JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذه الورقة، ويصف لنا بروتوكولا لوصف استجابات ايستب الغلوبولين المناعي (Ig) T-تعتمد على والمستقلة تي في الفئران باستخدام ELISA. تستخدم هذه الطريقة وحدها أو في تركيبة مع التدفق الخلوي سوف تسمح الباحثين تحديد الفروق في الاستجابات ايستب بالخليه بوساطة Ig في الفئران بعد التحصين مستضد تعتمد على T ومستقلة عن تي.

Abstract

الأجسام المضادة، كما وصف كما المناعية (Ig)، التي يفرزها ميزت ب الخلايا الليمفاوية، خلايا بلاسمابلاستس/البلازما، بالحصانة humoral تقديم دفاع هائلة ضد غزو العوامل الممرضة عبر آليات متنوعة. واحد الأهداف الرئيسية للتطعيم الحث على أجسام محددة مستضد واقية لمنع حدوث إصابات تهدد الحياة. على حد سواء تعتمد على الغدة الصعترية (TD) ومستقلة عن الغدة الصعترية المستضدات (TI) يمكن الحصول على ردود IgM محددة مستضد قوية ويمكن أن تحفز أيضا إنتاج الأجسام المضادة تحولت ايستب (مفتش، والقاهرة، وفريق الخبراء الحكومي الدولي) فضلا عن توليد خلايا الذاكرة ب بمساعدة المقدمة من مستضد تقديم الخلايا (Apc). وهنا يصف لنا بروتوكولا لوصف استجابات ايستب TD و TI Ig في الفئران باستخدام مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA). في هذا البروتوكول، استجابات TD والمفتش العام منظمة الشفافية الدولية هي في الفئران التي تلقاها التحصين داخل (القائمة) مع المستضدات مترافق هابتين النموذجي كله TNP (في الشب) و TNP-السكاريد (في برنامج تلفزيوني)، على التوالي. للحث على استجابة الذاكرة TD، يرد تحصين الداعم TNP-كله في الشب في 3 أسابيع بعد التحصين الأولى مع نفس المستضد/adjuvant. يتم حصاد الأمصال الماوس عند نقاط زمنية مختلفة قبل وبعد التحصين. مجموع مستويات مصل Ig والأجسام المضادة TNP على حدة في وقت لاحق كمياً استخدام Ig محددة ايستب ساندويتش وإليزا غير المباشرة، على التوالي. من أجل قياس تركيز المصل كل ايستب Ig بشكل صحيح، العينات تحتاج إلى أن تضعف على نحو مناسب لاحتواء ضمن النطاق الخطي للمنحنيات القياسية. باستخدام هذا البروتوكول، نحصل دائماً على نتائج يمكن الاعتماد عليها بخصوصية عالية وحساسية. عندما تستخدم بالاقتران مع أساليب أخرى مكملة مثل التدفق الخلوي، والثقافة في المختبر ب خلايا الطحال والمناعي تلطيخ (المدينة)، سيسمح هذا البروتوكول الباحثين للحصول على فهم شامل لجسم الردود في وضع تجريبي معين.

Introduction

ب اللمفاويات هي اللاعب الرئيسي في حصانة humoral ونوع الخلية فقط في الثدييات التي قادرة على إنتاج الأجسام المضادة، كما وصفته المناعية (Ig)1،2. الأجسام المضادة التي تفرزها الخلايا ب تقديم دفاع هائلة ضد غزو العوامل الممرضة عبر آليات متنوعة بما في ذلك تحييد، opsonization، وتكمل التنشيط، مما يؤدي إلى حصانة الحماية3. ويتحقق إفراز الأجسام المضادة بخلايا ب فقط بعد التنشيط الكامل ب خلايا معينة، الأمر الذي يتطلب عادة اثنين متميزة إشارات3. يتم ترحيل إشارة 1 بالربط المباشر من المستضد (Ag) لمستقبلات الخلية ب (المركز) أعرب على سطح الخلايا السذاجة محددة ب3. تبعاً لمصدر 2 إشارة، يمكن تقسيم الخلية بالتنشيط تعتمد على الغدة الصعترية (الدفتيريا) أو مستقلة عن الغدة الصعترية (TI)3،4. في رد مستضد TD، توفرها 2 إشارة تنشيط المشابهة CD4 مساعد (رح) خلايا تي، التي تعبر عن CD154، يجند لمستقبلات كوستيمولاتوري CD40 أعرب ب الخلايا1،،من23. في استجابة مستضد TI، 2 إشارة تأتي من الاشتباك أما مستقبلات مثل عدد القتلى (TLRs في حالة النوع 1 جي تي) أو العابرة للربط واسعة النطاق من بكرس (في حالة النوع 2 جي تي) في ب3،4خلايا. نوع 1 منظمة الشفافية الدولية (TI-1) مولدات المضادات الميكروبية يغاندس من TLRs، بما في ذلك ليبوبوليساكتشاريديس البكتيرية (لبس)، الكشف الفيروسية، والجرثومية "البد الحمض النووي"4،5. نوع 2 منظمة الشفافية الدولية (TI-2) مولدات المضادات بنية متكررة عالية، وهي قادرة على تقديم فترات طويلة ومستمرة إشارات إلى الخلية بواسطه العابرة للربط متعددة من4،بكرس6. وتشمل أمثلة نموذجية من المستضدات تي-2 السكريات المكوّرات الرئوية ومترافق هابتين السكاريد6،7. يمكن الحصول على ردود IgM محددة مستضد قوية المستضدات TD ومنظمة الشفافية الدولية ويمكن أيضا تحفز إنتاج الأجسام المضادة تحولت ايستب (مفتش، والقاهرة، وفريق الخبراء الحكومي الدولي) بمساعدة تقدمها مستضد تقديم الخلايا (Apc) مثل الخلايا الجذعية (DCs)1 ،،من23. وعلاوة على ذلك، المستضدات TD ومنظمة الشفافية الدولية قادرة على حمل ردود الذاكرة مع المساعدة من ناقلات الجنود المدرعة، ولكن TD المستضدات أكثر كفاءة في حفز الذاكرة خلية بالجيل3،8.

في هذا البروتوكول، هي أثارت ردود TD و TI Ig في الفئران بالتحصين داخل (القائمة) مع نموذج مترافق هابتين المستضدات مفج 2,4,6-ترينيتروفينيل-ثقب المفتاح هيموسيانين (TNP-كله) و TNP-السكاريد (المحايدة، الغاية تشعبت وكتلة عالية)، على التوالي9،،من1011. عادة ما تستخدم مولدات TD مع أخرى الأعشاب لتعزيز إنتاج الأجسام المضادة12. هنا في موقعنا البروتوكول، يتم حقن TNP-كله مع الشب، adjuvant استخداماً في التحصين الدراسات12. وتشمل الأمثلة الأخرى من المواد التي يمكن أن تستخدم كامل أو غير كامل فروند الشعبية adjuvant (فرنكات الجماعة المالية الأفريقية أو إيفا)، بدهن مونوفوسفوريل/تريهالوسي ديكورينوميكولاتي ("ربي" adjuvant)، والبد أوليجوديوكسينوكليوتيديس،، إلخ13 14. بعد التحصين، سيرا الماوس يتم حصادها في نقاط زمنية مختلفة، والأجسام المضادة TNP محددة في الأمصال كمياً باستخدام Ig ايستب محددة مرتبطة بالانزيم المرتبط بالانزيم (إليزا)9،10، 11.

أليسا هو تحليل القائم على لوحة يستخدم على نطاق واسع كأداة تشخيص في الطب، وأيضا كأداة تحليلية في بحوث الطب الأحيائي15،16. يتم استخدامه للكشف والتحديد الكمي لتحليلها بما في ذلك الأجسام المضادة، الهرمونات، السيتوكينات، المستقطبات، ومختلف المستضدات، إلخ. يمكن أن يؤديها أليسا في العديد من تنسيقات مختلفة، بما في ذلك ساندويتش، المباشرة وغير المباشرة، وتنافسية أليسا15،16. وبصفة عامة، أنها تنطوي على تعطيل تداول المستضد على سطح صلب، عادة لوحة microtiter 96، حسنا، الذي هو المحتضنة مع جسم الأولية. بعد الحضانة، يتم غسلها الجسم غير منضم بعيداً. في أليسا مباشرة، هو مترافق جسم الأولية مباشرة إلى إنزيم (عادة الفجل البيروكسيديز أو الفوسفاتيز القلوية)، التي يمكن أن تنشق الركازة اللونية تسفر عن تغيير لون مرئية الكشف عنها بواسطة أداة الكشف عن إشارة مثل جهاز المطياف الضوئي15،16. وفي المقابل، إذا كان جسم ثانوية المرتبطة بالانزيم يستخدم لربط جسم الأولية، ثم هذا يعتبر غير مباشرة15،أليسا16. أليسا المباشر أسرع حين أليسا غير المباشر هو أكثر حساسية15،16. في ساندويتش أليسا، اللوحات المغلفة بجسم "التقاط" تستخدم لشل مستضد الاهتمام بالعينات، ومن ثم يمكن الكشف عن مستضد الملتقطة بالضد "اكتشاف" آخر بطريقة مباشرة أو غير مباشرة15، 16-"ساندويتش أليسا" يوفر خصوصية عالية منذ الكشف عن antigen بواسطة اثنين من الأجسام المضادة المختلفة للمستضد. في أليسا تنافسية، يتم تأسيس المنافسة بين مستضد عينة مستضد لوحة زمنياً للربط لجسم الأولية، وثم يتم تركيز مستضد في عينة كمياً بقياس الانخفاض في إشارة من الركازة 15 , 16. أليسا تنافسية يمكن أن يؤديها باستخدام التنسيق المباشر أو غير المباشر المشار إليها أعلاه وهي مفيدة للكشف عن المستضدات صغيرة مع15،بيفرتون واحد فقط16.

تشمل التقنيات البديلة لقياس الأجسام المضادة راديو-المناعة (ريا)، اليكتروتشيميلومينيسسينسي (القامة) المقايسة وسطح الرنين مأكل مثل الطحين (موارد البرنامج الخاصة) الاعتداء17. وكان ريا المناعة الأولى وضع تلك التدابير وجود مستضد (أو جسم) بخصوصية عالية وحساسية باستخدام الكواشف راديولابيليد18،19. ومع ذلك، بسبب المخاوف من سمية المشعة والعمر التخزيني وتكاليف التخلص من التراخيص الخاصة للعمل مع المواد المشعة، أليسا أفضل ويستخدم الأسلوب أكثر ملاءمة للمشترك20،21. هو القامة مقايسة حساسة للغاية التي يتم تهيئتها باستخدام الكهرباء لتوليد الأنواع شدة رد الفعل من السلائف مستقرة على سطح القطب ردود فعل تشيميلومينيسسينت، ويمكن استخدامها لقياس مقدار تحليلها (مثل المستضدات أو 22من الأجسام المضادة). ومع ذلك، يصدرون يتطلب أداة خاصة وبالتالي لا تستخدم على نطاق واسع أليسا23. من موارد البرنامج الخاصة فحص مباشر التي يمكن استخدامها لقياس ربط يغاندس (مثلاً.، الأجسام المضادة) للجزيئات معطلة (مثلاً.، المستضدات) على جهاز استشعار رقاقة السطحية24. موارد البرنامج الخاصة بالكشف عن التفاعلات في الوقت الحقيقي جداً على وجه التحديد ولا تتطلب استخدام الكواشف المسمى كما هو الحال في أليسا. ومع ذلك، موارد البرنامج الخاصة أيضا يتطلب معدات خاصة ولديه حساسية أقل مما أليسا17. ونظرا للقيود المفروضة على الطرق البديلة، أليسا هو الأسلوب الأكثر ملائمة ومريحة لهدفنا في هذا البروتوكول. هنا، يمكننا وصف استخدام ساندويتش أليسا لتحليل مجموع مستويات ايستب Ig وإجراءات أليسا غير المباشرة لتحليل محددة مستضد Ig إيسوتيبيس.

Protocol

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية المؤسسية من جامعة روتجرز. وتستخدم جميع الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة وإطار بروتوكول حيوانية وافقت عليها لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية.

1-إعداد الفئران وجمع الأمصال الماوس ساذجة

  1. إبقاء جميع الفئران لتجارب التحصين في محدد مرفق خالية من مسببات الأمراض الحيوانية.
  2. استخدام المطابقة بين الجنسين، والشباب البالغين (8 – 12 أسبوعا القديمة) خروج المغلوب وليتيرماتي التحكم في الفئران التي تشترك في نفس الوالدين واقفاص للدراسات التحصين.
  3. خطة التحصين والجداول الزمنية لجمع المصل كما هو مبين في الشكل 1.
  4. حصاد المصل ساذجة لكل الماوس في 7 أيام (-7 أيام) قبل التطعيم. اتبع الرجعية-المداري والنزيف والمصل إجراءات إعداد كما هو مفصل أدناه في الخطوة 4.

2-إعداد TNP-السكاريد (تي مستضد) و TNP-كله (مستضد TD)

  1. حل مساحيق مستضد في برنامج تلفزيوني العقيمة (درجة الحموضة 7.4) دقة جعل 0.5 ملغ/مل الأسهم TNP-السكاريد و 1 ملغ/مل من حلول الأسهم TNP-كله. الكوة كل مستضد الأسهم الحل إلى العقيمة [ميكروفوج] أنابيب في 0.5 مل/أنابيب، والحفاظ مختبرين في-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. تجنب التجميد والذوبان من مختبرين مستضد متعددة.
  2. اليوم حقن، حساب حجم TNP-السكاريد (50 ميكروغرام/100 ميليلتر/الماوس) أو TNP-كله (100 ميكروغرام/100 ميليلتر/الفأر) اللازمة وفقا لعدد الفئران بالحقن. ذوبان الجليد عدد مناسب من مختبرين السكاريد TNP أو TNP-كله في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. لحقن TNP-كله، أولاً تمييع adjuvant الشب (40 مغ/مل) مع 3 مجلدات من PBS العقيمة إلى تركيز نهائي 10 ملغ/مل. تأكد من أن خليط adjuvant الشب جيدا مع وقف التنفيذ قبل التخفيف.
  4. الجمع بين حجم تساوي 10 ملغ/مل الشب adjuvant الملاط من الخطوة 2، 3 والحل كله TNP المذابة (1 ملغ/مل) في أنبوب البولي بروبلين 5 مل ومزيج جيد واحتضان في 37 درجة مئوية ل 30 دقيقة تحضير هذا TNP-كله/الشب مزيج طازجة قبل الحقن.

3-تحصين الفئران

  1. إجراء الحقن داخل (القائمة) TNP-السكاريد أو TNP-كله/الشب لتحصين الفئران بحقن الأنسولين 1 مل في خزانة السلامة الأحيائية. أدخل الإبرة في حوالي 30° زاوية يفضل أن يتم ذلك في الربع العلوي الأيمن من كل الماوس لمنع حقن في الأعضاء الداخلية.
  2. حقن القائمة 100 ميليلتر من TNP-السكاريد كل الماوس في اليوم 0 للتحصين جي تي (الشكل 1أ).
  3. حقن القائمة 200 ميليلتر من مزيج TNP-كله/الشب (طازج في الخطوة 2، 4) للماوس في اليوم 0 للتحصين TD Ag. كرر حقن نفسه في يوم 21 التحصين الداعم للدراسات الذاكرة (الشكل 1ب).
  4. بعد الحقن، عودة كل الماوس إلى قفصة وإبقاء جميع حقن الفئران في حالة معينة خالية من مسببات الأمراض.

4-الرجعية-المداري النزيف وإعداد مصل

  1. حصاد الأمصال الماوس عند نقاط زمنية مختلفة: للتحصين TNP-السكاريد، جمع الأمصال الماوس في اليوم – 7 و 7 (الشكل 1أ)؛ للتحصين TNP-كله/الشب، جمع الأمصال الماوس في اليوم-7, 7 و 14 و 28 (الشكل 1ب).
  2. للرجعية-المداري النزيف، تخدير كل الماوس مع إيسوفلوراني 5% لمدة 1 – 2 دقيقة في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء25. نفذ الدواسة العاكسة لضمان التخدير الكافي لكل الماوس.
  3. أمسك الماوس أنيسثيتيزيد في يد واحدة مع السبابة والإبهام سحب الجلد حول مقلة العين مرة أخرى حتى يتسنى مقلة العين يبرز من مأخذ التوصيل25. إدراج غير هيبارينيزيد ماصة باستور أو الأنبوبة الشعرية بزاوية مقدارها 45 درجة في الزاوية الداخلية محجر العين تحت المقلة25.
  4. تطبيق ضغط نزولي لطيف وتدوير ماصة أو الأنبوب بلطف لكسر في هذا السياق وجمع 150-200 ميليلتر من الدم في أنبوب أو ماصة. على الفور نقل الدم إلى أنبوب [ميكروفوج] معقم 1.5 مل والعودة الماوس إلى قفصة لاسترداد.
  5. واسمحوا الدم عينات الجلوس على RT ح 1 – 2 يتجمد.
  6. الطرد المركزي في عينات الدم متخثر في س 13,000 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. نقل المصل واضحة على رأس تجلط الدم إلى أنبوب معقم 1.5 مل [ميكروفوج] جديدة.
  7. كرر الخطوة 4.6 واحد مزيد من الوقت لإزالة بقايا تجلط الدم وجمع المصل واضحة.
  8. قاسمة المصل في معقم 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب في 50 ميليلتر/أنابيب، وتخزين الأمصال في-80 درجة مئوية.
  9. البديل العين لنزيف في نقاط زمنية مختلفة حيث أن كل عين هو نزف في معظم مرتين للتجربة كلها. في المحطة الطرفية النزيف، جمع يصل إلى 1 مل دم من كل الماوس قبل القتل الرحيم. Euthanize الماوس مع 5% CO2 متبوعاً بخلع عنق الرحم.
    ملاحظة: يمكن أن تحصد ب الطحال الخلايا في المختبر دراسات الثقافة وتحليل تدفق سيتوميتريك. ونحن أيضا بإعداد الحمض النووي من سبلينوسيتيس للتحقق من النمط الوراثي لكل الماوس.

5-الماوس Ig ايستب محددة أليسا

  1. إعداد المخازن المؤقتة والحلول قبل أليسا.
    1. إعداد 500 مل من "اقتران المخزن المؤقت" (PBS، درجة الحموضة 7.4).
    2. إعداد 500 مل من "محلول الغسيل" (برنامج تلفزيوني-T (0.05% 20 توين)، الرقم الهيدروجيني 7.4).
    3. تحضير 100 مل من "حجب المخزن المؤقت" (BSA 1% في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4، المخزنة في 4 درجات مئوية).
    4. تحضير 1 لتر من "الركازة المخزن المؤقت" (الديثانولامين 1 متر، والرقم الهيدروجيني 9.8 (97 مل الديثانولامين في 1 لتر من ح2س، الأس الهيدروجيني ضبطه باستخدام 10 M HCl) و 0.5 مم مجكل2). حماية "المخزن المؤقت الركيزة" من الضوء بتغليف الزجاجة مع رقائق الألومنيوم. مخزن في 4 درجات مئوية.
    5. تحضير 100 مل من محلول Stop (من هيدروكسيد الصوديوم م 3).
  2. معطف لوحات أليسا:
    1. لمجموع مصل Ig ايستب أليسا، معطف لوحات المناعية 96-جيدا مع 10 ميكروغرام/مل من التقاط الماوس المضادة الماعز [بولكلونل] Ig ايستب على حدة (M, G1, G2a, G2b, G3، A أو E) تقاسم المنافع في اقتران المخزن المؤقت (PBS) في 100 ميليلتر/جيدا.
    2. ايستب Ig محددة TNP أليسا، معطف لوحات المناعية 96-جيدا مع 10 ميكروغرام/مل من TNP(38)-جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني في 100 ميليلتر/جيدا.
    3. لتقارب عالية Ig الخاصة TNP ايستب أليسا، معطف لوحات المناعية 96-جيدا مع 10 ميكروغرام/مل من TNP(3)-جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني في 100 بئر ميليلتر/26. احتضان لوحات عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. بعد طلاء الحضانة، يغسل لوحات 2 مرات مع 200 ميليلتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني-ت. تجاهل في "المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي" ووصمة عار الجافة اللوحات (الحنفية كل لوحة رأسا على كومة من المناشف الورقية) بعد كل غسل.
  4. كتلة اللوحات: إضافة 200 ميليلتر/جيدا لحجب المخزن المؤقت (1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني) في لوحات المغلفة، واحتضان لوحات لح 1 في الرايت
  5. بينما يتم حجب اللوحات، يعد تخفيف المعايير ايستب Ig وعينات المصل في "المخزن المؤقت لحظر" في صفيحة 96-بئر منفصلة وغير المعالجة في 150 ميليلتر/جيدا.
    1. إعداد معايير ايستب Ig نانوغرام/مليلتر 250 كبداية تركيز القياسية (St01) وتجعل من 7 إلى 10 من 1:2 تسلسلي تخفيف المعايير Ig (St02 St07 أو St10، الشكل 2أ).
    2. إعداد الماوس المصل عينات في إضعاف 1: 100 أو 1: 500 عامل تمييع الانطلاق وجعل 3 أو 4 من 01:10 تخفيف المسلسل لمجموع Ig ايستب أو تخفيف 1:5 المسلسل ايستب Ig TNP على حدة لكل عينة المصل (الشكل 2أ). أليسا فريق الخبراء الحكومي الدولي، إعداد عينات المصل الماوس في عامل تخفيف 1:2 تمييع الانطلاق، وجعل 3 لتخفيف المسلسل 1:5 لكل عينة المصل.
  6. وبعد تجميد، غسل الأطباق من الخطوة 5.4 ثلاث مرات مع 200 ميليلتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني-T ووصمة عار الجافة اللوحات بعد كل غسل.
  7. نقل 100 ميليلتر/بئر المخفف Ig ايستب المعايير (المناسبة للالتقاط والكشف عن القيمة المطلقة) وعينات المصل المخفف من الخطوة 5.5 إلى لوحات إعدادها في الخطوة 5، 6. احتضان اللوحات مع المعايير وعينات من 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  8. غسل الأطباق 3 مرات مع 200 ميليلتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني-T ووصمة عار الجاف اللوحات بعد كل غسل.
  9. في كل لوحة، إضافة 100 ميليلتر/جيدا من 10 ميكروغرام/مل من الفوسفاتيز القلوية المناسبة (أ فب)-الماوس المضادة مترافق محددة ايستب الماعز Ig (M, G1, G2a, G2b, G3، A أو E) Abs المخفف في "المخزن المؤقت لحظر".
  10. احتضان اللوحات مع Abs مترافق وكالة اسوشييتد برس عن ح 1-2 في الرايت للكشف عن فريق الخبراء الحكومي الدولي، احتضان لوحات لح 1 – 2 في 37 درجة مئوية.
  11. تحضير 1 ملغ/مل من "محلول الركازة" بتذويب قرصين من 5 ملغ الفوسفاتيز الركيزة في 10 مل من "الركازة المخزن المؤقت".
  12. تغسل كل لوحة 5 مرات مع 200 ميليلتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني-T ووصمة عار الجافة اللوحات بعد كل غسل.
  13. إضافة 100 ميليلتر/كذلك من "الركازة الحل" في كل لوحة. السماح برد فعل على وضع في الرايت، التي عادة ما يستغرق سوى بضع دقائق.
  14. قراءة كل لوحة في 405 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية مع البرنامج المقترن به.
    1. انقر فوق "إعدادات" لتعيين أطوال موجية "Lm1" في "405 نانومتر" وانقر فوق "موافق".
    2. انقر فوق "قالب" لتعيين "فارغة" الآبار والآبار "المعايير" والآبار "غير معروف" وفقا لإعداد لوحة 96-جيدا.
    3. للآبار "معايير"، انقر فوق "سلسلة" تعيين "النموذج الأول" باسم "St01"، وحدد "بدء من" في "أعلى"، وتعيين "يتطابق" ك "2". تحقق من "نموذج ديسكريبتوآر" والمدخلات "القيمة القياسية": حدد "وحدات" باسم "ng/mL"، بتعيين "قيمة البدء" كما "250"، تعيين "خطوة"2". انقر فوق "موافق".
    4. انقر فوق "قراءة" لقراءة اللوحة عندما تكون مركزة الأكثر الروافد القياسية بكثافة بصرية (OD) ~ 1.
    5. انقر فوق القائمة "ملف" ثم انقر فوق "حفظ" لحفظ الملف.
    6. انقر فوق "قراءة" لقراءة اللوحة مرة أخرى عندما يقترب المعيار الأكثر تركيزاً OD405 ~ 1.5 و 2 2.5، على التوالي.
  15. وقف رد الفعل بإضافة من 3 M هيدروكسيد الصوديوم 25 ميليلتر/جيدا. أكمل الخطوات 5.12 5.15 إلى لوحة واحدة في وقت واحد.
  16. تحليل بيانات أليسا استخدام البرمجيات المرتبطة بالقارئ الميكروسكوبية:
    1. تحقق من قيم OD405 المعايير ايستب Ig لقراءة الملفات وحدد قراءة بشكل مناسب مع مجموعة خطية جيدة لمعايير لتحليل البيانات التفصيلية.
    2. حدد البرنامج المناسب 4-معلمة لرسم المنحنيات القياسية. تحقق شركة كفاءة للمنحنى المعياري (ص2)، الذي يلزم أن يكون > 0.98 لضمان نوعية البيانات جيدة.
    3. التحقق من ما إذا كانت القيم OD405 لكل عينة من نقصان مع تزايد عوامل التخفيف. استرداد تركيز جميع العينة المخففة الآبار بواسطة النقر فوق "المجهولة".
    4. حدد بئر مناسبة لكل عينة مع OD405 في النطاق الخطي ايستب Ig المنحنى القياسي لحساب تركيز.
    5. حساب مصل Ig ايستب تركيز كل عينة باستخدام الصيغة: مصل Ig تركيز = المحدد التركيز جيدا × معامل التخفيف.
  17. رسم الرسوم البيانية وإجراء التحليلات الإحصائية باستخدام برامج مناسبة9،10،11. جعل العمودي التبعثر مؤامرات لمصل Ig ايستب مستويات مقارنة الردود المفتش العام في نفس الوقت نقطة. الدراسات استجابة الذاكرة TD، جعل منحنيات الاستجابة الوقت-الدورة التدريبية لدراسة الردود ايستب المفتش العام قبل وبعد التحصين الداعم. استخدام أشرطة الخطأ لإظهار الانحراف المعياري (SD) لكل مجموعة من العينات. لمقارنة الردود ايستب Ig بين الأنماط الجينية اثنين من الفئران، استخدم اختبار مزاوج تي للبيانات ثنائي الطرف لتحديد الدلالة الإحصائية. قم بتعيين قيمة < 0.05 p بشكل ملحوظ مختلفة.

النتائج

لقد استخدمنا هذا البروتوكول للتحقيق في دور منظم الحاسمة للنظام المناعي، TRAF3، ومنظمة الشفافية الدولية والمفتش العام TD ايستب الردود9،10،11. TRAF3 مباشرة أو غير مباشرة وينظم توصيل الإشارة لعدد من المستقبلات المناعية الفطرية و...

Discussion

هنا، نحن تصف البروتوكول لوصف استجابات ايستب TD و TI Ig في الفئران باستخدام ELISA. ويتطلب التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول استخدام المواد المحددة في الجدول 1، بما في ذلك لوحات المقايسة أليسا والتحصين Ags، الماوس Ig ايستب-خاصة بالأجسام المضادة والمعايير. وينبغي الحرص على تجنب استخدام لوحات ?...

Disclosures

المؤلفين قد لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

بتأييد هذه الدراسة بالمعاهد الوطنية للصحة منح R01 CA158402 (P. شيه) و R21 AI128264 (P. شيه)، منح وزارة الدفاع W81XWH-13-1-0242 (ص شيه)، على "جائزة الطيار" من معهد نيو جيرسي السرطان من خلال المنحة رقم P30CA072720 من معهد السرطان الوطني (ص شيه) منحة بوسكه الطبية الحيوية (ص شيه)، وزمالة فيكتور ستولر (A. لالاني)، وب أن والزمالة لازم جيمس باء (س. تشو).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
VersaMax Tunable Microplate ReaderMDS Analytical TechnologiesVERSAMAXEquipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3MDS Analytical TechnologiesSOFTmax PRO 5.3Software for the plate reader
GraphPad PrismGraphPadPrismSoftware for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL)Biosearch TechnologiesF-1300-10A TI Ag for immunization
TNP-KLHBiosearch TechnologiesT-5060-5A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSABiosearch TechnologiesT-5050-10 (conjugation ratio: 38)Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSABiosearch TechnologiesT-5050-10 (conjugation ratio: 3)Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject AlumFisher Scientific PI-77161Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubesFisher Scientific 14-959-11AFor incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin SyringeFisher Scientific 14-829-1BFor i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-BottomFisher Scientific 14-245-61For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-BottomVWR82050-622For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg TabletsSigmaS0942-200TABAP substrate
DiethanolamineVWRIC15251690A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgMSouthernBiotech1020-01Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1SouthernBiotech1070-01Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2aSouthernBiotech1080-01Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2bSouthernBiotech1090-01Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3SouthernBiotech1100-01Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgASouthernBiotech1040-01Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgESouthernBiotech1110-01Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgMSouthernBiotech1020-04Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1SouthernBiotech1070-04Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2aSouthernBiotech1080-04Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2bSouthernBiotech1090-04Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3SouthernBiotech1100-04Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgASouthernBiotech1040-04Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgESouthernBiotech1110-04Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standardBD Biosciences553472TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standardBD Biosciences554054TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standardBD Biosciences556651TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standardBD Biosciences554055TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standardBD Biosciences553486KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standardBD Biosciences550924Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standardBD Biosciences557079TNP-specific IgE, Clone  C38-2

References

  1. Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
  2. Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
  3. Murphy, K. . Janeway's Immunobiology. 8th Edition. 1, (2012).
  4. Vinuesa, C. G., Chang, P. P. Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nature Immunology. 14, 119-126 (2013).
  5. Bekeredjian-Ding, I., Jego, G. Toll-like receptors--sentries in the B-cell response. Immunology. 128, 311-323 (2009).
  6. Mond, J. J., Lees, A., Snapper, C. M. T cell-independent antigens type 2. Annual Review of Immunology. 13, 655-692 (1995).
  7. Garcia de Vinuesa, C., O'Leary, P., Sze, D. M., Toellner, K. M., MacLennan, I. C. T-independent type 2 antigens induce B cell proliferation in multiple splenic sites, but exponential growth is confined to extrafollicular foci. European Journal of Immunology. 29, 1314-1323 (1999).
  8. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nature Reviews Immunology. 15, 149-159 (2015).
  9. Xie, P., Stunz, L. L., Larison, K. D., Yang, B., Bishop, G. A. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 is a critical regulator of B cell homeostasis in secondary lymphoid organs. Immunity. 27, 253-267 (2007).
  10. Xie, P., Kraus, Z. J., Stunz, L. L., Liu, Y., Bishop, G. A. TNF Receptor-Associated Factor 3 Is Required for T Cell-Mediated Immunity and TCR/CD28 Signaling. The Journal of Immunology. 186, 143-155 (2011).
  11. Lalani, A. I., Moore, C. R., Luo, C., Kreider, B. Z., Liu, Y., Morse, H. C., Xie, P. Myeloid Cell TRAF3 Regulates Immune Responses and Inhibits Inflammation and Tumor Development in Mice. The Journal of Immunology. 194, 334-348 (2015).
  12. Lee, S., Nguyen, M. T. Recent advances of vaccine adjuvants for infectious diseases. Immune Network. 15, 51-57 (2015).
  13. Gavin, A. L., Hoebe, K., Duong, B., Ota, T., Martin, C., Beutler, B., Nemazee, D. Adjuvant-enhanced antibody responses in the absence of toll-like receptor signaling. Science. 314, 1936-1938 (2006).
  14. Klinman, D. M., Currie, D., Gursel, I., Verthelyi, D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunological Reviews. 199, 201-216 (2004).
  15. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133, 12 (2013).
  16. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77, 98-101 (2016).
  17. Nencini, F., Pratesi, S., Petroni, G., Matucci, A., Maggi, E., Vultaggio, A. Assays and strategies for immunogenicity assessment of biological agents. Drug Development Research. 75, 4-6 (2014).
  18. Haber, E., Page, L. B., Richards, F. F. Radio immunoassay employing gel filtration. Analytical Biochemistry. 12, 163-172 (1965).
  19. Yalow, R. S., Berson, S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. 1960. Obesity Research. 4, 583-600 (1996).
  20. Lequin, R. M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51, 2415-2418 (2005).
  21. Wreghitt, T. G., Tedder, R. S., Nagington, J., Ferns, R. B. Antibody assays for varicella-zoster virus: comparison of competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), competitive radioimmunoassay (RIA), complement fixation, and indirect immunofluorescence assays. Journal of Medical Virology. 13, 361-370 (1984).
  22. Mathew, B. C., Biju, R. S., Thapalia, N. An overview of electrochemiluminescent (ECL) technology in laboratory investigations. Kathmandu University Medical Journal. 3, 91-93 (2005).
  23. Mikulskis, A., Yeung, D., Subramanyam, M., Amaravadi, L. Solution ELISA as a platform of choice for development of robust, drug tolerant immunogenicity assays in support of drug development. The Journal of Immunological Methods. 365, 38-49 (2011).
  24. Wadhwa, M., Bird, C., Dilger, P., Gaines-Das, R., Thorpe, R. Strategies for detection, measurement and characterization of unwanted antibodies induced by therapeutic biologicals. The Journal of Immunological Methods. 278, 1-17 (2003).
  25. Wolforth, J. B. Methods of Blood Collection in the Mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  26. Stunz, L. L., Busch, L. K., Munroe, M. E., Sigmund, C. D., Tygrett, L. T., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A. Expression of the Cytoplasmic Tail of LMP1 in Mice Induces Hyperactivation of B Lymphocytes and Disordered Lymphoid Architecture. Immunity. 21, 255-266 (2004).
  27. Xie, P. TRAF molecules in cell signaling and in human diseases. Journal of Molecular Signaling. 8, 7 (2013).
  28. Lalani, A. I., Zhu, S., Gokhale, S., Jin, J., Xie, P. TRAF molecules in inflammation and inflammatory diseases. Current Pharmacology Reports. 4, 64-90 (2018).
  29. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist Reviews. 25, 105-120 (2004).
  30. Specter, S., Friedman, H. Age- and sex-related differences in antibody formation and blastogenic responsiveness of splenocytes from RIII mice developing virus-induced mammary adenocarcinoma. The Journal of the National Cancer Institute. 67, 1347-1351 (1981).
  31. Giefing-Kroll, C., Berger, P., Lepperdinger, G., Grubeck-Loebenstein, B. How sex and age affect immune responses, susceptibility to infections, and response to vaccination. Aging Cell. 14, 309-321 (2015).
  32. Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. International Immunology. 19, 545-556 (2007).
  33. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Veterinary Pathology. 49, 32-43 (2012).
  34. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 47, 283-293 (2006).
  35. Vlkova, M., Rohousova, I., Hostomska, J., Pohankova, L., Zidkova, L., Drahota, J., Valenzuela, J. G., Volf, P. Kinetics of antibody response in BALB/c and C57BL/6 mice bitten by Phlebotomus papatasi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6, 1719 (2012).
  36. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172, 2731-2738 (2004).
  37. Ruane, D., Chorny, A., Lee, H., Faith, J., Pandey, G., Shan, M., Simchoni, N., Rahman, A., Garg, A., Weinstein, E. G., et al. Microbiota regulate the ability of lung dendritic cells to induce IgA class-switch recombination and generate protective gastrointestinal immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 213, 53-73 (2016).
  38. Chorny, A., Puga, I., Cerutti, A. Innate signaling networks in mucosal IgA class switching. Advances in Immunology. 107, 31-69 (2010).
  39. Van Praet, J. T., Donovan, E., Vanassche, I., Drennan, M. B., Windels, F., Dendooven, A., Allais, L., Cuvelier, C. A., van de Loo, F., Norris, P. S., et al. Commensal microbiota influence systemic autoimmune responses. The EMBO Journal. 34, 466-474 (2015).
  40. Nguyen, Q. N., Himes, J. E., Martinez, D. R., Permar, S. R. The Impact of the Gut Microbiota on Humoral Immunity to Pathogens and Vaccination in Early Infancy. PLOS Pathogens. 12, 1005997 (2016).
  41. Jeevan-Raj, B. P., Robert, I., Heyer, V., Page, A., Wang, J. H., Cammas, F., Alt, F. W., Losson, R., Reina-San-Martin, B. Epigenetic tethering of AID to the donor switch region during immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 208, 1649-1660 (2011).
  42. Chen, Z., Getahun, A., Chen, X., Dollin, Y., Cambier, J. C., Wang, J. H. Imbalanced PTEN and PI3K Signaling Impairs Class Switch Recombination. The Journal of Immunology. 195, 5461-5471 (2015).
  43. Boboila, C., Yan, C., Wesemann, D. R., Jankovic, M., Wang, J. H., Manis, J., Nussenzweig, A., Nussenzweig, M., Alt, F. W. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of Experimental Medicine. 207, 417-427 (2010).
  44. Shah, H. B., Koelsch, K. A. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods in Molecular Biology. 1312, 419-426 (2015).
  45. Bonsignori, M., Moody, M. A. Simultaneous Detection of Antigen-Specific IgG- and IgM-Secreting Cells with a B Cell Fluorospot Assay. Cells. 1, 15-26 (2012).
  46. Sasaki, Y., Derudder, E., Hobeika, E., Pelanda, R., Reth, M., Rajewsky, K., Schmidt-Supprian, M. Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Immunity. 24, 729-739 (2006).
  47. Goodlad, J. R., Macartney, J. C. Germinal-center cell proliferation in response to T-independent antigens: a stathmokinetic, morphometric and immunohistochemical study in vivo. European Journal of Immunology. 25, 1918-1926 (1995).
  48. Xie, P., Poovassery, J., Stunz, L. L., Smith, S. M., Schultz, M. L., Carlin, L. E., Bishop, G. A. Enhanced Toll-like receptor (TLR) responses of TNFR-associated factor 3 (TRAF3)-deficient B lymphocytes. Journal of Leukocyte Biology. 90, 1149-1157 (2011).
  49. Kaku, H., Horikawa, K., Obata, Y., Kato, I., Okamoto, H., Sakaguchi, N., Gerondakis, S., Takatsu, K. NF-kappaB is required for CD38-mediated induction of C(gamma)1 germline transcripts in murine B lymphocytes. International Immunology. 14, 1055-1064 (2002).
  50. Dudley, D. D., Chaudhuri, J., Bassing, C. H., Alt, F. W. Mechanism and control of V(D)J recombination versus class switch recombination: similarities and differences. Advances in Immunology. 86, 43-112 (2005).
  51. Lange, H., Hecht, O., Zemlin, M., Trad, A., Tanasa, R. I., Schroeder, H. W., Lemke, H. Immunoglobulin class switching appears to be regulated by B-cell antigen receptor-specific T-cell action. European Journal of Immunology. 42, 1016-1029 (2012).
  52. Moore, C. R., Liu, Y., Shao, C. S., Covey, L. R., Morse, H. C., Xie, P. Specific deletion of TRAF3 in B lymphocytes leads to B lymphoma development in mice. Leukemia. 26, 1122-1127 (2012).
  53. Bergmann, B., Grimsholm, O., Thorarinsdottir, K., Ren, W., Jirholt, P., Gjertsson, I., Martensson, I. L. Memory B cells in mouse models. Scandinavian Journal of Immunology. 78, 149-156 (2013).
  54. McHeyzer-Williams, L. J., Milpied, P. J., Okitsu, S. L., McHeyzer-Williams, M. G. Class-switched memory B cells remodel BCRs within secondary germinal centers. Nature Immunology. 16, 296-305 (2015).
  55. Elgueta, R., Marks, E., Nowak, E., Menezes, S., Benson, M., Raman, V. S., Ortiz, C., O'Connell, S., Hess, H., Lord, G. M., et al. CCR6-dependent positioning of memory B cells is essential for their ability to mount a recall response to antigen. The Journal of Immunology. 194, 505-513 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

139 TI Ig Ig adjuvant ELISA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved