plaque de chargement de pipetage 3 µL de réactif de chargement test dans chaque puits d’une plaque 96 puits. Ajouter 3 µL de chaque amorce dans des puits individuels dans l’essai de plaque de chargement.
2. Flasque avec film adhésif et un essorage à frais viré liquide au fond des assiettes.
3. Préparez plaque de dilution en pipettant : 8 l de nucléase eau gratuite dans tous les puits d’une plaque 96 puits. Ajouter 2 µL de l’échantillon amplifié à la plaque de la dilution, faire une dilution finale de 1 / 5.
4. Flasque avec film adhésif, de la composition de la plaque de vortex pour 10 s et enfin tourner à frais viré liquide au fond des assiettes.
5. Préparer les mix de chargement d’échantillon en mélangeant soigneusement 352 µL du mélange maître avec 35,2 µL de réactif de chargement d’échantillon. Préparer la plaque de chargement d’échantillon en aliquotage 3.3 µL du mélange dans chaque puits d’une plaque 96 puits de chargement.
6. Ajouter 2,7 µL de l’échantillon dilué dans chaque puits de l’échantillon plaque de chargement.
7. Flasque avec film adhésif et un essorage à frais viré liquide au fond des assiettes.

6. chargement de la puce microfluidique

1. Souscrire à une nouvelle puce microfluidique de 96 x 96. Préparer les anses de piquer avec une seringue avec cap sur pour s’assurer qu’ils peuvent être déplacés.
2. Retirer les bulles de seringues. Ajouter plein volume des seringues à chaque valve tout en inclinant la puce 45 degrés et en appuyant vers le bas de la soupape. Premier morceau avec le contrôleur de la SFI.
3. Chargez chaque entrée de dosage avec 4,25 µL de chaque puits dans l’essai de plaque de chargement. Éviter les bulles. Si des bulles apparaissent dans le puits, enlevez-les avec un embout de la pipette.
4. Continuer à charger la bouche de chaque échantillon avec un 4,25 µL de chaque puits dans l’échantillon de plaque de chargement, d’éviter les bulles et si des bulles apparaissent, enlevé à la pointe de pipette.
5. Puce de charge avec le contrôleur de la SFI.
6. Vérifiez que la puce semble encore et que toutes les chambres ont été chargés. Enlever la poussière de la surface de la puce par le toucher avec du ruban adhésif. Exécutez la puce dans la plate-forme d’expression de gène multiplex microfluidiques.

7. exécution Chip sur Multiplex Microfluidic Gene Expression plate-forme

1. Après chargement de puce dans la plate-forme d’expression de gène multiplex microfluidique, nom de l’échantillon.
2. La valeur de ROX comme colorant passive. Fluorescence de définir seule sonde et FAM-BTP. Utilisez 96 x 96 standard v2 comme protocole. Commencer l’exécution.
3. Supprimer les puces lorsqu’il est exécuté sont terminée.

8. preliminary Analysis of Chip Run

1. Charger des données dans le logiciel d’analyse de PCR en temps réel.
2. Charger les noms de gènes et cellules en collant cellulaire et génique mises en page d’un fichier délimité par des tabulations.
3. Ouvrez affichage de l’image et sélectionnez ROX comme colorant. Vérifiez si tous les puits ont colorant passive ROX.
4. Vérifier si toutes les placettes d’amplification regarder OK, avec une courbe d’amplification lisse sans crampons (semblable à la Figure 3E).
5. S’assurer que toutes les cellules de single-expression de contrôle fortifiés à ARN pour s’assurer que tous ont été chargés correctement.
6. S’assurer que toutes les cellules sont l’expression de gène de ménage et donc ont été triées correctement.
7. S’assurer que les contrôles de linéarité cellule 10 et 20 environ 1ct différence pour valider l’amplification linéaire.
8. Vérifier si il y a expression dans les échantillons de contrôle noRT. Si expression est détectée dans noRT envisager de changer les sondes aux sondes qui ne détectent pas l’ADN génomique pour les exécutions suivantes.
9. Exporter des données dans des fichiers csv pour une analyse ultérieure.

9. unicellulaires analyse à l’aide de SCExV

Remarque : Un film d’introduction est présents²⁰ d’introduire l’outil. Ici, une recommandation courte du comment faire l’analyse en utilisant les contrôles introduits dans le protocole est présentée.

1. Se connecter au site Web SCexV²⁰.
2. Télécharger des fichiers CSV exportés.
3. A choisi le contrôle dopés à RNA comme contrôle positif. Supprimer n’importe quelle cellule qui possède un contrôle RNA CT supérieure à 25. Normaliser les données d’expression médiane du contrôle RNA.
4. Cliquez sur « ici -> Analyze ». Enlever le noRT, notemplate, 10 et 20 contrôles de cellule dans l’option de cellule d’exclure.
5. Grappe de cellules avec la démarche de clustering de choix avec le nombre attendu de grappes. Valeur des exportations a analysé.

10. tri des Index analyse

1. Ouvrez le logiciel d’analyse de FACS et charger les échantillons indexées.
2. Ouvrez l’éditeur de script et exécutez le script disponible de Quinn J. et al. ²¹
3. Maintenant que le logiciel d’analyse de FACS aurait dû une porte pour chacune des cellules simples, ouvrez l’éditeur de mise en page et la couleur les cellules selon le groupement de SCexV (disponible dans le fichier nommé « Sample_complete_Data.xls »).

Résultats

Le protocole décrit est rapide, facilement exécutées et très fiable. Un aperçu de la mise en place expérimentale est présenté dans la Figure 1. L’ensemble du protocole, du tri de simples cellules, amplification de la cible spécifique, mesures d’expression de gène et analyse préliminaire peut être effectué en trois jours. Un exemple des résultats analysés sous la forme d’une carte de chaleur qui représente ont analysé les données préli...

Discussion

Ces dernières années, analyse de l’expression génique de la cellule unique est devenu un atout précieux pour définir l’hétérogénéité des différentes cellules populations²³. L’avènement des technologies de séquençage de RNA offre théoriquement une possibilité permettant de mesurer le transcriptome entier d’une cellule, cependant ces méthodes sont compliquées par des variations de profondeurs de séquençage de cellule-cellule et abandons. Unicellulaire qPCR offre une analy...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD14 PECY5	eBioscience	15-0149-42	Clone: 61D3
CD16 PECY5	Biolegend	302010	Clone: 3G8
CD56 PECY5	Biolegend	304608	Clone: MEM-188
CD19 PECY5	Biolegend	302210	Clone: HIB19
CD2 PECY5	Biolegend	300210	Clone: RPA-2.10
CD3 PECY5	Biolegend	300310	Clone: HIT3a
CD123 PECY5	Biolegend	306008	Clone: 6H6
CD235A PECY5	BD Pharma	559944	Clone GAR2
CD34 FITC	Biolegend	343604	Clone: 561
CD38 APC	Biolegend	303510	Clone: Hit2
CD90 PE	Biolegend	328110	Clone: 5E10
CD45RA BV421	BD bioscience	560362	Clone: HI100
CD49f Pecy7	eBioscience	25-0495-82	Clone: eBioGOH3
FBS	HyClone	SV30160.3
PBS	HyClone	SH30028.02
96-well u-bottom Plate	VWR	10861-564
SFEM	Stem cell technologies	9650
Penicillin streptomycin	HyClone	SV30010
TPO	Peprotech	300-18
SCF	Peprotech	300-07
FLT3L	Peprotech	300-19
Falcon Tube 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Eppendorph tube	Sarstedt	72.690.001
CST beads	BD	642412
Accudrop Beads	BD	345249	6 µm particles
Adhesive film Clear	Thermo scientific	AB-1170
Adhesive film Foil	Thermo scientific	AB-0626
96 well PCR plate	Axygen	PCR-96M2-HS-C
PCR 1.5 mL tube	Axygen	MCT-150-L-C
T100 PCR cycler	BioRad	186-1096
10% NP40	Thermo scientific	85124
10 mM dNTP	Takara	4030
0.1 M DTT	Invitrogen	P2325
RNAsout	Invitrogen	10777-019	RNAse inhibitor
CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen	11753-100
Neuclease free water	Invitrogen	11753-100	from CellsDirect kit
2x Reaction Mix	Invitrogen	11753-100	from CellsDirect kit
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix	Invitrogen	11753-100	from CellsDirect kit
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966026
TaqMan Cells-to-CT Control Kit	Invitrogen	4386995
Xeno RNA Control	Invitrogen	4386995	From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay	Invitrogen	4386995	From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs	Fluidigm	BMK-M10-96.96
2x Assay Loading Reagent	Fluidigm		From 96.96 Sample/Loading Kit
20x GE Sample Loading Reagent	Fluidigm		From 96.96 Sample/Loading Kit
Control line fluid	Fluidigm		From 96.96 Sample/Loading Kit
TaqMan Gene Expression Master Mix	Applied Biosystems	4369016
BioMark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD
96.96 Dynamic Array IFC	Fluidigm	BMK-M10-96.96GT
Excel	Microsoft	Microsoft
FlowJo V10	TreeStar	TreeStar
Fluidigm real time PCR analysis	Fluidigm	Fluidigm
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ACE	Thermofisher scientific	Hs00174179_m1
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CD38	Thermofisher scientific	Hs01120071_m1
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