JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בנייר זה, אנו מתארים פרוטוקול לאפיין תלויי-T ו- T-עצמאית אימונוגלובולינים (Ig) תגובות isotype בעכברים באמצעות אליסה. בשיטה זו נעשה שימוש לבד או בשילוב עם זרימה cytometry יאפשר לחוקרים לזהות הבדלים בתגובות isotype איג B תאית בעכברים בעקבות חיסון אנטיגן תלויי-T ו- T-עצמאית.

Abstract

נוגדנים, גם כינה כפי immunoglobulins (Ig), מופרש על ידי הבדיל B לימפוציטים, תאי plasmablasts/פלזמה, חסינות humoral לספק הגנה אימתני מפני פולשים פתוגנים באמצעות מנגנונים מגוונים. מטרה אחת הגדולות של החיסון הוא לזירוז נוגדנים אנטיגן ספציפי כדי למנוע זיהומים מסכני. הן תלויי-בלוטת התימוס (TD), ללא תלות התימוס (TI) אנטיגנים יכול להפיק תגובות חזקות של IgM אנטיגן ספציפי, יכול לגרום גם בייצור נוגדנים ממותגת isotype (IgG, איגה ו- IgE) כמו גם הדור של תאי זיכרון B בעזרת מסופקים על ידי אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים). כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לאפיין תגובות isotype TD ו- TI Ig בעכברים באמצעות מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה). ב פרוטוקול זה, תגובות TD ו- TI Ig הם שהפיק בעכברים בקרום הבטן (i.p.) חיסון עם אנטיגנים דגם מצומדת הפטן TNP-KLH (באלום) ו TNP-רב-סוכר (ב- PBS), בהתאמה. לזירוז TD זיכרון התגובה, חיסונים האצה של TNP-KLH אלום ניתנת בגיל 3 שבועות לאחר חיסון ראשון אותו אנטיגן/אדג'וונט. העכבר סרה נקצרים בנקודות זמן שונות לפני ואחרי חיסונים. סה כ רמות Ig בסרום, נוגדנים ספציפיים TNP לאחר מכן הם לכמת באמצעות איג isotype ספציפיים כריך ואליסה עקיף, בהתאמה. כדי כראוי לכמת את הריכוז סרום של כל isotype איג, הדגימות צריך להיות מדולל כראוי כדי להתאים בתוך הטווח ליניארי של עקומות סטנדרטי. באמצעות פרוטוקול זה, אנחנו בעקביות להשיג תוצאות אמינות גבוהה ירידה לפרטים ורגישות. כאשר משתמשים בה בשילוב עם שיטות משלימות אחרות כגון cytometry זרימה, in vitro לקשרי תרבות של הטחול בתאי B, immunohistochemical מכתים (IHC), פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים להשיג הבנה מקיפה של נוגדן תגובות באווירה ניסיונית נתון.

Introduction

B לימפוציטים הם השחקן העיקרי של החסינות humoral ואת סוג התא היחיד אצל יונקים הם מסוגלים לייצר נוגדנים, גם כינה immunoglobulins (Ig)1,2. נוגדנים מופרש על ידי תאי B לספק הגנה אימתני מפני פולשים פתוגנים באמצעות מנגנונים מגוונים לרבות ניטרול, opsonization, הפעלה, שמוביל חיסון הגנתי3. הפרשת נוגדנים על ידי תאי B מושגת רק לאחר הפעלה מלאה של תאים ספציפיים B, אשר בדרך כלל דורש שני ברורים אותות3. אות 1 מועבר על-ידי איגוד ישירה של אנטיגן (Ag) לקולטן תא B (BCR) בא לידי ביטוי על פני השטח של תאים ספציפיים תמים B3. בהתאם לסוג מקור האות 2, תא B הפעלה ניתן לחלק תלויי-בלוטת התימוס (TD) או שאינו תלוי-בלוטת התימוס (TI)3,4. בתגובה אנטיגן TD, אות 2 מסופק על ידי הפעלת cognate CD4 T המסייע (TH) תאים, אשר אקספרס CD154, ליגנד עבור הקולטן co-stimulatory CD40 הביע על B תאים1,2,3. בתגובה אנטיגן TI, אות 2 נובע גם האירוסין של קולטני כמו אגרה (TLRs במקרה של סוג 1 TI Ag) או cross-linking נרחב של BCRs (במקרה של סוג 2 TI Ag) צבועים על תאים3,4. אנטיגנים TI (TI-1) סוג 1 הם ליגנדים מיקרוביאלית של TLRs, כולל חיידקי lipopolysaccharides (LPS), RNAs ויראלי, ומיקרוביאלית CpG DNA4,5. אנטיגנים TI (TI-2) סוג 2 יש מבנה מאוד שחוזרת על עצמה, והם מסוגלים לספק ממושך ומתמשך איתות לתא B על ידי cross-linking מרובים של4,BCRs6. דוגמאות טיפוסיות של TI-2 אנטיגנים כוללים פוליסכרידים pneumococcal מצומדת הפטן רב-סוכר6,7. TD והן TI אנטיגנים יכולים להפיק תגובות חזקות של IgM אנטיגן ספציפי, יכול לגרום גם בייצור נוגדנים ממותגת isotype (IgG, איגה ו- IgE) בעזרת המסופקים על ידי אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים) כגון תאים דנדריטים (Dc)1 ,2,3. יתר על כן, אנטיגנים TD והן TI מסוגלים לגרום תגובות זיכרון בעזרת נגמ שים, אך TD אנטיגנים יעיל יותר ב גרימת זיכרון תא B דור3,8.

ב פרוטוקול זה, תגובות TD ו- TI Ig הם שהפיק בעכברים בקרום הבטן (i.p.) חיסון עם מודל מצומדת הפטן אנטיגנים עלוקה 2,4,6-trinitrophenyl-מנעול המוציאנין (TNP-KLH), TNP-רב-סוכר (נייטרלי, במיוחד בענף ו high-המונית), בהתאמה9,10,11. TD אנטיגנים משמשים בדרך כלל עם אדג'וונט כדי לשפר את הייצור של נוגדנים12. כאן בהפרוטוקול שלנו TNP-KLH מוזרק עם אלום, אדג'וונט נפוצים התחסנות מחקרים12. Adjuvants שיכול לשמש דוגמאות נוספות כוללות כשלמה או לא שלמה פרוינד של אדג'וונט (פרנק או IFA), monophosphoryl-ליפיד A / טרהלוז dicorynomycolate ("Ribi" אדג'וונט), ו- CpG oligodeoxynucleotides, ועוד13, 14. לאחר חיסון, העכבר סרה נקצרים בנקודות זמן שונות, נוגדנים ספציפיים TNP ב סרה הם לכמת באמצעות איג isotype ספציפיים מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה)9,10, 11.

אליסה היא assay המבוסס על הצלחת זה נעשה שימוש נרחב ככלי אבחון ברפואה. וגם ככלי אנליטי המחקר הביו-רפואי15,16. הוא משמש כדי לזהות ולכמת analytes כולל נוגדנים, הורמונים, ציטוקינים, נוגדנים, ואת השונות אנטיגנים, וכו '. אליסה יכול להתבצע במספר תבניות שונות, כולל כריך ישירים, עקיפים, ו- ELISA תחרותי15,16. באופן כללי, היא כוללת את הנייח של אנטיגן על משטח יציב, בדרך כלל צלחת microtiter 96-ובכן, אשר מודגרת עם נוגדן ראשוני. לאחר דגירה, הנוגדן לא מאוגד נשטף הרחק. ב אליסה ישירה, נוגדן ראשוני היא מצומדת ישירות אל אנזים (בדרך כלל חזרת peroxidase או phosphatase אלקליין), אשר יכול לבקע מצע הדפסות כסף להניב שינוי צבע גלוי זוהה על ידי מכשיר לזיהוי האות כגון ספקטרופוטומטרים15,16. לעומת זאת, אם נוגדן משנית מקושרת האנזים משמש כדי לאגד נוגדן ראשוני, אז זה נחשב מטוס15,עקיף אליסה16. אליסה ישיר הוא מהיר יותר ואילו אליסה עקיף הוא15,רגישים יותר16. כריך אליסה, הלוחות הם מצופים נוגדן "ללכוד" נהגה לשתק אנטיגן עניין הדגימות, ואז ניתן להבחין שנתפסו אנטיגן נוגדן נוסף "זיהוי" באופן ישיר או עקיף15, 16. כריך אליסה מציע ירידה לפרטים גבוהה מאז אנטיגן הוא זוהה על ידי שני נוגדנים שונים של אנטיגן. ELISA תחרותי, התחרות נוסדה בין אנטיגן מדגם אנטיגן צלחת מכורך לכריכה כדי נוגדן ראשוני, אז ריכוז אנטיגן מדגם לכמת על ידי מדידת הירידה האיתות המצע 15 , 16. ELISA תחרותי יכול להתבצע באמצעות התבנית ישיר או עקיף שהוזכרו לעיל והיא שימושית איתור אנטיגנים קטן עם אחד בלבד epitope15,16.

טכניקות חלופיות עבור המידה של נוגדנים כוללים רדיו-מתכלה (RIA), electrochemiluminescence (ECL) assay, משטח פלזמון תהודה (SPR) assay17. ריאה היה ראגנטים הראשון שפותח כי האמצעים הנוכחות של אנטיגן (או נוגדנים) ירידה לפרטים גבוהה ורגישות בעזרת ריאגנטים radiolabeled18,19. עם זאת, עקב החשש של הרעלה רדיואקטיבית, סילוק עלויות, חיי מדף, רשיונות מיוחדים לעבודה עם חומרים רדיואקטיביים, אליסה היא טובה יותר ומשתמש טכניקת נוחה יותר משותף20,21. ECL הוא assay רגישה מאוד שבו תגובות chemiluminescent מבוצעים באמצעות חשמל כדי ליצור מינים מאוד תגובתי מתוך מבשרי יציבה על פני השטח של אלקטרודה, והוא יכול לשמש כדי למדוד את כמות analytes (כגון אנטיגנים או נוגדנים)22. עם זאת, ECL דורש מכשיר מיוחד, ובכך לא כמו בהרחבה משמש אליסה23. SPR הוא assay ישיר יכול לשמש כדי למדוד את הכריכה של ליגנדים (למשל., נוגדנים) כדי מתאושש מולקולות (למשל., אנטיגנים) על חיישן צ'יפ משטח24. SPR מזהה את האינטראקציות בזמן אמת מאוד במיוחד, אינו דורש שימוש ריאגנטים עם תוויות ברורות כמו אליסה. עם זאת, SPR גם דורש ציוד מיוחד ויש לו רגישות נמוכה יותר מאשר אליסה17. בהינתן המגבלות של שיטות חלופיות, אליסה היא הטכניקה הכי מתאים ונוח למטרה שלנו ב פרוטוקול זה. כאן, אנו מתארים את השימוש כריך אליסה עבור הניתוח של רמות סך של isotype איג ונוהלי אליסה עקיף לניתוח של אנטיגן ספציפי איג isotypes.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות ועדת אתיקה מוסדית מחקר בבעלי חיים מאוניברסיטת רוטגרס. כל העכברים משמשים על פי הנחיות NIH תחת פרוטוקול בעלי חיים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה.

1. הכנת עכברים ואוסף של Sera בעכבר נאיבי

  1. לשמור כל העכברים לניסויים חיסונים מסוימים מתקן הפתוגן ללא בעלי חיים.
  2. עכברים המשתפים את ההורים ואת הכלובים ללימודי חיסון זהה לשימוש למבוגרים התאימו מגדר, צעיר (בן 8-12 שבועות) נוקאאוט ובקרת littermate.
  3. תוכנית החיסונים של סרום אוסף לוחות זמנים כפי שהיא מתוארת באיור 1.
  4. הקציר תמים סרום של העכבר בכל ב 7 ימים (-7 ימים) לפני חיסון. בצע את רטרו-מסלולית דימום, סרום הכנה ההליכים כפי שיפורט להלן בשלב 4.

2. הכנת TNP-רב-סוכר (אנטיגן TI), TNP-KLH (אנטיגן TD)

  1. להמיס את אבקות אנטיגן ב- PBS סטרילי (pH 7.4) ביסודיות כדי להפוך 0.5 מ"ג/מ"ל של מניות TNP-רב-סוכר, 1 מ"ג/מ"ל של פתרונות מניות TNP-KLH. Aliquot כל אנטיגן במניה פתרון לתוך צינורות סטרילי microfuge-0.5 מ"ל/צינור, ולשמור את aliquots ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. להימנע מרובים הקפאה הפשרה של aliquots אנטיגן.
  2. ביום ההזרקה, לחשב את עוצמת הקול של TNP-רב-סוכר (50 µg/100 µL/עכבר) או TNP-KLH (100 µg/100 µL/עכבר) הדרושים על פי מספר עכברים כדי להיות מוזרק. להפשיר מספר מתאים של aliquots TNP-רב-סוכר או TNP-KLH בטמפרטורת החדר (RT).
  3. להזרקה TNP-KLH, תחילה לדלל את אדג'וונט אלום (40 מ"ג/מ"ל) עם שלושה כרכים של PBS סטרילי כדי ריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל. ודא כי התערובת אדג'וונט אלום היטב על תנאי לפני דילול.
  4. לשלב נפח שווים של 10 מ"ג/מ"ל אלום אדג'וונט slurry שלב 2.3, הפתרון TNP-KLH המופשרים (1 מ"ג/מ"ל) לתוך צינור פוליפרופילן 5 מ"ל, מערבבים היטב, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות הכן הזה TNP-KLH/אלום לערבב טריות לפני הזריקה.

3. חיסון של עכברים

  1. לבצע הזרקת בקרום הבטן (i.p.) TNP-רב-סוכר או TNP-KLH/אלום כדי לחסן את העכברים עם מזרקים אינסולין 1 מ"ל בארון אבטחה. הכנס את המחט בזווית כ 30 מעלות עדיף ברבע נכון התחתון של כל העכבר כדי למנוע הזרקה לתוך האברים הפנימיים.
  2. מזריקים µL i.p. 100 של TNP-רב-סוכר לכל העכבר ביום 0 עבור חיסונים TI Ag (איור 1א').
  3. להזריק i.p. 200 µL של המיקס TNP-KLH/אלום (להתמחויות בשלב 2.4) לכל העכבר ביום 0 עבור חיסונים TD Ag. חזור על הזריקה אותו ביום 21 כמו חיסון דחף ללימודים זיכרון (איור 1B).
  4. אחרי הזריקה, לחזור כל עכבר בכלוב ולשמור כל העכברים מוזרק במצב ספציפי פתוגן-חופשית.

4. רטרו-מסלולית דימום והכנות סרום

  1. הקציר העכבר סרה בנקודות זמן שונות: עבור חיסונים TNP-רב-סוכר, לאסוף את העכבר סרה ביום-7 ו- 7 (איור 1א'); עבור חיסונים TNP-KLH/אלום, לאסוף את העכבר סרה ביום-7, 7, 14, ו- 28 (איור 1B).
  2. עבור רטרו-מסלולית דימום, עזים ומתנגד לכל עכבר עם 5% איזופלוריין 1-2 דקות הקבינט אבטחה25. לבצע רפלקס פדלים כדי להבטיח הרדמה נאותה של כל עכבר.
  3. החזק את העכבר anesthetized ביד אחת עם לאצבע, האגודל משיכת העור סביב העין חזרה, כך גלגל העין בולט החוצה שקע25. הוסף שאינם heparinized פיפטה פסטר או צינור קפילרי בזווית של 45 מעלות לתוך הפינה הפנימית של ארובת העין מתחת גלגל העין25.
  4. הפעילו לחץ כלפי מטה בעדינות וסובב את פיפטה או צינור בעדינות כדי לפרוץ את הווריד ולאסוף 150-200 µL של דם פיפטה או צינור. מיד להעביר את הדם צינור microfuge mL 1.5 סטרילי ולחזור העכבר לכלוב שלו כדי להתאושש.
  5. אתן לדם דגימות לשבת RT עבור h 1 – 2 מצב של קרישת חסר.
  6. Centrifuge דגימות דם קרוש ב x 13,000 g 10 דקות ב 4 º C. להעביר את הנסיוב ברורה על גבי קריש הדם צינור microfuge mL 1.5 סטרילי.
  7. חזור על שלב 4.6 פעם נוספת כדי להסיר קריש דם שיורית ולאסוף את הנסיוב ברורה.
  8. Aliquot הנסיוב לתוך צינורות סטרילי mL 1.5 microfuge-50 µL/צינור, ולאחסן את sera ב-80 מעלות צלזיוס.
  9. לסירוגין את העין דימום בנקודות זמן שונות, כך כל עין הוא דימם לכל היותר פעמיים במשך הניסוי כולו. במסוף דימום, לאסוף עד 1 מ"ל של דם בכל העכבר לפני המתת חסד. המתת חסד העכבר עם 5% CO2 ואחריו נקע בצוואר הרחם.
    הערה: ניתן לקצור תאי B הטחול עבור זרימת cytometric ניתוחים ומחקרים in vitro לקשרי תרבות. אנחנו גם להכין הדנ א מ splenocytes כדי לוודא את גנוטיפ של העכבר בכל.

5. העכבר איג Isotype ספציפיים אליסה

  1. הכינו את מאגרי והפתרונות לפני אליסה.
    1. הכנת 500 מ"ל של מאגר מצמד (PBS, pH 7.4).
    2. הכנת 500 מ"ל של שטיפת פתרון (PBS-T (0.05% Tween 20), pH 7.4).
    3. להכין 100 מ של חסימת מאגר (1% BSA ב- PBS, pH 7.4, המאוחסנים ב 4 ° C).
    4. להכנת 1 ליטר מצע מאגר (1 מ' diethanolamine, pH 9.8 (97 מ"ל של diethanolamine ב 1 ליטר של H2O, pH להגדרה באמצעות 10 M HCl) ו- 0.5 מ מ MgCl2). להגן על המאגר המצע האור על ידי ליפוף את הבקבוק עם רדיד אלומיניום. חנות ב 4 º C.
    5. הכן 100 מ של להפסיק פתרון (3 M NaOH).
  2. המעיל של חומרי ניקוי:
    1. עבור סרום סה כ איג isotype אליסה, מעיל 96-ובכן חיסונית צלחות עם 10 µg/mL של לכידת עכבר עז polyclonal אנטי איג ספציפי isotype (ז, G1, G2a, G2b, G3, A או E) Abs ב צימוד מאגר (PBS) ב- µL 100/טוב.
    2. עבור ספציפיים TNP איג isotype אליסה, מעיל 96-ובכן חיסונית צלחות עם 10 µg/mL של TNP(38)-BSA ב- PBS ב µL 100/טוב.
    3. על זיקה גבוהה TNP ספציפיים איג isotype אליסה, מעיל 96-ובכן חיסונית צלחות עם 10 µg/mL של TNP(3)-BSA ב- PBS ב µL/טוב 10026. דגירה הלוחות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. לאחר ציפוי דגירה, לשטוף צלחות פי 2 עם µL 200/טוב של PBS-טי לבטל את המאגר לשטוף, כתם יבש הלוחות (הקש על כל צלחת הפוכה על ערימת מגבות נייר) לשטוף אחרי זה.
  4. לחסום את הצלחות: להוסיף 200 µL/טוב של חסימת מאגר (BSA 1% ב- PBS) לתוך הלוחות מצופים, דגירה הלוחות עבור h 1-RT.
  5. בעוד חוסמים הצלחות, להכין דילולים של סטנדרטים isotype איג ודוגמאות סרום במאגר חסימת בצלחת נפרדת, ללא טיפול 96-ובכן-µL 150/טוב.
    1. להכין 250 ננוגרם למ"ל איג isotype סטנדרטים כמו ריכוז רגיל המוצא (St01) ולעשות 7 עד 10 של דילולים טורי 1:2 את הסטנדרטים איג (St02 St07 או St10, איור 2א).
    2. להכין סרום העכבר דגימות-לדילול בטחונות או שבערך גורם בתור התחלה דילול ולגרום 3 או 4 של 1:10 דילולים טורי עבור isotype איג הכולל או 1:5 דילולים טורי עבור isotype איג TNP ספציפיים של כל מדגם סרום (איור 2א). אליסה IgE, להכין העכבר הדוגמאות סרום-גורם לדילול 1:2 בתור התחלה דילול, ולעשות 3 של 1:5 דילולים טורי של כל מדגם סרום.
  6. לאחר חסימת, לשטוף את הצלחות מהשלב 5.4 שלוש פעמים עם 200 µL/טוב של PBS-T, כתם יבש הלוחות לשטוף אחרי זה.
  7. להעביר 100 µL/טוב של סטנדרטים isotype איג מדולל (המתאים עבור לכידת וזיהוי Abs) ואת הדוגמאות סרום מדולל מהשלב 5.5 הלוחות המוכנים בשלב 5.6. דגירה הצלחות עם סטנדרטים של דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  8. לשטוף צלחות 3 פעמים עם 200 µL/טוב של PBS-T, כתם יבש הלוחות לשטוף אחרי זה.
  9. כל צלחת, להוסיף 100 µL/טוב של µg/mL 10 של phosphatase אלקליין המתאים (AP)-עז ספציפי isotype מצומדת העכבר אנטי איג (מ', G1, G2a, G2b, G3, A או E) Abs מדולל במאגר חוסם.
  10. דגירה הצלחות עם Abs מצומדת AP עבור h 1-2-RT. לגילוי IgE, דגירה הלוחות עבור h 1 – 2 ב 37 º C.
  11. להכין 1 מ"ג/מ"ל של המצע פתרון על ידי המסת שתי טבליות של 5 מ"ג מצע פוספטאז ב 10 מ"ל המצע המאגר.
  12. רוחצים כל צלחת 5 פעמים עם 200 µL/טוב של PBS-T את כתם יבש הלוחות לשטוף אחרי זה.
  13. להוסיף 100 µL/טוב של פתרון המצע לתוך כל צלחת. לאפשר את התגובה לפתח ב- RT, אשר בדרך כלל לוקח רק כמה דקות.
  14. לקרוא את כל הצלחת 405 ננומטר באמצעות קורא microplate עם התוכנה המשוייכת שלה.
    1. לחץ על "הגדרות" כדי להגדיר את אורכי הגל "Lm1" ב "405 ננומטר" ולחץ על "אישור".
    2. לחץ על "תבנית" כדי להקצות בארות "ריק", "סטנדרטים" בארות בארות "לא ידוע" לפי הגדרת צלחת 96-ובכן.
    3. וולס "תקני", לחץ על "סדרה" כדי להגדיר את "בדוגמה הראשונה"בשם"St01", בחר "התחל מ"העליון"ולהגדיר"מעתיק"כ-"2". לבדוק"Descripto מדגםr", "ערך סטנדרטי" קלט: בחר "יחידות"בשם"ng/mL", קבע "הערך ההתחלתי" כמו "250", להגדיר "צעד" כ- "2". לחץ על "אישור".
    4. לחץ על "קרא" לקרוא הצלחת כאשר הכי מרוכז מגיע סטנדרטי של צפיפות אופטית (OD) ~ 1.
    5. לחץ על תפריט "קובץ" ולחץ על "שמור" כדי לשמור את הקובץ.
    6. לחץ על "קריאה" כדי לקרוא את הצלחת שוב כאשר תקן הכי מרוכז מתקרב OD405 של ~ 1.5, 2, 2.5, בהתאמה.
  15. לעצור את התגובה על ידי הוספת µL 25/טוב של 3 M NaOH. להשלים שלבים 5.12 כדי 5.15 לצלחת אחת בכל פעם.
  16. ניתוח נתונים אליסה באמצעות התוכנה המשויכים לקורא microplate:
    1. בדוק את הערכים OD405 את הסטנדרטים isotype איג של קבצי קריאה ובחר קריאת המתאים עם טווח ליניארי תקנים עבור ניתוח נתונים מפורטים.
    2. בחר את התוכנית 4-פרמטר מתאים להתוויית עקומות סטנדרטי. בדוק את co-יעיל של העקומה סטנדרטי (R2), אשר נדרש כדי להיות > 0.98 כדי להבטיח איכות הנתונים טובים.
    3. בדוק אם הערכים OD405 של כל דגימה עם הגדלת דילול גורמים ירידה. אחזר את הריכוז של כל בארות מדגם מדולל על ידי לחיצה על "נעלמים".
    4. בחר טוב המתאים של כל דגימה עם OD405 בטווח ליניארי של Ig isotype רגיל העקומה לחישוב ריכוז.
    5. לחשב את הנסיוב איג isotype ריכוז כל דגימה באמצעות הנוסחה: סרום ריכוז Ig = ריכוז טוב נבחר x פקטור דילול.
  17. מגרש גרפים ולבצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנה מתאימה9,10,11. להפוך פיזור אנכי חלקות סרום איג isotype רמות כדי להשוות את התגובות Ig בנקודת זמן זהה. ללימודים תגובת זיכרון TD, להפוך את עקומות תגובת הזמן-קורס לבחון את התגובות isotype איג לפני ואחרי חיסון דחף. השתמש בקווי שגיאה כדי להציג סטיית תקן (SD) של כל קבוצה של דגימות. כדי להשוות Ig תגובות isotype בין שני אחרים של עכברים, השתמש במבחן אינטראקצית t עבור נתונים דו-זנבית כדי לקבוע את מובהקות סטטיסטית. הגדר את p הערך < 0.05 כמו משמעותית שונה.

תוצאות

השתמשנו פרוטוקול זה לחקור את התפקידים של הרגולטור קריטי של המערכת החיסונית, TRAF3, TI ו- TD איג isotype תגובות9,10,11. TRAF3 ישירות או בעקיפין מסדיר את אותות של מספר רצפטורים החיסון מולדים, גמישים, כולל את superfamily הקולטן TNF, רצפטורים כמו ?...

Discussion

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול האפיון של תגובות isotype TD ו- TI Ig בעכברים באמצעות אליסה. יישום מוצלח של פרוטוקול זה מחייב השימוש בחומרים המצוינים בטבלה 1, לרבות חומרי ניקוי assay, חיסונים Ags, נוגדנים ספציפיים isotype איג העכבר ותקני. צריך לקחת כדי להימנע משימוש תרביות רקמה מטופלים צלחות על אליסה. ...

Disclosures

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R01 CA158402 (Xie עמ'), R21 AI128264 (עמ' שיה), ההגנה להעניק W81XWH-13-1-0242 (עמ' שיה), פרס טייס מן סרטן המכון של ניו ג'רזי באמצעות מענק מספר P30CA072720 מן המכון הלאומי לסרטן (Xie עמ'), מענק ביו בוש (Xie עמ'), מלגת Stollar ויקטור (Lalani א), ו B. אן, מלגת ג'יימס נולד ב Leathem (ס' ז'ו).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
VersaMax Tunable Microplate ReaderMDS Analytical TechnologiesVERSAMAXEquipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3MDS Analytical TechnologiesSOFTmax PRO 5.3Software for the plate reader
GraphPad PrismGraphPadPrismSoftware for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL)Biosearch TechnologiesF-1300-10A TI Ag for immunization
TNP-KLHBiosearch TechnologiesT-5060-5A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSABiosearch TechnologiesT-5050-10 (conjugation ratio: 38)Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSABiosearch TechnologiesT-5050-10 (conjugation ratio: 3)Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject AlumFisher Scientific PI-77161Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubesFisher Scientific 14-959-11AFor incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin SyringeFisher Scientific 14-829-1BFor i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-BottomFisher Scientific 14-245-61For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-BottomVWR82050-622For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg TabletsSigmaS0942-200TABAP substrate
DiethanolamineVWRIC15251690A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgMSouthernBiotech1020-01Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1SouthernBiotech1070-01Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2aSouthernBiotech1080-01Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2bSouthernBiotech1090-01Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3SouthernBiotech1100-01Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgASouthernBiotech1040-01Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgESouthernBiotech1110-01Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgMSouthernBiotech1020-04Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1SouthernBiotech1070-04Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2aSouthernBiotech1080-04Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2bSouthernBiotech1090-04Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3SouthernBiotech1100-04Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgASouthernBiotech1040-04Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgESouthernBiotech1110-04Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standardBD Biosciences553472TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standardBD Biosciences554054TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standardBD Biosciences556651TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standardBD Biosciences554055TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standardBD Biosciences553486KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standardBD Biosciences550924Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standardBD Biosciences557079TNP-specific IgE, Clone  C38-2

References

  1. Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
  2. Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
  3. Murphy, K. . Janeway's Immunobiology. 8th Edition. 1, (2012).
  4. Vinuesa, C. G., Chang, P. P. Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nature Immunology. 14, 119-126 (2013).
  5. Bekeredjian-Ding, I., Jego, G. Toll-like receptors--sentries in the B-cell response. Immunology. 128, 311-323 (2009).
  6. Mond, J. J., Lees, A., Snapper, C. M. T cell-independent antigens type 2. Annual Review of Immunology. 13, 655-692 (1995).
  7. Garcia de Vinuesa, C., O'Leary, P., Sze, D. M., Toellner, K. M., MacLennan, I. C. T-independent type 2 antigens induce B cell proliferation in multiple splenic sites, but exponential growth is confined to extrafollicular foci. European Journal of Immunology. 29, 1314-1323 (1999).
  8. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nature Reviews Immunology. 15, 149-159 (2015).
  9. Xie, P., Stunz, L. L., Larison, K. D., Yang, B., Bishop, G. A. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 is a critical regulator of B cell homeostasis in secondary lymphoid organs. Immunity. 27, 253-267 (2007).
  10. Xie, P., Kraus, Z. J., Stunz, L. L., Liu, Y., Bishop, G. A. TNF Receptor-Associated Factor 3 Is Required for T Cell-Mediated Immunity and TCR/CD28 Signaling. The Journal of Immunology. 186, 143-155 (2011).
  11. Lalani, A. I., Moore, C. R., Luo, C., Kreider, B. Z., Liu, Y., Morse, H. C., Xie, P. Myeloid Cell TRAF3 Regulates Immune Responses and Inhibits Inflammation and Tumor Development in Mice. The Journal of Immunology. 194, 334-348 (2015).
  12. Lee, S., Nguyen, M. T. Recent advances of vaccine adjuvants for infectious diseases. Immune Network. 15, 51-57 (2015).
  13. Gavin, A. L., Hoebe, K., Duong, B., Ota, T., Martin, C., Beutler, B., Nemazee, D. Adjuvant-enhanced antibody responses in the absence of toll-like receptor signaling. Science. 314, 1936-1938 (2006).
  14. Klinman, D. M., Currie, D., Gursel, I., Verthelyi, D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunological Reviews. 199, 201-216 (2004).
  15. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133, 12 (2013).
  16. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77, 98-101 (2016).
  17. Nencini, F., Pratesi, S., Petroni, G., Matucci, A., Maggi, E., Vultaggio, A. Assays and strategies for immunogenicity assessment of biological agents. Drug Development Research. 75, 4-6 (2014).
  18. Haber, E., Page, L. B., Richards, F. F. Radio immunoassay employing gel filtration. Analytical Biochemistry. 12, 163-172 (1965).
  19. Yalow, R. S., Berson, S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. 1960. Obesity Research. 4, 583-600 (1996).
  20. Lequin, R. M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51, 2415-2418 (2005).
  21. Wreghitt, T. G., Tedder, R. S., Nagington, J., Ferns, R. B. Antibody assays for varicella-zoster virus: comparison of competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), competitive radioimmunoassay (RIA), complement fixation, and indirect immunofluorescence assays. Journal of Medical Virology. 13, 361-370 (1984).
  22. Mathew, B. C., Biju, R. S., Thapalia, N. An overview of electrochemiluminescent (ECL) technology in laboratory investigations. Kathmandu University Medical Journal. 3, 91-93 (2005).
  23. Mikulskis, A., Yeung, D., Subramanyam, M., Amaravadi, L. Solution ELISA as a platform of choice for development of robust, drug tolerant immunogenicity assays in support of drug development. The Journal of Immunological Methods. 365, 38-49 (2011).
  24. Wadhwa, M., Bird, C., Dilger, P., Gaines-Das, R., Thorpe, R. Strategies for detection, measurement and characterization of unwanted antibodies induced by therapeutic biologicals. The Journal of Immunological Methods. 278, 1-17 (2003).
  25. Wolforth, J. B. Methods of Blood Collection in the Mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  26. Stunz, L. L., Busch, L. K., Munroe, M. E., Sigmund, C. D., Tygrett, L. T., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A. Expression of the Cytoplasmic Tail of LMP1 in Mice Induces Hyperactivation of B Lymphocytes and Disordered Lymphoid Architecture. Immunity. 21, 255-266 (2004).
  27. Xie, P. TRAF molecules in cell signaling and in human diseases. Journal of Molecular Signaling. 8, 7 (2013).
  28. Lalani, A. I., Zhu, S., Gokhale, S., Jin, J., Xie, P. TRAF molecules in inflammation and inflammatory diseases. Current Pharmacology Reports. 4, 64-90 (2018).
  29. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist Reviews. 25, 105-120 (2004).
  30. Specter, S., Friedman, H. Age- and sex-related differences in antibody formation and blastogenic responsiveness of splenocytes from RIII mice developing virus-induced mammary adenocarcinoma. The Journal of the National Cancer Institute. 67, 1347-1351 (1981).
  31. Giefing-Kroll, C., Berger, P., Lepperdinger, G., Grubeck-Loebenstein, B. How sex and age affect immune responses, susceptibility to infections, and response to vaccination. Aging Cell. 14, 309-321 (2015).
  32. Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. International Immunology. 19, 545-556 (2007).
  33. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Veterinary Pathology. 49, 32-43 (2012).
  34. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 47, 283-293 (2006).
  35. Vlkova, M., Rohousova, I., Hostomska, J., Pohankova, L., Zidkova, L., Drahota, J., Valenzuela, J. G., Volf, P. Kinetics of antibody response in BALB/c and C57BL/6 mice bitten by Phlebotomus papatasi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6, 1719 (2012).
  36. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172, 2731-2738 (2004).
  37. Ruane, D., Chorny, A., Lee, H., Faith, J., Pandey, G., Shan, M., Simchoni, N., Rahman, A., Garg, A., Weinstein, E. G., et al. Microbiota regulate the ability of lung dendritic cells to induce IgA class-switch recombination and generate protective gastrointestinal immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 213, 53-73 (2016).
  38. Chorny, A., Puga, I., Cerutti, A. Innate signaling networks in mucosal IgA class switching. Advances in Immunology. 107, 31-69 (2010).
  39. Van Praet, J. T., Donovan, E., Vanassche, I., Drennan, M. B., Windels, F., Dendooven, A., Allais, L., Cuvelier, C. A., van de Loo, F., Norris, P. S., et al. Commensal microbiota influence systemic autoimmune responses. The EMBO Journal. 34, 466-474 (2015).
  40. Nguyen, Q. N., Himes, J. E., Martinez, D. R., Permar, S. R. The Impact of the Gut Microbiota on Humoral Immunity to Pathogens and Vaccination in Early Infancy. PLOS Pathogens. 12, 1005997 (2016).
  41. Jeevan-Raj, B. P., Robert, I., Heyer, V., Page, A., Wang, J. H., Cammas, F., Alt, F. W., Losson, R., Reina-San-Martin, B. Epigenetic tethering of AID to the donor switch region during immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 208, 1649-1660 (2011).
  42. Chen, Z., Getahun, A., Chen, X., Dollin, Y., Cambier, J. C., Wang, J. H. Imbalanced PTEN and PI3K Signaling Impairs Class Switch Recombination. The Journal of Immunology. 195, 5461-5471 (2015).
  43. Boboila, C., Yan, C., Wesemann, D. R., Jankovic, M., Wang, J. H., Manis, J., Nussenzweig, A., Nussenzweig, M., Alt, F. W. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of Experimental Medicine. 207, 417-427 (2010).
  44. Shah, H. B., Koelsch, K. A. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods in Molecular Biology. 1312, 419-426 (2015).
  45. Bonsignori, M., Moody, M. A. Simultaneous Detection of Antigen-Specific IgG- and IgM-Secreting Cells with a B Cell Fluorospot Assay. Cells. 1, 15-26 (2012).
  46. Sasaki, Y., Derudder, E., Hobeika, E., Pelanda, R., Reth, M., Rajewsky, K., Schmidt-Supprian, M. Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Immunity. 24, 729-739 (2006).
  47. Goodlad, J. R., Macartney, J. C. Germinal-center cell proliferation in response to T-independent antigens: a stathmokinetic, morphometric and immunohistochemical study in vivo. European Journal of Immunology. 25, 1918-1926 (1995).
  48. Xie, P., Poovassery, J., Stunz, L. L., Smith, S. M., Schultz, M. L., Carlin, L. E., Bishop, G. A. Enhanced Toll-like receptor (TLR) responses of TNFR-associated factor 3 (TRAF3)-deficient B lymphocytes. Journal of Leukocyte Biology. 90, 1149-1157 (2011).
  49. Kaku, H., Horikawa, K., Obata, Y., Kato, I., Okamoto, H., Sakaguchi, N., Gerondakis, S., Takatsu, K. NF-kappaB is required for CD38-mediated induction of C(gamma)1 germline transcripts in murine B lymphocytes. International Immunology. 14, 1055-1064 (2002).
  50. Dudley, D. D., Chaudhuri, J., Bassing, C. H., Alt, F. W. Mechanism and control of V(D)J recombination versus class switch recombination: similarities and differences. Advances in Immunology. 86, 43-112 (2005).
  51. Lange, H., Hecht, O., Zemlin, M., Trad, A., Tanasa, R. I., Schroeder, H. W., Lemke, H. Immunoglobulin class switching appears to be regulated by B-cell antigen receptor-specific T-cell action. European Journal of Immunology. 42, 1016-1029 (2012).
  52. Moore, C. R., Liu, Y., Shao, C. S., Covey, L. R., Morse, H. C., Xie, P. Specific deletion of TRAF3 in B lymphocytes leads to B lymphoma development in mice. Leukemia. 26, 1122-1127 (2012).
  53. Bergmann, B., Grimsholm, O., Thorarinsdottir, K., Ren, W., Jirholt, P., Gjertsson, I., Martensson, I. L. Memory B cells in mouse models. Scandinavian Journal of Immunology. 78, 149-156 (2013).
  54. McHeyzer-Williams, L. J., Milpied, P. J., Okitsu, S. L., McHeyzer-Williams, M. G. Class-switched memory B cells remodel BCRs within secondary germinal centers. Nature Immunology. 16, 296-305 (2015).
  55. Elgueta, R., Marks, E., Nowak, E., Menezes, S., Benson, M., Raman, V. S., Ortiz, C., O'Connell, S., Hess, H., Lord, G. M., et al. CCR6-dependent positioning of memory B cells is essential for their ability to mount a recall response to antigen. The Journal of Immunology. 194, 505-513 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

139TDTIIgisotypeimmunosorbent assay

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved