JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Основная ген выражение измерения облако отдельной ячейки различия в гетерогенных клеточных популяций. Здесь мы описываем протокол для анализа выражения гена как одноклеточных и индекс Сортировка по цветения активирован ячейку Сортировка (FACS) могут быть объединены для разграничения неоднородность и immunophenotypically характеризуют молекулярно различных клеточных популяций.

Аннотация

Иммунофенотипический характеристика и молекулярный анализ давно использовались для разграничения неоднородность и определить собственный клеточных популяций. СУИМ относится по своей сути одноклеточных, однако до молекулярного анализа, клетки-мишени часто проспективно изолированы навалом, тем самым теряя резолюции одноклеточных. Анализ выражения гена одноклеточных предоставляет средства для понимания молекулярные различия между отдельными ячейками в гетерогенных клеточных популяций. В массового анализа клеток завышается типа отдельных клеток приводит к предубеждения и окклюзий сигналов от редких клеток с биологической важности. Путем использования СУИМ индекс сортировки в сочетании с анализ выражения гена одноклеточных, населения могут быть исследованы без потери одной ячейки резолюции в то время как клетки с поверхности маркер выражения промежуточные клетки также регистрируются, включение оценки актуальность непрерывной поверхности маркер выражения. Здесь мы опишем подход, сочетающий одной ячейки обратной транскрипции количественного PCR (RT-ПЦР) и СУИМ индекс сортировки одновременно характеризовать молекулярных и иммунофенотипических гетерогенность в популяции клеток.

В отличие от одноклеточного РНК последовательности методов использование ПЦР с конкретной цели усиления позволяет для надежного измерения низкой изобилие стенограммы с меньшим количеством отсева, в то время как она не confounded, вопросы, связанные с вариациями для ячеек в чтение глубины. Кроме того непосредственно индекс сортировка сингл клетки в лизис буфер этот метод, позволяет для синтеза cDNA и конкретных целевых предварительного усиления выполнить за один шаг, а что касается корреляции впоследствии производных молекулярной подписей с клеточной поверхности маркер выражения. Описанный подход был разработан для расследования гемопоэтических сингл клетки, но также успешно используются на других типах клеток.

В заключение подход, описанный в настоящем документе для чувствительных измерения mRNA выражение для группы предварительно отобранных генов с возможностью позволяет разрабатывать протоколы для последующих потенциальных изоляции молекулярно отдельных субпопуляций.

Введение

Каждой отдельной клетки крови, как считается, проживают в клеточном иерархии, где стволовые клетки формируют Апекс поверх ряда все более совершенные промежуточных прародителей, которые в конечном итоге неизлечимо дифференцироваться в окончательный эффекторные клетки, несущие конкретных биологические функции1. Большая часть знаний о том, как организованы стволовых клеток систем был создан в системе кроветворения, во многом из-за способность перспективно изолировать отдельных гемопоэтических населения высокообогащенного стволовых клеток или различных прародителей2 сортируя СУИМ. Это позволило для многих из этих групп населения будут проанализированы функционально или молекулярно, преимущественно через выражение гена профилируя3,4. Однако когда анализ экспрессии генов сыпучих населения индивидуальных различий между ячейками усредняются и потерял5. Таким образом невозможности выявления отклонений в ячейке в гетерогенных клеток фракций может посрамить нашего понимания важнейших биологических процессов, если малого подмножества ячеек для выводимого биологические функции этого населения6, 7. И наоборот расследование подписей выражение генов в одной ячейки резолюции предлагают возможность разграничить неоднородность и обойти затмевает влияний из перепредставленных подмножеств клетки8.

На сегодняшний день были разработаны многие протоколы для анализа выражения гена одной ячейки; с каждым подходом, имея свой собственный предостережений. Метод ранней был РНК флуоресцентные в situ гибридизация (РНК-рыба), который измеряет ограниченное количество стенограммы в то время, но является уникальным в том, что она позволяет для исследования РНК локализации9,11. Ранние методы, с помощью ПЦР и ПЦР для выявления одного или немногих стенограммы были также разработаны12. Однако они в последнее время были заменены на основе микрофлюидика методы, которые можно одновременно анализировать выражение сотни стенограммы на ячейку в сотни клеток через ПЦР и таким образом позволяют для высоких мерного неоднородность анализ с помощью предопределены гена панелей10,13. Недавно РНК последовательности-технологии на основе стали широко использовали для анализа одной ячейки, как теоретически можно измерить всю транскриптом клетки и таким образом добавить произвольное измерение неоднородность анализа10, 14. Multiplexed ПЦР анализ и одноклеточного РНК последовательности имеют разные функции, таким образом обоснование с использованием любого из методов зависит вопрос, а также количество клеток в целевой популяции. Высокой пропускной способностью и низкой стоимости в клетку вместе с беспристрастной, исследовательские характеристики сингл клеточной РНК последовательности желательно, когда расследование неизвестной клетки или больших групп населения. Однако сингл клеточной РНК последовательности также предвзято к виртуализации высокой обильные стенограммы чаще пока стенограммы с низкой изобилие подвержены отсева. Это может привести к значительно сложных данных, которые ставит высокий спрос на bioinformatic анализ, чтобы выявить важные молекулярных сигналов, которые часто тонкие или скрытые в технических шума15. Таким образом, для хорошо изученных тканях, одной ячейки ПЦР анализ с использованием заранее грунтовка панелей, отобранных для функционально важно генов или молекулярных маркеров может служить в качестве чувствительных, простой подход, чтобы определить неоднородности населения. Однако, следует отметить, что по сравнению с одной ячейкой РНК seq, стоимость ячейки как правило, выше для одной ячейки ПЦР методов. Здесь мы опишем подход, сочетающий одноклеточных RT-ПЦР (изменение от Телеш J. et al. 16), СУИМ индекс сортировки17 и биоинформатики анализ18 для того чтобы одновременно характеризуют молекулярных и иммунофенотипических неоднородность населения.

В этом подходе окрашенных клеток населения интерес, и одного клетки отсортированы по СУИМ непосредственно в буфер lysis в 96-луночных ПЦР планшетов. Одновременно выражение уровни дополнительного набора маркеров клетк поверхности записываются для каждой одной ячейки во время СУИМ сортировка, метод, который называется индекс сортировка. Лизированных клеточный материал впоследствии усиливается и экспрессии генов выбранного набора генов, проанализированы с RT-ПЦР, используя microfluidic платформа. Эта стратегия позволяет молекулярный анализ отсортированный одноклеточных, а также одновременное характеристика каждой отдельной ячейки клетк поверхности маркер выражения. Непосредственно сопоставив молекулярно различные подмножества ячеек в выражение индексированных маркеров отсортированный, субпопуляции могут быть связаны с конкретной иммунофенотип, который может использоваться для их будущих изоляции. Описан метод шаг за шагом на рисунке 1. Заранее гена Группа далее способствует более высоким разрешением экспрессии целевых генов, поскольку он обходит измерения не значения обильные генов, которые в противном случае может загородить тонкие ген выражение сигналов. Кроме того конкретные цели усиления, один шаг обратной транскрипции и усиления позволяет для надежного измерения низким выраженным стенограмм, как факторы транскрипции или не поли adenylated РНК. Важно отметить, что ПЦР методы позволяют для измерения mRNA от синтез белков, которые имеют важное значение при расследовании некоторых злокачественных заболеваний19. Наконец расследование целенаправленных количество генов, низкий процент отсева, и ограниченные технические различия между клетки делают этот метод легко проанализированы по сравнению с выше размеров методы, такие как сингл клеточной РНК seq. В соответствии с протоколом, может выполняться эксперимент всего, от сортировки клеток проанализированы результаты, в течение трех дней, что делает это простой и быстрый метод для чувствительной, высок объём одноклеточных гена выражения анализа.

протокол

1. Подготовка Lysis пластин

  1. Используя свободный скамейке РНК/ДНК, подготовить достаточно буфера lysis для 96 скважин, с 10% Дополнительно, путем смешивания 390 мкл нуклеиназы свободной воды, 17 мкл 10% NP-40, 2.8 мкл dNTP 10 мм, 10 мкл 0,1 М DTT и АБС битор РНКазы 5.3 мкл (см. Таблицу материалы). Вортекс и спином вниз.
  2. Распространять 4 мкл буфера lysis для каждой скважины 96 хорошо ПЦР пластины и уплотнения пластин с липкой пленкой. Спин вниз трубы для сбора жидкости в нижней части пластины. Держите пластины на льду до ячейку Сортировка (максимум 24 часа).

2. Подготовка клеток для сортировки клеток

  1. Оттепель соответствующее количество клеток (здесь, CD34 обогащенного гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток) для эксперимента. 1 х 106 клеток являются подходящими для сортировки примерно три пластины 96-луночных сингл-клеток с элементами управления.
  2. Размороженный клетки перехода к 15 мл Конические трубки и добавьте 1 mL FBS каждые 30 s, пока не будет достигнут общий объем 8 мл. Спина клетки в центрифуге на 350 x g 10 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
  3. Ресуспензируйте клетки в 8 мл, окрашивание буфера (PBS с 2% FBS) и центрифуги на 350 x g 10 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
  4. Ресуспензируйте клетки в 200 мкл окрашивание буфер и удаление ячеек для управления пятна.
  5. Сделать флуоресценции минус один из элементов управления (FMOs) для каждого Флюорофор, путем пятнать часть клеток в 50 мкл, окрашивание буфера. В этом примере 6 microcentrifuge трубы с 20 000 ячеек используются как FMOSs. Обратите внимание, что количество клеток должны быть скорректированы в зависимости от населения расследование. Добавьте все антитела на такой же концентрации как в образце пятно за исключением одного для каждой трубы.
  6. Сделайте одного пятна для каждого Флюорофор, окрашивание, часть клеток в 50 мкл буфера для каждого Флюорофор используется. В этом примере используются 6 microcentrifuge трубы с 20 000 ячеек. Обратите внимание, что целевой объект для каждого антитела необходимо быть выраженные ячеек, которые используются для элементов управления. Добавьте каждое антитело на такой же концентрации как в образце пятно в отдельных труб. Кроме того Держите 20000 неокрашенных клетки в 50 мкл как элемент неокрашенных.
  7. Образец клеток добавьте в их соответствующей концентрации антител. Используется здесь CD34-FITC в концентрации 1/100, CD38-APC 1/50, CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 и Lineage Mix: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, и CD235a-PECy5 1/1000.
  8. Инкубируйте клетки с антителами 30 мин на льду в темноте.
  9. Вымойте клетки с 3 мл, окрашивание буфера. Центрифуга клетки на 350 x g 10 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
  10. Ресуспензируйте клетки и повторите шаг 2.9.
  11. Ресуспензируйте образца в 500 мкл и FMOs в 100 мкл, окрашивание буфер с 1/100 7AAD и фильтр клетки через фильтр 50 мкм, чтобы получить одну ячейку подвеска.

3. ячейку Сортировка

  1. Убедитесь, что машина СУИМ установлен правильно с падения задержки и цитометр установки и отслеживания (КНТ) недавно выполненных согласно инструкциям производителя, чтобы обеспечить, что соответствующие клетки отсортированы. Для гемопоэтических клеток рекомендуется использовать 85 мкм сопла и максимальная скорость 4, в то время как стоимость оптимальной событий между 800 и 2000 событий/сек.
  2. Исправление для спектрального наложения, выполняя компенсации по флюоресценции и установить ворота согласно FMO или внутренними негативные элементы управления.
  3. Выполняют реанализа целевых групп населения путем сортировки по меньшей мере 100 клеток-мишеней в новой microcentrifuge трубу с 100 мкл буфера пятно. СУИМ анализировать сортировки клеток путем записи отсортированный образца и убедитесь, что они в конечном итоге в ворота сортировки.
  4. Установка одной пластине ячейку Сортировка по центрирование падение хорошо A1 в 96 хорошо пластины. Когда он центрируется, сортировать 50 – 100 6 мкм частицы во всех скважин вокруг края пустой 96 хорошо пластины для обеспечения получения всех скважин ячейки в центре каждой скважины.
  5. Если возможно дополнительный элемент управления для обеспечения жизнеспособных клеток сортируются могут быть добавлены путем сортировки сингл клетки для роста в пробирке . Кроветворной клетки можно выращивать в U-дно 96 хорошо пластины в 100 мкл SFEM с 1% пенициллин стрептомицина, 100 нг/мл, FLT3L, ТПО и SCF. Анализ каждой скважины после 3 дней в культуре клеток колоний с помощью микроскопа.
  6. Удаления клейкая пленка из плит. Сортировка одну ячейку интерес (здесь Линь-CD34 + CD38-клетки), в 92 из 96 скважин, активировать, индекс сортировка в СУИМ, сортировка программного обеспечения, чтобы сохранить Иммунофенотипический профиль для других отметок интереса (здесь CD45RA, CD49f и CD90) для каждой одной ячейки.
  7. Сортировать две скважины с ячейками 10 и 20 соответственно для элементов управления линейность в ПЦР-амплификации. Обычно используются Уэллс H1 и H2.
  8. Держите две скважины без каких-либо клетки как без шаблон управляет, обычно скважин H3 и H4.
  9. Печать пластины с ясно липкой пленкой и спин таблички на 300 x g за 1 мин до замораживания на сухой лед оснастки.
  10. Хранить замороженные пластины-80 ° c.
    Примечание: Пункт безопасной остановки. Сортировки и лизированных клетки могут храниться при температуре-80 ° C для длительного хранения.

4. обратной транскрипции и конкретных целевых усилители

  1. Подготовка смеси праймера для всех целей 96 гена, добавив 2 мкл каждой пары праймера, включая уборки гена грунтовки и грунты для управления шипами в РНК, в 1,5 мл РНКазы бесплатно трубки на лавочке бесплатно РНК/ДНК. Если используется менее чем 96 грунты, добавьте эквивалентный объем нуклеиназы свободной воды для отсутствующих грунтовки. Праймеры заказаны отдельно чтобы соответствовать панели нужного гена.
  2. Сделать обратной транскрипции и конкретных целевых амплификации перемешать, добавив 632.5 мкл 2 x реакции микс, 101.2 мкл Taq/SuperscriptIII, 151.8 смеси праймера мкл и 0,7 мкл шипами в управления РНК. Преформа этот шаг на лавочке бесплатные ДНК. Смесь vortexing и спин вниз сбор жидкости в нижней части трубки. Держите на льду до дополнение к образцу.
  3. Сделать нет обратной транскрипции управления микс для четырех скважин, смешивая 27,5 мкл 2 x реакции микс, 1,76 мкл энзим Taq, 6,6 мкл смеси праймера и 2,64 мкл нуклеиназы свободной воды. Спайк в управления РНК. Выполните этот шаг на лавочке бесплатные ДНК. Вортекс и спин вниз сбор жидкости в нижней части трубки и держать на льду до дополнение к образцу.
  4. Оттепель lysate пластины на льду. Мкл 8,75 ранее подготовленных обратной транскрипции и конкретных целевых амплификации микс 92 скважин, включая линейность и без шаблон элементов управления. Мкл 8,75 без обратной транскрипции управления смеси четырех оставшихся скважинах. Уплотнение пластины с четкой самоклеющаяся пленка и спин вниз собрать жидкость в нижней части пластины.
  5. Преформа обратной транскрипции и конкретных целевых амплификации, запустив пластину в машину ПЦР согласно программе предусилителя; Шаг 1:50 ° C в течение 60 мин., шаг 2: 95 ° C в течение 2 мин, шаг 3: 95 ° C 15 s, шаг 4: 60 ° C в течение 4 мин, повторите шаги 3 – 4 24 раза и наконец шаг 5: 8 ° C навсегда.
  6. После завершения ПЦР Держите пластины на 8 ° C для краткосрочного хранения и -20 ° C для длительного хранения.
    Примечание: Пункт безопасной остановки. Усиленный материал может храниться на 8 ° C для кратковременного хранения и при-20 ° C для длительного хранения.

5. Подготовка образца и пробирного пластины мультиплекс Microfluidic гена анализ выражения

  1. Подготовка анализа загрузки плита дозирования 3 мкл Реагента загрузки Assay для каждой скважины 96 хорошо плиты. 3 мкл каждого праймера, для отдельных скважин в assay загрузки плита.
  2. Печать табличка с клейкой пленки и спин вниз собрать жидкость в нижней части пластины.
  3. Подготовьте разрежения пластины дозирования 8 мкл нуклеиназы свободной воды на всех скважинах 96 хорошо плиты. 2 мкл усиливается образца, для разбавления пластины, делая окончательный разбавления 1:5.
  4. Печать табличка с липкой пленкой, mix vortexing пластина для 10 s и наконец спина до сбора жидкости в нижней части пластины.
  5. Подготовьте пример загрузки микс, тщательно перемешивая 352 мкл мастер смеси с 35,2 мкл пример загрузки реагента. Подготовка образца пластина мкл aliquoting 3.3 Загрузка смеси для каждой скважины 96 хорошо плиты.
  6. Мкл 2.7 из разреженных образца в каждой скважине образца загрузки плита.
  7. Печать табличка с клейкой пленки и спин вниз собрать жидкость в нижней части пластины.

6. Загрузка Microfluidic чип

  1. Выньте новый чип microfluidic 96 x 96. Подготовьте заливов, тыкая их с помощью шприца с крышкой на чтобы убедиться, что они могут быть перемещены.
  2. Удалите пузыри из шприцы. Добавьте полный объем шприцы для каждого клапана во время наклона чип 45 градусов и нажав вниз клапан. Основной чип с контроллером МФК.
  3. Загрузка каждого пробирного входе с 4,25 мкл каждого из скважин в assay загрузки плита. Избегайте пузырей. Если в колодец появляются пузыри, удалите их с кончиком пипетки.
  4. Продолжить загрузку каждого образца входе с 4,25 мкл каждого из скважин в образце загрузки плита, избежать пузырей и если появятся пузырьки, удалите их с кончиком пипетки.
  5. Загрузить чип с контроллером МФК.
  6. Проверьте, что чип выглядит даже и что все камеры были загружены. Удалите пыль с поверхности чипа, прикоснувшись с лентой. Запустите чип в платформе выражение гена мультиплекс microfluidic.

7. Запуск чип на платформе мультиплекс Microfluidic ген выражение

  1. После загрузки чип в платформу выражение гена мультиплекс microfluidic, имя образца.
  2. Установите ROX как пассивный краситель. Установите один зонд и FAM-МГБ как флуоресценции. Используйте стандартные v2 96 x 96, как протокол. Начало выполнения.
  3. Удаление стружки при запуске полной.

8. предварительный анализ выполнения чип

  1. Загрузка данных в реальном масштабе времени PCR анализа программного обеспечения.
  2. Загрузить гена имена и названия ячеек путем вставки клеточной и генной макеты из файла с разделителями табуляции.
  3. Открыть изображение и выберите ROX как краситель. Проверьте, если все скважины ROX пассивной красителя.
  4. Исследовать, если все усилители участки выглядят нормально, с гладкой амплификации кривой с без каблука (аналогично рис 3E).
  5. Обеспечьте все одно клетки выражение шипами в управления РНК, чтобы убедиться, что все были загружены правильно.
  6. Убедитесь, что все клетки имеют уборки экспрессии генов и таким образом были отсортированы должным образом.
  7. Обеспечьте контроль линейность ячейки 10 и 20 примерно 1 CT разница для проверки линейные усилители.
  8. Проверьте, если есть выражение в Норт контрольных образцов. Если выражение обнаружен в Норт аккумуляторную зонды для датчиков, которые не обнаруживают геномной ДНК для последующих запусков.
  9. Экспорт данных в файлы csv для дальнейшего анализа.

9. одноклеточных анализ с использованием SCExV

Примечание: Ознакомительного фильма является настоящей20 представить инструмент. Здесь представлены короткие рекомендации о том, как сделать анализ с помощью элементов управления, представил в протоколе.

  1. Подключение к веб-сайт SCexV20.
  2. Загрузите экспортированный CSV-файлов.
  3. Выбрал управления шипами в РНК как позитивный элемент управления. Удалите любую ячейку, которая имеет контроль над 25 CT РНК. Нормализовать данные средний выражение управления РНК.
  4. Нажмите «здесь -> анализ». Удаление Северный, notemplate, 10 и 20 мобильные элементы управления в параметре исключить ячейки.
  5. Клетки кластера кластеризации подход по выбору с ожидаемое количество кластеров. Экспорт анализируемого значения.

10. индекс сортировка анализ

  1. Откройте программное обеспечение анализа СУИМ и загрузить индексированные образцов.
  2. Открыть редактор сценариев и запустите сценарий доступен из Quinn J. et al. 21
  3. Теперь, когда анализ программного обеспечения СУИМ следовало бы ворота для каждого из одной клетки, откройте редактор макетов и цвет ячеек в зависимости от группировки из SCexV (доступна в файл с именем «Sample_complete_Data.xls»).

Результаты

Протокол, в описанный быстро, легко осуществляется и высокой надежностью. На рисунке 1представлен обзор экспериментальной установки. Весь протокол от сортировки одного-клеток, усиление конкретных целевых, ген выражение измерения и предварительный ан?...

Обсуждение

В последние годы анализ выражения гена одной ячейки стал ценным дополнением для определения неоднородности популяций различных клеток23. Появление РНК последовательности технологий теоретически обеспечивает возможность измерить всю транскриптом ячейки, однако эти мето...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа поддерживается грантов от шведского общества рака, Шведский исследовательский совет, Шведское общество для медицинских исследований, Шведский фонд детства рака, Рагнар Söderberg фонд и кнут и Фонд Рауля Валленберга Алиса

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
CD14 PECY5eBioscience15-0149-42Clone: 61D3
CD16 PECY5Biolegend302010Clone: 3G8
CD56 PECY5Biolegend304608Clone: MEM-188
CD19 PECY5Biolegend302210Clone: HIB19
CD2 PECY5Biolegend300210Clone: RPA-2.10
CD3 PECY5Biolegend300310Clone: HIT3a
CD123 PECY5Biolegend306008Clone: 6H6
CD235A PECY5BD Pharma559944Clone GAR2
CD34 FITCBiolegend343604Clone: 561
CD38 APCBiolegend303510Clone: Hit2
CD90 PEBiolegend328110Clone: 5E10
CD45RA BV421BD bioscience560362Clone: HI100
CD49f Pecy7eBioscience25-0495-82Clone: eBioGOH3
FBSHyCloneSV30160.3
PBSHyCloneSH30028.02
96-well u-bottom PlateVWR10861-564
SFEMStem cell technologies9650
Penicillin streptomycinHyCloneSV30010
TPOPeprotech300-18
SCFPeprotech300-07
FLT3LPeprotech300-19
Falcon Tube 15 mLSarstedt62.554.502
Eppendorph tubeSarstedt72.690.001
CST beadsBD642412
Accudrop BeadsBD3452496 µm particles 
Adhesive film ClearThermo scientific AB-1170
Adhesive film FoilThermo scientific AB-0626
96 well PCR plateAxygenPCR-96M2-HS-C
PCR 1.5 mL tubeAxygenMCT-150-L-C
T100 PCR cyclerBioRad186-1096
10% NP40Thermo scientific 85124
10 mM dNTPTakara4030
0.1 M DTTInvitrogenP2325
RNAsoutInvitrogen10777-019RNAse inhibitor
CellsDirect One-Step qRT-PCR KitInvitrogen11753-100
Neuclease free waterInvitrogen11753-100from CellsDirect kit
2x Reaction MixInvitrogen11753-100from CellsDirect kit
SuperScript III RT/Platinum Taq MixInvitrogen11753-100from CellsDirect kit
Platinum Taq DNA PolymeraseInvitrogen10966026
TaqMan Cells-to-CT Control KitInvitrogen4386995
Xeno RNA ControlInvitrogen4386995From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression AssayInvitrogen4386995From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCsFluidigmBMK-M10-96.96
2x Assay Loading ReagentFluidigmFrom 96.96 Sample/Loading Kit
20x GE Sample Loading ReagentFluidigmFrom 96.96 Sample/Loading Kit
Control line fluid FluidigmFrom 96.96 Sample/Loading Kit
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystems4369016
BioMark HDFluidigmBMKHD-BMKHD
96.96 Dynamic Array IFCFluidigmBMK-M10-96.96GT
ExcelMicrosoftMicrosoft
FlowJo V10TreeStarTreeStar
Fluidigm real time PCR analysisFluidigmFluidigm
CD179a.VPREB1Thermofisher scientificHs00356766_g1
ACEThermofisher scientificHs00174179_m1
AHRThermofisher scientificHs00169233_m1
BCR_ABL.52Thermofisher scientificHs03043652_ft
BCR_ABL41Thermofisher scientificHs03024541_ft
BMI1Thermofisher scientificHs00995536_m1
CCNA2Thermofisher scientificHs00996788_m1
CCNB1Thermofisher scientificHs01030099_m1
CCNB2Thermofisher scientificHs01084593_g1
CCNCThermofisher scientificHs01029304_m1
CCNE1Thermofisher scientificHs01026535_g1
CCNFThermofisher scientificHs00171049_m1
CCR9Thermofisher scientificHs01890924_s1
CD10.MMEThermofisher scientificHs00153510_m1
CD11aThermofisher scientificHs00158218_m1
CD11c.ITAXThermofisher scientificHs00174217_m1
CD123.IL3RAThermofisher scientificHs00608141_m1
CD133.PROM1Thermofisher scientificHs01009250_m1
CD151Thermofisher scientificHs00911635_g1
CD220.INSRThermofisher scientificHs00961554_m1
CD24.HSAThermofisher scientificHs03044178_g1
NCOR1Thermofisher scientificHs01094540_m1
CD26.DPP4Thermofisher scientificHs00175210_m1
CD274Thermofisher scientificHs01125301_m1
CD276Thermofisher scientificHs00987207_m1
CD32.FCGR2BThermofisher scientificHs01634996_s1
CD33Thermofisher scientificHs01076281_m1
CD34Thermofisher scientificHs00990732_m1
CD344.FZD4Thermofisher scientificHs00201853_m1
CD352.SLAMF6Thermofisher scientificHs01559920_m1
CD38Thermofisher scientificHs01120071_m1
CD4Thermofisher scientificHs01058407_m1
CD41.ITGA2BThermofisher scientificHs01116228_m1
CD49f.ITGA6Thermofisher scientificHs01041011_m1
CD56.NCAM1Thermofisher scientificHs00941830_m1
CD9Thermofisher scientificHs00233521_m1
CD97Thermofisher scientificHs00173542_m1
CD99Thermofisher scientificHs00908458_m1
CDK6Thermofisher scientificHs01026371_m1
CDKN1AThermofisher scientificHs00355782_m1
CDKN1BThermofisher scientificHs01597588_m1
CDKN1CThermofisher scientificHs00175938_m1
CEBPaThermofisher scientificHs00269972_s1
CSF1rThermofisher scientificHs00911250_m1
CSF2RAThermofisher scientificHs00531296_g1
CSF3RAThermofisher scientificHs01114427_m1
E2A.TCF3Thermofisher scientificHs00413032_m1
EBF1Thermofisher scientificHs01092694_m1
ENGThermofisher scientificHs00923996_m1
EPORThermofisher scientificHs00959427_m1
ERGThermofisher scientificHs01554629_m1
FLI1Thermofisher scientificHs00956711_m1
FLT3Thermofisher scientificHs00174690_m1
FOXO1Thermofisher scientificHs01054576_m1
GAPDHThermofisher scientificHs02758991_g1
GATA1Thermofisher scientificHs00231112_m1
GATA2Thermofisher scientificHs00231119_m1
GATA3Thermofisher scientificHs00231122_m1
GFI1Thermofisher scientificHs00382207_m1
HES1Thermofisher scientificHs01118947_g1
HLFThermofisher scientificHs00171406_m1
HMGA2Thermofisher scientificHs00171569_m1
HOXA5Thermofisher scientificHs00430330_m1
HOXB4Thermofisher scientificHs00256884_m1
ID2Thermofisher scientificHs04187239_m1
IGF2BP1Thermofisher scientificHs00198023_m1
IGF2BP2Thermofisher scientificHs01118009_m1
IKZF1Thermofisher scientificHs00172991_m1
IL1RAPThermofisher scientificHs00895050_m1
IL2RGThermofisher scientificHs00953624_m1
IRF8Thermofisher scientificHs00175238_m1
ITGB7Thermofisher scientificHs01565750_m1
KITThermofisher scientificHs00174029_m1
Lin28BThermofisher scientificHs01013729_m1
LMO2Thermofisher scientificHs00153473_m1
LYL1Thermofisher scientificHs01089802_g1
Meis1Thermofisher scientificHs01017441_m1
mKi67Thermofisher scientificHs01032443_m1
MPLThermofisher scientificHs00180489_m1
MPOThermofisher scientificHs00924296_m1
NFIBThermofisher scientificHs01029175_m1
Notch1Thermofisher scientificHs01062011_m1
PtenThermofisher scientificHs02621230_s1
RAG2Thermofisher scientificHs01851142_s1
RPS18Thermofisher scientificHs01375212_g1
RUNX1Thermofisher scientificHs00231079_m1
Shisa2Thermofisher scientificHs01590823_m1
Spi1Thermofisher scientificHs02786711_m1
Sterile.IgHThermofisher scientificHs00378435_m1
TAL1Thermofisher scientificHs01097987_m1
THY1Thermofisher scientificHs00264235_s1
Tim.3.HAVCR2Thermofisher scientificHs00958618_m1
VWFThermofisher scientificHs00169795_m1

Ссылки

  1. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
  2. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  3. Ye, F., Huang, W., Guo, G. Studying hematopoiesis using single-cell technologies. Journal of Hematology & Oncology. 10, 27 (2017).
  4. Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).
  5. Wills, Q. F., et al. Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments. Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).
  6. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  7. Wilson, N. K., Nicola, K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  8. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
  9. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of Single RNA Transcripts in Situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  10. Kalisky, T., et al. A brief review of single-cell transcriptomic technologies. Briefings in Functional Genomics. , elx019 (2017).
  11. Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nature Reviews Genetics. 16, 57 (2014).
  12. Bengtsson, M., Ståhlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).
  13. Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., Ståhlberg, A. Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise. BMC Molecular Biology. 9 (1), 63 (2008).
  14. Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, 1096 (2013).
  15. Tung, P. -. Y., et al. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies. Scientific Reports. 7, 39921 (2017).
  16. Teles, J., Enver, T., Pina, C. Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis. Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).
  17. Hayashi, T., et al. Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its "index sorting" function for stem cell research. Development, Growth, & Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).
  18. Lang, S., et al. SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data. BMC Bioinformatics. 16 (1), 320 (2015).
  19. de Klein, A., et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).
  20. . indexed-sorting Available from: https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting (2016)
  21. Warfvinge, R., et al. Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML. Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).
  22. Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
  23. Breton, G., et al. Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs. The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).
  24. Alberti-Servera, L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors. The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).
  25. Giustacchini, A., et al. Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia. Nature Medicine. 23, 692 (2017).
  26. Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow. Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).
  27. Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
  28. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

140RTFACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены