JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем документе мы описываем протокол для характеристики Т-зависимых и T-независимой иммуноглобулина (Ig) изотипа ответы в мышах с помощью ИФА. Этот метод используется в одиночку или в сочетании с потоком цитометрии позволит исследователям для выявления различий в ответах изотипа Ig B клеточный мышей после иммунизации антигена Т-зависимых и T-независимой.

Аннотация

Антитела, также называют как иммуноглобулины (Ig), выделяемый продифференцировано лимфоциты, клетки plasmablasts/плазмы, гуморальный иммунитет обеспечивают грозным защиту против вторжения патогены через различные механизмы. Одна из основных целей вакцинации является заставить защитный антиген специфические антитела для предотвращения опасных для жизни инфекций. Тимус зависимые (TD) и тимус независимые (TI) антигены можно добиться надежной реакции антиген специфически IgM и может также вызвать производство коммутацией isotype антитела (IgG, IgA и IgE) а также генерации клеток памяти B с помощью предоставляемые антиген представляющих клеток (БТР). Здесь мы описываем протокол характеризовать TD и TI Ig изотипа ответы в мышей, используя энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA). В настоящем Протоколе TD и TI Ig ответы вызвал у мышей внутрибрюшинного (и.п.) иммунизации с антигенами конъюгированных Гаптены модель TNP-KLH (в квасцы) и ТНП полисахарида (в PBS), соответственно. Чтобы заставить TD памяти ответ, руля иммунизации TNP-KLH в квасцов дается на 3 недели после первой иммунизации с же антигена/адъювант. Sera мыши собирают в разное время точек до и после иммунизации. Всего в сыворотке Ig и ТНП специфические антитела являются впоследствии количественно с использованием сэндвич isotype специфических Ig и косвенные ELISA, соответственно. Чтобы правильно определить сывороточной концентрации каждого изотипа Ig, образцы необходимо надлежащим образом быть разбавлен по размеру в пределах диапазона линейной стандартных кривых. Используя этот протокол, мы последовательно получить надежные результаты с высокой специфичности и чувствительности. При использовании в комбинации с другими взаимодополняющими методами проточной цитометрии, в пробирке культуры splenic клетки B и иммуногистохимическое окрашивание (IHC), этот протокол позволит исследователям получить всеобъемлющее представление о антитела ответы в данной экспериментальной обстановке.

Введение

Лимфоциты являются основным игроком в гуморального иммунитета и единственный тип клеток млекопитающих, которые способны производить антитела, также называются иммуноглобулины (Ig)1,2. Антитела секретным клетками B обеспечивают грозным защиту против вторжения патогены через различные механизмы, включая обезвреживание, опсонизацию и активации комплемента, ведущих к защитного иммунитета3. Секреция антител клетками B достигается только после полной активации конкретных клеток B, которая обычно требует двух различных сигналов3. B клеточного рецептора (BCR) выразил на поверхности клеток конкретных наивный B3путем прямого связывания антигена (Ag) передается сигнал 1. В зависимости от источника сигнала 2 клетки B активации можно разделить на тимус зависимые (ТД) или тимус независимые (TI)3,4. В ответ антигена TD 2 сигнала обеспечивается активированные родственных CD4 T вспомогательный (TH) клетки, которые Экспресс CD154, лигандом CD40 выразил на B клетки1,2,3co-stimulatory рецептор. В ответ TI антигена, сигнал 2 приходит от либо участия Толл подобные рецепторы (TLRs в случае типа 1 TI Ag) или обширные cross-linking БКРС (в случае 2 типа TI Ag) на B-клеток3,4. Тип 1 TI (TI-1) антигены являются микробной лигандами TLRs, включая бактериальных липополисахаридов (LPS), вирусной РНК и микробных CpG ДНК4,5. Антигены TI (TI-2) тип 2 имеют очень повторяющихся структуру и способны доставить длительное и стойких сигнализации B ячейку на несколько cross-linking БКРС4,6. Типичными примерами TI-2 антигенов пневмококковой полисахаридов и конъюгированных Гаптены полисахарид6,7. ТД и TI антигены можно добиться надежной реакции антиген специфически IgM и может также вызвать производство коммутацией isotype антитела (IgG, IgA и IgE) с помощью, предоставляемой антиген представляющих клеток (БТР), таких как дендритные клетки (DCs)1 ,2,3. Кроме того TD и TI антигены способны вызвать памяти ответы с помощью АСУ ТП, но TD антигены являются более эффективными в склонение памяти клетки B поколение3,8.

В этом протоколе TD и TI Ig ответы являются вызвало у мышей внутрибрюшинного (и.п.) иммунизации с конъюгированных Гаптены модель антигены 2,4,6-trinitrophenyl-замочной скважины магнитные Гемоцианин (ТНП-KLH) и ТНП полисахарида (нейтральный, сильно ветвистый и высокой масса), соответственно9,10,11. ТД антигены обычно используются с адъювантом для расширения производства антител12. Здесь в нашем протокол, ТНП-KLH вводят квасцов, часто используемых адъювант в иммунизации исследования12. Другие примеры адъювантов, которые могут быть использованы в полной или неполной адъювантной Фройнд 's (CFA или IFA), A монофосфатный липидов / Трегалоза dicorynomycolate («РМБИ» адъювантной) и CpG oligodeoxynucleotides,, и т.д.13 14. после иммунизации, сера мыши собирают в разное время точек и ТНП специфических антител в сыворотке количественно с помощью Ig изотипа специфичные иммуноферментного анализа (ИФА)9,10, 11.

ELISA является на основе плиты assay, который широко используется в качестве инструмента диагностики в медицине, а также аналитический инструмент в биомедицинских исследований,1516. Он используется для обнаружения и количественного определения аналитов включая антитела, гормоны, цитокины, chemokines и различные антигены и т.д. ELISA может выполняться в нескольких различных форматах, в том числе прямые, косвенные, сэндвич и конкурентоспособной ELISA15,16. В общем он включает иммобилизации антигена к твердой поверхности, обычно микротитровальных 96-луночных пластины, которые инкубировали с основного антитела. После инкубации несвязанные антитела смыты. В прямой ELISA, основное антитело непосредственно конъюгированных для фермента (обычно пероксидаза или щелочной фосфатазы), которые могут расщеплять Хромогенный субстрат приносить видимый цвет изменения, такие как определяется документом обнаружения сигнала Спектрофотометр15,16. Напротив если энзим соединенный вторичные антитела используется для связывания основное антитело, то это рассматривается как косвенные ELISA15,16. Прямые ELISA является быстрее, тогда как косвенные ELISA является более чувствительным15,16. В сэндвич ELISA пластины покрыты «захват» антитела используются для иммобилизации антигена интереса в образцах, а затем захватили антиген может быть обнаружен еще один «обнаружения» антител в прямой или косвенной форме15, 16. сэндвич ELISA предлагает высокую специфичность, так как обнаружено два различных антител антигена антиген. В конкурентных ELISA конкурс устанавливается между образца антигена и плита прыгните антигена для привязки к основное антитело, а затем концентрации антигена в образце количественно измеряя снижение сигнала от субстрата 15 , 16. конкурентные ELISA может производиться с использованием упомянутых выше прямого или косвенного формат и полезен для обнаружения небольших антигены с только один epitope15,16.

Альтернативные методы для измерения антитела включают в себя радио-иммуноферментного анализа (RIA), electrochemiluminescence (ЭСЛ) пробирного и поверхности плазмон резонанса (СРП) пробирного17. РИА был первый иммуноанализа разработали что меры присутствие антигена (или антитела) с высокой специфичности и чувствительности с использованием radiolabeled реагенты18,19. Однако из-за проблем радиоактивных токсичности, затраты на утилизацию, срок годности и специальных лицензий для работы с радиоактивными материалами, ELISA лучше и более удобный метод для распространенных использует20,21. ECL является весьма деликатным методом в котором инициируются с помощью электричества для создания высокой реакционной способностью видов из стабильных прекурсоров на поверхности электрода хемилюминесцентный реакции и может использоваться для измерения количества аналитов (таких как антигены или антитела)22. Однако ЭСЛ требует специального инструмента и таким образом не используется так широко как Элиза23. СРП является прямым assay, который может использоваться для измерения Связывание лиганда (например., антитела) для иммобилизованных молекул (например., антигены) на сенсоре чип поверхности24. СРП очень конкретно определяет взаимодействия в режиме реального времени и не требует использования маркированных реагентов как ELISA. Однако SPR также требует специального оборудования и имеет более низкую чувствительность чем ELISA17. Ввиду ограничений, обусловленных альтернативных методов, ELISA является наиболее подходящим и удобным для нашей цели в настоящем Протоколе. Здесь мы описывают использование сэндвич ELISA для анализа общего уровня изотипа Ig и процедурах косвенного ELISA для анализа антиген специфические Ig изотипов.

протокол

Этот протокол соответствует руководящим принципам Комитета по этике институциональных исследований на животных по Rutgers University. Все мыши используются в соответствии с низ руководящие принципы и животных протоколом, утвержденным на институциональный уход животных и использования Комитетом.

1. Подготовка мышей и Коллекция наивного мыши Sera

  1. Держите всех мышей для иммунизации экспериментов в конкретного возбудителя бесплатный животных фонда.
  2. Использование пола согласованной, молодых взрослых (8-12 недель) нокаут и помёте контроль мышей, которые разделяют те же родители и клетки для иммунизации исследований.
  3. План иммунизации и расписание сбора сыворотки, как показано на рисунке 1.
  4. Урожай наивно сыворотки каждой мыши на 7 дней (-7 дней) до иммунизации. Выполните процедуры ретро орбиталь кровотечение и сыворотки подготовки как описано ниже в шаге 4.

2. Подготовка TNP-полисахарида (TI антигена) и ТНП KLH (TD антиген)

  1. Растворите антигена порошков в стерильных PBS (рН 7,4) тщательно, чтобы сделать 0.5 мг/мл TNP-полисахарида запасов и 1 мг/мл TNP-KLH фондовых решений. Аликвота каждый антиген складе решения в пробки microfuge стерильные на 0,5 мл и держать аликвоты на-80 ° C для длительного хранения. Избегайте несколько замораживания и оттаивания аликвоты антигена.
  2. В день инъекции, рассчитать объем TNP-полисахарида (50 мкг/100 мкл/мышь) или TNP-KLH согласно количество мышей (100 мкг/100 мкл/мышь) необходимо вводить. Оттепель соответствующее количество TNP-полисахарида или TNP-KLH аликвоты при комнатной температуре (RT).
  3. Для ТНП-KLH инъекций сначала разбавляют квасцов адъювантной (40 мг/мл) 3 тома из стерильных PBS до конечной концентрации 10 мг/мл. Убедитесь, что смесь адъювантной квасцов хорошо приостановлено до растворения.
  4. Объединить равным объемом 10 мг/мл квасцов адъювант суспензии из шага 2.3 и талой TNP-KLH раствор (1 мг/мл) в 5 мл полипропиленовые трубы, хорошо перемешать и инкубировать при 37 ° C за 30 минут подготовить этот TNP-KLH/квасцов Смешайте свежую до инъекции.

3. Иммунизация мышей

  1. Выполнение инъекции внутрибрюшинного (и.п.) TNP-полисахарида или TNP-KLH/квасцов иммунизировать мышей с 1 мл инсулиновые шприцы в кабинете биобезопасности. Вставьте иглу примерно под углом 30°, предпочтительно в нижнем правом квадранте каждой мыши, чтобы предотвратить инъекции в внутренних органов.
  2. Придать и.п. 100 мкл TNP-полисахарид на мышь на день 0 для иммунизации TI Ag (рис. 1А).
  3. Придать и.п. 200 мкл TNP-KLH/квасцов смеси (свежеприготовленные на шаге 2.4) на мышь на день 0 для TD Ag иммунизации. Повторите же инъекции на 21 день как руля иммунизации для исследования памяти (рис. 1Б).
  4. После инъекции возвращение каждой мыши в его клетке и держать все вводили мышам в состоянии определенного возбудителя бесплатно.

4. ретро орбиталь кровотечение и подготовка сыворотки

  1. Урожай мыши Сера в разное время точках: TNP-полисахарида иммунизации, собирать мыши сывороток на день -7 и 7 (рис. 1А); TNP-KLH/квасцов иммунизации Соберите мыши сывороток на день -7, 7, 14 и 28 (рис. 1Б).
  2. Для ретро орбиталь кровотечение анестезировать каждой мыши с изофлюрановая 5% для 1 – 2 мин в кабинет биобезопасности25. Выполняйте педали рефлекс для обеспечения адекватной анестезии каждой мыши.
  3. Удерживайте кнопку мыши, осознающие в одной руке с указательным и большим пальцем, потянув кожу вокруг глазного яблока, назад, так что глазного яблока выступает из сокета25. Вставка номера гепаринизированным пипетка Пастера или капиллярную трубку под углом 45 °, во внутреннем углу глазницы под глазного яблока25.
  4. Применять нежные понижательное давление и вращайте пипетки или трубку осторожно, чтобы ворваться в Вену и собрать 150 – 200 мкл крови в пипетку или трубки. Немедленно передать трубу отцентрифугировать стерильные 1,5 мл крови и вернуть его клетке, чтобы восстановить мыши.
  5. Пусть образцы сидеть на RT для 1-2 ч до коагуляции крови.
  6. Центрифугуйте образцы коагулированного крови на 13 000 x g 10 мин при 4 ° C. Передать новые трубки отцентрифугировать стерильные 1,5 мл четких сыворотка поверх сгусток крови.
  7. Повторите шаг 4.6 еще один раз, чтобы удалить остаточные сгусток крови и собирать четких сыворотка.
  8. Алиготе сыворотки в пробки microfuge стерильные 1,5 мл на 50 мкл/трубки и хранить сыворотки-80 ° c.
  9. Альтернативные глаз кровотечения в разное время точек, таким образом, чтобы каждый глаз Блед максимум дважды в течение всего эксперимента. На терминале кровотечение Соберите до 1 мл крови от каждой мыши до эвтаназии. Усыпить мышь с 5% CO2 следуют шейки матки дислокации.
    Примечание: Splenic клетки могут быть собраны для потока гранулярных анализы и в пробирке исследования культуры. Мы также готовим геномной ДНК от splenocytes проверить генотип каждой мыши.

5. мыши Ig изотипа специфичные ELISA

  1. Подготовьте буферов и решения перед ELISA.
    1. Подготовка 500 мл муфты буфера (PBS, рН 7,4).
    2. Подготовка 500 мл промывочного раствора (PBS-T (0,05% 20 анимации), рН 7,4).
    3. Подготовка 100 мл блокирование буфера (1% BSA в PBS, рН 7,4, температуре 4 ° C).
    4. Подготовка 1 Л субстрата буфера (1 M Диэтаноламина, pH 9,8 (97 мл Диэтаноламина в 1 Л H2O, рН, скорректированы с помощью 10 М HCl) и 0,5 мм MgCl2). Защите субстрат буфера от света, заключив бутылки с алюминиевой фольгой. Хранить при 4 ° C.
    5. Подготовка 100 мл раствора (3 M NaOH) стоп.
  2. Слой пластины ELISA:
    1. Для всего сыворотки изотипа Ig ELISA, пальто 96-луночных иммуно пластины с 10 мкг/мл isotype-конкретных захвата поликлональных коза анти мыши Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A или E) Abs в муфты буфера (PBS) на 100 мкл/хорошо.
    2. Для изотипа Ig TNP-конкретных ELISA пальто 96-луночных иммуно пластины с 10 мкг/мл ТНП(38)- BSA в PBS на 100 мкл/хорошо.
    3. Для высоким сродством изотипа Ig TNP-конкретных ELISA пальто 96-луночных иммуно пластины с 10 мкг/мл ТНП(3)- BSA в PBS на 100 мкл/хорошо26. Инкубируйте пластины на 4 ° C на ночь.
  3. После инкубации покрытие мыть тарелки 2 раза с 200 мкл/хорошо PBS-t. Отменить буфера мытья и пятно сухой плиты (Коснитесь каждую пластину вниз в стеке бумажных полотенец) после каждой стирки.
  4. Блок пластин: добавить 200 мкл/хорошо блокирование буфера (1% BSA в PBS) в пластины с покрытием и инкубировать пластины для 1 h на RT.
  5. В то время как блокирование пластины, подготовьте разведений стандартов изотипа Ig и образцов сыворотки в блокирование буфера в отдельный, неочищенные 96-луночных пластины на 150 мкл/хорошо.
    1. Подготовить стандарты изотипа Ig 250 нг/мл в качестве отправной стандартной концентрации (St01) и сделать 7 – 10 1:2 серийных разведений Ig стандартов (St02 St07 или St10, Рисунок 2A).
    2. Подготовьте мыши сыворотки пробах в разведении 1: 100 или 1: 500 фактор как начального разбавления и сделать 3 или 4 в 1:10 серийных разведений для всего изотипа Ig или 1:5 серийных разведений для изотипа Ig TNP-конкретных каждого образца сыворотки (рисA). Для МГЭ ELISA подготовить образцы сыворотки мыши на коэффициент разбавления 1:2 как начального разбавления и сделать 3 1:5 серийных разведений каждого образца сыворотки.
  6. После блокирования, мыть тарелки из шага 5.4 три раза с 200 мкл/хорошо PBS-t и помарки сухой плиты после каждой стирки.
  7. Передавать 100 мкл/также разреженных стандартов изотипа Ig (подходит для захвата и обнаружения Abs) и пробы разреженных сыворотки из шага 5.5 пластины, подготовленный на шаге 5.6. Инкубируйте пластины с стандарты и образцы на 4 ° C на ночь.
  8. Мыть тарелки 3 раза с 200 мкл/хорошо PBS-t и помарки сухой пластины после каждой стирки.
  9. В каждой пластинке, добавить 100 мкл/колодец 10 мкг/мл соответствующие щелочной фосфатазы (AP)-конъюгированных изотипа специфичные коза анти мыши Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A, или E) Abs, разбавленных в блокировки буфера.
  10. Инкубировать пластины с AP-конъюгированных Abs для 1-2 ч на RT. Для обнаружения IgE Инкубируйте пластины для 1-2 ч при 37 ° C.
  11. Подготовка 1 мг/мл раствора субстрата, растворяя две таблетки фосфатазы субстрата 5 мг в 10 мл буфера субстрата.
  12. Вымойте каждой пластины 5 раз с 200 мкл/хорошо PBS-t и помарки сухой плиты после каждой стирки.
  13. Добавьте 100 мкл/колодец раствора субстрата в каждой плиты. Разрешить реакции развиваются в РТ, которая обычно занимает всего несколько минут.
  14. Прочитайте каждую пластину на 405 нм, используя Считыватель микропланшетов с соответствующего программного обеспечения.
    1. Нажмите кнопку «Параметры» для задания длины волн «Lm1» на "405 нм» и нажмите «OK».
    2. Нажмите кнопку «шаблон», чтобы назначить «пустой» колодцев, скважин «стандартов» и «неизвестный» скважин согласно 96-луночных плиты установки.
    3. Для скважин «стандарты» нажмите «серии», чтобы задать «Первый образец«как «St01», выберите «Начать с» на «верхней» и установить «воспроизводит» как «2». Проверка «Образец Descriptor» и ввода «Стандартное значение»: выберите «единицы«как «нг/мл», набор «начальная стоимость» как «250», набор «шаг» как «2». Нажмите кнопку «ОК».
    4. Нажмите кнопку «Read» читать пластины, когда наиболее сосредоточены стандартных достигает оптической плотности (OD) ~ 1.
    5. Выберите меню «файл» и нажмите кнопку «сохранить» для сохранения файла.
    6. Нажмите кнопку «Чтение» для чтения пластину снова, когда наиболее концентрированным стандартных подходов OD405 ~ 1.5, 2, 2.5, соответственно.
  15. Остановите реакции, добавив 25 мкл/хорошо 3 M NaOH. Выполните шаги 5.12 до 5.15 одной пластины одновременно.
  16. Анализа ELISA данных с использованием программного обеспечения, связанные с Считыватель микропланшетов:
    1. Проверьте значения OD405 стандартов изотипа Ig чтения файлов и выберите соответствующий чтения с хорошей линейный диапазон стандартов для детального анализа данных.
    2. Выберите программу установки 4-параметр Печать стандартных кривых. Проверьте co эффективный стандартной кривой (R2), которая должна быть > 0,98 для обеспечения качества данных.
    3. Проверьте ли OD405 значения каждого образца уменьшаться с увеличением разведения факторов. Извлечь концентрация всех разреженных образца скважин, нажав «Неизвестными».
    4. Выберите соответствующий хорошо каждого образца с OD405 диапазона линейной калибровочной кривой изотипа Ig для расчета концентрации.
    5. Рассчитать сыворотке концентрацию изотипа Ig каждого образца, используя формулу: Сыворотка концентрация Ig = выбранный хорошо концентрация x коэффициент разрежения.
  17. Печать графиков и проводить статистический анализ с использованием соответствующего программного обеспечения по9,10,11. Сделайте вертикальной точечной графики сыворотки уровнях изотипа Ig для сравнения Ig ответы на один и тот же момент времени. Для TD памяти ответа исследования сделайте время курс ответ кривых для изучения ответов изотипа Ig, до и после руля иммунизации. Использование погрешностей, чтобы показать стандартное отклонение (SD) каждой группы образцов. Чтобы сравнить ответы изотипа Ig между двумя генотипов мышей, используйте непарных t тест для двустороннее данных для определения статистической значимости. Установите значение < 0,05 p как существенно разные.

Результаты

Мы использовали этот протокол для расследования роли критической регулятор иммунной системы, TRAF3, TI и TD иг изотипа ответы9,10,11. TRAF3 прямо или косвенно регулирует трансдукции сигнала целого ряда врожденная и адаптивного...

Обсуждение

Здесь мы описываем протокол для характеризации TD и TI Ig изотипа ответов в мышах с помощью ИФА. Успешное осуществление этого протокола требует использования материалов, указанных в таблице 1, включая ELISA пробирного пластины, иммунизации Ags, мыши изотипа Ig-антитела и стандартов. Сл...

Раскрытие информации

Авторы имеют без финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано национальными институтами здравоохранения грантов R01 CA158402 (P. Xie) и R21 AI128264 (P. Xie), Министерство обороны Грант W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), пилот награду от рака института Нью-Джерси через Грант номер P30CA072720 от национального института рака (P. Xie), Буш биомедицинских Грант (P. Xie), Виктор Stollar стипендий (A. Лалани) и Анна б. и Джеймс б. Leathem стипендий (S. Zhu).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
VersaMax Tunable Microplate ReaderMDS Analytical TechnologiesVERSAMAXEquipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3MDS Analytical TechnologiesSOFTmax PRO 5.3Software for the plate reader
GraphPad PrismGraphPadPrismSoftware for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL)Biosearch TechnologiesF-1300-10A TI Ag for immunization
TNP-KLHBiosearch TechnologiesT-5060-5A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSABiosearch TechnologiesT-5050-10 (conjugation ratio: 38)Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSABiosearch TechnologiesT-5050-10 (conjugation ratio: 3)Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject AlumFisher Scientific PI-77161Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubesFisher Scientific 14-959-11AFor incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin SyringeFisher Scientific 14-829-1BFor i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-BottomFisher Scientific 14-245-61For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-BottomVWR82050-622For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg TabletsSigmaS0942-200TABAP substrate
DiethanolamineVWRIC15251690A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgMSouthernBiotech1020-01Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1SouthernBiotech1070-01Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2aSouthernBiotech1080-01Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2bSouthernBiotech1090-01Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3SouthernBiotech1100-01Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgASouthernBiotech1040-01Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgESouthernBiotech1110-01Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgMSouthernBiotech1020-04Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1SouthernBiotech1070-04Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2aSouthernBiotech1080-04Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2bSouthernBiotech1090-04Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3SouthernBiotech1100-04Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgASouthernBiotech1040-04Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgESouthernBiotech1110-04Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standardBD Biosciences553472TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standardBD Biosciences554054TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standardBD Biosciences556651TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standardBD Biosciences554055TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standardBD Biosciences553486KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standardBD Biosciences550924Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standardBD Biosciences557079TNP-specific IgE, Clone  C38-2

Ссылки

  1. Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
  2. Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
  3. Murphy, K. . Janeway's Immunobiology. 8th Edition. 1, (2012).
  4. Vinuesa, C. G., Chang, P. P. Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nature Immunology. 14, 119-126 (2013).
  5. Bekeredjian-Ding, I., Jego, G. Toll-like receptors--sentries in the B-cell response. Immunology. 128, 311-323 (2009).
  6. Mond, J. J., Lees, A., Snapper, C. M. T cell-independent antigens type 2. Annual Review of Immunology. 13, 655-692 (1995).
  7. Garcia de Vinuesa, C., O'Leary, P., Sze, D. M., Toellner, K. M., MacLennan, I. C. T-independent type 2 antigens induce B cell proliferation in multiple splenic sites, but exponential growth is confined to extrafollicular foci. European Journal of Immunology. 29, 1314-1323 (1999).
  8. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nature Reviews Immunology. 15, 149-159 (2015).
  9. Xie, P., Stunz, L. L., Larison, K. D., Yang, B., Bishop, G. A. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 is a critical regulator of B cell homeostasis in secondary lymphoid organs. Immunity. 27, 253-267 (2007).
  10. Xie, P., Kraus, Z. J., Stunz, L. L., Liu, Y., Bishop, G. A. TNF Receptor-Associated Factor 3 Is Required for T Cell-Mediated Immunity and TCR/CD28 Signaling. The Journal of Immunology. 186, 143-155 (2011).
  11. Lalani, A. I., Moore, C. R., Luo, C., Kreider, B. Z., Liu, Y., Morse, H. C., Xie, P. Myeloid Cell TRAF3 Regulates Immune Responses and Inhibits Inflammation and Tumor Development in Mice. The Journal of Immunology. 194, 334-348 (2015).
  12. Lee, S., Nguyen, M. T. Recent advances of vaccine adjuvants for infectious diseases. Immune Network. 15, 51-57 (2015).
  13. Gavin, A. L., Hoebe, K., Duong, B., Ota, T., Martin, C., Beutler, B., Nemazee, D. Adjuvant-enhanced antibody responses in the absence of toll-like receptor signaling. Science. 314, 1936-1938 (2006).
  14. Klinman, D. M., Currie, D., Gursel, I., Verthelyi, D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunological Reviews. 199, 201-216 (2004).
  15. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133, 12 (2013).
  16. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77, 98-101 (2016).
  17. Nencini, F., Pratesi, S., Petroni, G., Matucci, A., Maggi, E., Vultaggio, A. Assays and strategies for immunogenicity assessment of biological agents. Drug Development Research. 75, 4-6 (2014).
  18. Haber, E., Page, L. B., Richards, F. F. Radio immunoassay employing gel filtration. Analytical Biochemistry. 12, 163-172 (1965).
  19. Yalow, R. S., Berson, S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. 1960. Obesity Research. 4, 583-600 (1996).
  20. Lequin, R. M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51, 2415-2418 (2005).
  21. Wreghitt, T. G., Tedder, R. S., Nagington, J., Ferns, R. B. Antibody assays for varicella-zoster virus: comparison of competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), competitive radioimmunoassay (RIA), complement fixation, and indirect immunofluorescence assays. Journal of Medical Virology. 13, 361-370 (1984).
  22. Mathew, B. C., Biju, R. S., Thapalia, N. An overview of electrochemiluminescent (ECL) technology in laboratory investigations. Kathmandu University Medical Journal. 3, 91-93 (2005).
  23. Mikulskis, A., Yeung, D., Subramanyam, M., Amaravadi, L. Solution ELISA as a platform of choice for development of robust, drug tolerant immunogenicity assays in support of drug development. The Journal of Immunological Methods. 365, 38-49 (2011).
  24. Wadhwa, M., Bird, C., Dilger, P., Gaines-Das, R., Thorpe, R. Strategies for detection, measurement and characterization of unwanted antibodies induced by therapeutic biologicals. The Journal of Immunological Methods. 278, 1-17 (2003).
  25. Wolforth, J. B. Methods of Blood Collection in the Mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  26. Stunz, L. L., Busch, L. K., Munroe, M. E., Sigmund, C. D., Tygrett, L. T., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A. Expression of the Cytoplasmic Tail of LMP1 in Mice Induces Hyperactivation of B Lymphocytes and Disordered Lymphoid Architecture. Immunity. 21, 255-266 (2004).
  27. Xie, P. TRAF molecules in cell signaling and in human diseases. Journal of Molecular Signaling. 8, 7 (2013).
  28. Lalani, A. I., Zhu, S., Gokhale, S., Jin, J., Xie, P. TRAF molecules in inflammation and inflammatory diseases. Current Pharmacology Reports. 4, 64-90 (2018).
  29. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist Reviews. 25, 105-120 (2004).
  30. Specter, S., Friedman, H. Age- and sex-related differences in antibody formation and blastogenic responsiveness of splenocytes from RIII mice developing virus-induced mammary adenocarcinoma. The Journal of the National Cancer Institute. 67, 1347-1351 (1981).
  31. Giefing-Kroll, C., Berger, P., Lepperdinger, G., Grubeck-Loebenstein, B. How sex and age affect immune responses, susceptibility to infections, and response to vaccination. Aging Cell. 14, 309-321 (2015).
  32. Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. International Immunology. 19, 545-556 (2007).
  33. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Veterinary Pathology. 49, 32-43 (2012).
  34. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 47, 283-293 (2006).
  35. Vlkova, M., Rohousova, I., Hostomska, J., Pohankova, L., Zidkova, L., Drahota, J., Valenzuela, J. G., Volf, P. Kinetics of antibody response in BALB/c and C57BL/6 mice bitten by Phlebotomus papatasi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6, 1719 (2012).
  36. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172, 2731-2738 (2004).
  37. Ruane, D., Chorny, A., Lee, H., Faith, J., Pandey, G., Shan, M., Simchoni, N., Rahman, A., Garg, A., Weinstein, E. G., et al. Microbiota regulate the ability of lung dendritic cells to induce IgA class-switch recombination and generate protective gastrointestinal immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 213, 53-73 (2016).
  38. Chorny, A., Puga, I., Cerutti, A. Innate signaling networks in mucosal IgA class switching. Advances in Immunology. 107, 31-69 (2010).
  39. Van Praet, J. T., Donovan, E., Vanassche, I., Drennan, M. B., Windels, F., Dendooven, A., Allais, L., Cuvelier, C. A., van de Loo, F., Norris, P. S., et al. Commensal microbiota influence systemic autoimmune responses. The EMBO Journal. 34, 466-474 (2015).
  40. Nguyen, Q. N., Himes, J. E., Martinez, D. R., Permar, S. R. The Impact of the Gut Microbiota on Humoral Immunity to Pathogens and Vaccination in Early Infancy. PLOS Pathogens. 12, 1005997 (2016).
  41. Jeevan-Raj, B. P., Robert, I., Heyer, V., Page, A., Wang, J. H., Cammas, F., Alt, F. W., Losson, R., Reina-San-Martin, B. Epigenetic tethering of AID to the donor switch region during immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 208, 1649-1660 (2011).
  42. Chen, Z., Getahun, A., Chen, X., Dollin, Y., Cambier, J. C., Wang, J. H. Imbalanced PTEN and PI3K Signaling Impairs Class Switch Recombination. The Journal of Immunology. 195, 5461-5471 (2015).
  43. Boboila, C., Yan, C., Wesemann, D. R., Jankovic, M., Wang, J. H., Manis, J., Nussenzweig, A., Nussenzweig, M., Alt, F. W. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of Experimental Medicine. 207, 417-427 (2010).
  44. Shah, H. B., Koelsch, K. A. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods in Molecular Biology. 1312, 419-426 (2015).
  45. Bonsignori, M., Moody, M. A. Simultaneous Detection of Antigen-Specific IgG- and IgM-Secreting Cells with a B Cell Fluorospot Assay. Cells. 1, 15-26 (2012).
  46. Sasaki, Y., Derudder, E., Hobeika, E., Pelanda, R., Reth, M., Rajewsky, K., Schmidt-Supprian, M. Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Immunity. 24, 729-739 (2006).
  47. Goodlad, J. R., Macartney, J. C. Germinal-center cell proliferation in response to T-independent antigens: a stathmokinetic, morphometric and immunohistochemical study in vivo. European Journal of Immunology. 25, 1918-1926 (1995).
  48. Xie, P., Poovassery, J., Stunz, L. L., Smith, S. M., Schultz, M. L., Carlin, L. E., Bishop, G. A. Enhanced Toll-like receptor (TLR) responses of TNFR-associated factor 3 (TRAF3)-deficient B lymphocytes. Journal of Leukocyte Biology. 90, 1149-1157 (2011).
  49. Kaku, H., Horikawa, K., Obata, Y., Kato, I., Okamoto, H., Sakaguchi, N., Gerondakis, S., Takatsu, K. NF-kappaB is required for CD38-mediated induction of C(gamma)1 germline transcripts in murine B lymphocytes. International Immunology. 14, 1055-1064 (2002).
  50. Dudley, D. D., Chaudhuri, J., Bassing, C. H., Alt, F. W. Mechanism and control of V(D)J recombination versus class switch recombination: similarities and differences. Advances in Immunology. 86, 43-112 (2005).
  51. Lange, H., Hecht, O., Zemlin, M., Trad, A., Tanasa, R. I., Schroeder, H. W., Lemke, H. Immunoglobulin class switching appears to be regulated by B-cell antigen receptor-specific T-cell action. European Journal of Immunology. 42, 1016-1029 (2012).
  52. Moore, C. R., Liu, Y., Shao, C. S., Covey, L. R., Morse, H. C., Xie, P. Specific deletion of TRAF3 in B lymphocytes leads to B lymphoma development in mice. Leukemia. 26, 1122-1127 (2012).
  53. Bergmann, B., Grimsholm, O., Thorarinsdottir, K., Ren, W., Jirholt, P., Gjertsson, I., Martensson, I. L. Memory B cells in mouse models. Scandinavian Journal of Immunology. 78, 149-156 (2013).
  54. McHeyzer-Williams, L. J., Milpied, P. J., Okitsu, S. L., McHeyzer-Williams, M. G. Class-switched memory B cells remodel BCRs within secondary germinal centers. Nature Immunology. 16, 296-305 (2015).
  55. Elgueta, R., Marks, E., Nowak, E., Menezes, S., Benson, M., Raman, V. S., Ortiz, C., O'Connell, S., Hess, H., Lord, G. M., et al. CCR6-dependent positioning of memory B cells is essential for their ability to mount a recall response to antigen. The Journal of Immunology. 194, 505-513 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

139TDTIIgIgassay ELISA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены