جزيرة البنكرياس التضمين لمقاطع البارافين

Summary

السابقين فيفو الدراسات جزيرة البنكرياس تعتبر هامة لأبحاث مرض السكري. التقنيات القائمة لدراسة الجزيرات المزروعة في بهم العمارة 3 الأبعاد الأصلية مضيعة للوقت وغير كفؤة، والمستخدمة بشكل متكرر. ويصف هذا العمل طريقة جديدة وبسيطة وفعالة لتوليد مقاطع البارافين عالية الجودة من الجزيرات مثقف كلياً.

Abstract

تجارب باستخدام جزيرات البنكرياس معزولة هاما لأبحاث مرض السكري، ولكن الجزر الصغيرة مكلفة ومحدودة الوفرة. الجزر الصغيرة تحتوي على عدد خلايا مختلطة في هيكل منظم الآثار الدالة والجزيرات البشرية على نطاق واسع متغير في تكوين نوع الخلية. وتشمل الأساليب الحالية المستخدمة بشكل متكرر لدراسة الجزيرات مثقف الجزيئية دراسات أجريت على الجزر كله أو فاعلين جزيرة تباين أنواع الخلايا معا، أو الفحص المجهري أو الدراسات الجزيئية في خلايا الجزيرة الصغيرة المتناثرة، تعطيل العمارة جزيرة ليلى. في فيفو الدراسات جزيرة ليلى، جزءا لا يتجزأ من البارافين البنكرياس تمزيقها تقنية قوية لتقييم النتائج الخاصة بالخلايا في البنكرياس البيئة الأصلية. دراسة ثقافة ما بعد الجزر بتقطيع البارافين سيوفر العديد من المزايا: الكشف عن نتائج متعددة على نفس الجزيرات (يحتمل حتى بالضبط نفس الجزر الصغيرة، باستخدام مقاطع المسلسل) وقياسات خلية-نوع معين، والحفاظ على مواطن جزيرة خلية خلية والخلية-التحتية التفاعلات أثناء التعرض التجريبية والتحليل. ومع ذلك، عزل التقنيات الموجودة لتضمين الجزيرات الثقافة بعد هي غير فعالة، وتستغرق وقتاً طويلاً، وعرضه لفقدان المواد وتنتج عموما المقاطع مع أرقام جزيرة ليلى غير كافية أن تكون مفيدة للتحديد الكمي لنتائج. مرافق إعداد كتلة الخلايا مختبر علم الأمراض السريرية غير قابل للوصول وغير عملي لمختبرات البحوث الأساسية. قمنا بتطوير أسلوب أعلى مقاعد البدلاء المحسنة والمبسطة التي تنشئ المقاطع ذات غلة قوية والتوزيع للجزر الصغيرة. الجزر الصغيرة الثابتة حراكه في الحارة النسيجي [اغروس] هلام وبيبيتيد إلى قرص ثابت على شريحة زجاج قياسية، مثل أن الجزر الصغيرة توزع في طائرة. بعد الجفاف القياسي والتضمين، يمكن قص (10 +) 4-5 ميكرومتر مقاطع متعددة من نفس الكتلة جزيرة ليلى. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن إجراء تحاليل نسيجية وإيمونوفلوريسسينت على الماوس وفار والجزيرات البشرية. هذا نهج فعالة وغير مكلفة وتوفير الوقت لتقييم نتائج الخلية-نوع محدد، وبنية سليمة من الجزيرات المستزرعة.

Introduction

البنكرياس جزر لانجرهانز، المصدر الوحيد لتعميم الأنسولين، أنسجة الحيوية للمحققين يدرسون مرض البول السكري. من أي كائن حي معين، قد الجزيرات حجم متغير وتردد نوع الخلية والهندسة المعمارية^1،،من²³. الاستراتيجية التقليدية للدراسة في فيفو هيكل وتكوين خلية الغدد الصماء من جزيرات البنكرياس بتقطيع بنكرياس الأنسجة^4،5. أن الجزر تشكل سوى جزء صغير من إجمالي المحتوى الخلوية البنكرياس، تجري الدراسات الجزيئية على الجزر الصغيرة المعزولة. السابقين فيفو جزيرة الثقافة التجارب اختبار استجابة للمواد الغذائية، والتحوير الجيني (تعداء، تنبيغ)، أو علاجات تجريبية توفير نظرة ثاقبة آليات تحوير بقاء الخلية الغدد الصماء، والانتشار، ووظيفة هامة ^{5 , 6}.

السابقين فيفو تجارب جزيرة صغيرة غالباً ما يتم تحليل استخدام الدراسات الجزيئية للجزر كله أو دراسات نسيجية أو الجزيئية للخلايا جزيرة متناثرة نمت في أحادي الطبقة^5،6. التحليل الجزيئي للجزر كله يدخل التحذير الشديد من تمازج أنواع الخلايا، مما قد يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة أو إيجابية كاذبة عند استقراء لأي نوع من الخلايا الفردية. تشتت الخلية على كوفيرسليبس للثقافة بعد انتهاء الفحص المجهري يتيح قياس نتائج الخلية-نوع معين، ولكن يعطل العمارة جزيرة ليلى، والتي قد تغير استجابة للتدخل، ويحول دون تحديد النتائج المتعلقة بالهندسة المعمارية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن قياس عموما من التوصل إلى نتيجة واحدة فقط؛ على سبيل المثال، تحتاج تجربتين منفصلتين لقياس انتشار الخلايا بيتا وموت الخلايا بيتا نفس الظروف، التي يتعين القيام بها. وأيضا هذه النهج الأعمى لتقلب بين جزيرة ليلى، مجال يحظى باهتمام متزايد في المجال. فرز الخلايا جزيرة ليلى بالتدفق الخلوي للدراسات الجزيئية الخليوي-نوع معين، أو دراسات الحمض النووي الريبي خلية واحدة أنيقة لكنها محدودة، مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، بوفرة الأنسجة، القضاء على الهندسة المعمارية، وليست ملائمة تماما لتحليلات ثقافة الخلية الروتينية ^{5 , 7}-تصوير [كنفوكل] من الجزيرات الجامع-جبل إيمونوستينيد ويقدم بيانات سليمة هندسة عالية الجودة، ولكن كثيفة العمالة، والبيانات التي تم الحصول عليها من كل عينة محدودة إلى نتائج يمكن تحديدها في إيمونوستينينج واحدة⁸.

القدرة على توليد مقاطع البارافين عالية الجودة من الجزيرات كله الثقافة بعد انتهاء سيتناول العديد من هذه الشواغل. جزيرة عالية التكلفة، ومنخفضة-وفرة الأنسجة من النماذج الوراثية الفريدة أو من الجهات المانحة الجهاز البشري، أو الجزر حالة وظيفة فيفو في أو في المختبر التجريبي التلاعب، الثمينة. الحصول على عدة مقاطع البارافين من الجزيرات نفس سيسمح تحليل الخلية-نوع محدد، وبنية سليمة متعددة من نفس التجربة.

التقنيات القائمة على توليد الكريات جزيرة ليلى لتمزيقها ناقصة. هو محسن لعلم الأنسجة [اغروس] هلام مائي نقطة انصهار منخفضة يستخدم على نطاق واسع في تجهيز عينات نسيجية والخلوية بما في ذلك عينات الأنسجة الصغيرة أو المجزأة التي يصعب عملية⁹. جزيرة واحدة تضمين نهج هو تعليق الجزر الصغيرة في [اغروس] في أنبوب ميكروسينتريفوجي، والطرد المركزي لبيليه بالمواد، واسترداد المكونات أجار، ثم عملية وتضمين لتقطيع^10،11. استخراج عينة طدت من الجزء السفلي من الأنبوب وقتاً طويلاً وصعبا، مما أدى إلى تجزئة العينة العرضية وخطر الإصابة الشخصية. الجزر الصغيرة تتركز في غيض المكونات، مما يؤدي إلى توزيع جزيرة ليلى غير كافية في الأجزاء التي تم الحصول عليها من هذا الأسلوب. جولة أسفل المكونات تعقيد التضمين مثل أنه قد قدم في منطقة ايميا-الفقراء لتمزيقها. وعموما، هذا الأسلوب يؤدي إلى منخفضة الغلة وتوزيع جزيرة تحبب خفيف في الأقسام الناتجة.

هذا الأسلوب الجديد نهج مبسطة ومحسنة للتحضير لأقسام جزيرة ليلى. الجزر الصغيرة تتركز في حجم صغير وثم وضعت على سطح أملس لشريحة المجهر شكل قرص صغير، مع الجزر في طائرة واحدة. تتم معالجة القرص هيستوجيل-جزيرة لاحقاً البارافين التضمين في تقصير الجفاف وبروتوكول تسلل زيلين نفط. ويتم أيضا النهج السابق، الذي يركز الجزر الصغيرة في الجزء السفلي من أنبوب [ميكروفوج]، على سبيل مقارنة. هذا الأسلوب الجديد يحسن عائد الجزيرات كل قسم، توزيع الجزر الصغيرة في كل قسم، ووقتاً أقل لنقل كتل جزيرة ليلى إلى أشرطة الكاسيت. هذا الأسلوب مفيد لعلماء الأحياء جزيرة ليلى أو غيره من العلماء الذين يدرسون قطع صغيرة من الأنسجة الراغبين في تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية استخدام الأنسجة وفرة منخفضة بقياس نتائج متعددة في عينة واحدة في هندسة الأنسجة الأصلية به.

Protocol

بموافقة جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات UMass المدرسة المؤسسية الحيوان الرعاية الطبية واستخدام اللجنة. دراسات جزيرة البشرية كانت يحددها المجلس استعراض المؤسسية UMass لعدم التأهل لاستعراض الكندي أو الإعفاء نظراً لأنها لا تنطوي على استخدام البشر.

1-جزيرة العزلة والثقافة

1. عزل الجزر الصغيرة وفصل عن تلويث أنسجة إفرازات والأقنية استخدام أسلوب اختيارك.
   ملاحظة: هذا الأسلوب الأمثل باستخدام الجزر الصغيرة المعزولة إينسوفليشن الأقنية كولاجيناز وفيكل الفصل¹² (القوارض) أو الجزر بعد الشحن من "برنامج توزيع جزيرة المتكاملة" (إييدب¹³؛ الإنسان). كانت اختارته الجزر الصغيرة مع ميكروبيبيتي P200.
2. لتحسين أمثلية مورفولوجيا جزيرة ليلى، السماح للجزر الصغيرة لاسترداد بين عشية وضحاها في 10 مل جزيرة كاملة المتوسطة (ربمي مع 10% FBS والبنسلين/ستربتوميسين الجلوكوز 5.5 مليمول/لتر) في دائرة هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO₂ في 37 درجة مئوية. على الرغم من أن هذه الخطوة غير مطلوب للحصول على مقاطع، الجزر الصغيرة لا أكثر على حالها بعد فترة استرداد (انظر الشكل 2).

2-جزيرة التثبيت

1. استخدام تلميح P200 ملزمة منخفضة، handpick حوالي 250 جزيرة مكافئات (إيك)¹³ استخدام شبكة معايرة تحت ستيريوميكروسكوبي في أنبوب [ميكروفوج] ملزمة منخفضة 1.5 مل. نصائح ملزمة منخفضة وأنابيب تقليل الخسائر في جزيرة ليلى.
2. السماح للجزر الصغيرة تسوية إلى الأسفل [ميكروفوج] أنابيب. إزالة معظم المادة طافية مع تلميح بيبيت P200، مع الحرص على عدم إزالة أي الجزر الصغيرة.
3. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الأنبوب في جهاز الطرد مركزي دلو يتأرجح حتى السرعة تصل إلى 200 x ز ووقف ثم الدوران. إزالة المادة طافية. كرر يغسل برنامج تلفزيوني، ليصبح مجموع يغسل اثنين.
4. إضافة 500 ميليلتر من محلول الفورمالين 10% أو 4% طازجة بارافورمالدهيد. إصلاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. لنتائج اختبار باستخدام هذا الأسلوب، كانت هذه أساليب التثبيت يمكن تمييزها. كما قد يكون التثبيت أقصر ممكنة؛ من المستحسن لتحسين مدة التثبيت للنتيجة المرجوة.
5. إزالة مثبت مع تلميح P200.
6. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الأنبوبة حتى السرعة تصل إلى 200 x ز ووقف ثم الدوران. إزالة المادة طافية. كرر يغسل برنامج تلفزيوني، ليصبح مجموع يغسل اثنين.
7. الشروع فورا في الخطوة التالية.

3-إعداد القرص جزيرة ليلى (الشكل 1)

1. عند أول استخدام، تذوب الهلام (مثلاً، هيستوجيل) في 70 درجة مئوية وجعل مختبرين في 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب للتخزين على المدى الطويل. حجم الكوة ليست حاسمة، حيث يمكن إعادة استخدام مختبرين.
2. الحارة الهلام (حوالي 100 ميليلتر كل عينة) في 70 درجة مئوية عن طريق وضع [ميكروفوج] أنابيب تحتوي على قاسمة جل في كتلة حرارة تعيين إلى 70 درجة مئوية.
3. نقل الخرز الأزرق [اغروس] (10 ميليلتر لكل عينة) في أنبوب نظيف [ميكروفوج] 1.5 مل. دقة ريسوسبيند الخرز قبل بيبيتينج.
   ملاحظة: تمتزج الخرز الأزرق مع الجزر الصغيرة للمساعدة في التعرف البصري للمواد المضمنة في الزر [اغروس] وكتلة البارافين. عدد الخرز الأزرق المستخدمة ليست حاسمة بالنسبة للنتيجة، ولكن تجنب الخرز المفرط (> 5 x العدد من الجزر الصغيرة) للسماح بالتوزيع الأمثل للجزر الصغيرة في الفروع.
4. أغسل الخرز الأزرق مع 1 مل برنامج تلفزيوني، مرتين. لكل غسل، تدور الخرز 1 دقيقة في ز 800 x. بعد الغسيل الثاني، ريسوسبيند الخرز في (n+ 2) × 10 ميليلتر PBS، حيث n هو عدد أنابيب العينات؛ على سبيل المثال، سيكون حجم برنامج تلفزيوني إضافة إلى الخرز لأنابيب العينة 2، 40 ميليلتر.
5. الطرد المركزي [ميكروفوج] أنابيب تحتوي على الجزر (تدور موجزة إلى 200 س ز) وإزالة معظم المادة طافية. قطع غيض من تلميح ميكروبيبيتي 10 ميليلتر مع مقص أو شفرة وإضافة 10 ميليلتر من حبات لكل أنبوبة جزيرة ليلى، باستخدام تلميح نظيفة لكل عينة. لا تخلط (لتجنب فقدان الجزر الصغيرة).
6. الطرد المركزي الجزر الصغيرة والخرز (تدور موجزة إلى 200 س ز). قم بإزالة برنامج تلفزيوني قدر ممكن مع نصيحة ميكروبيبيتي 10 ميليلتر تقطيعه.
7. التسمية شرائح المجهر لتحديد هوية العينة. يمكن إعداد العينات اثنين إلى ثلاثة في كل شريحة. ضع الشريحة على مقاعد البدلاء قرب كتلة الحرارة مع هلام دافئة. النصائح من ثلاث إلى خمس قطع 20 ميليلتر ملزمة منخفضة ميكروبيبيتي نصائح كل عينة بشفرة حلاقة أو مقص. تحميل اثنين P20 ميكروبيبيتيس مع قطع نصائح للسماح بسرعة التحول من واحدة إلى أخرى.
8. باستخدام ميكروبيبيتي أول، إضافة 15-20 ميليلتر من هلام الحارة للجزر الصغيرة/حبات [ميكروفوج] أنابيب؛ مزيج فورا، تجنب الفقاعات؛ وتنطبق على الشريحة بشكل خليط أجار/الجزر/حبات السائل < القرص قطرها 1 سم. ضع القرص القرب من الحافة من الشريحة، تاركاً مساحة للطوق الخارجي هلام (الخطوة التالية). انقر فوق الشريحة بلطف عدة مرات لتسوية الجزر الصغيرة والخرز.
9. استخدام ميكروبيبيتي ثانية، إضافة 20 ميليلتر من هلام الحارة إلى أنبوب عينة. استخدام ميكروبيبيتي أول، مزيج هلام جديد مع أي المتبقية الجزيرات/الخرز، إعادة الاحترار في كتلة الحرارة إذا ما بدأ أن يصلب، ثم تطبيق هذا الخليط على الشريحة، المحيطة بالقرص الأصلي. كرر حسب الضرورة، باستخدام نصائح قبل قطع إضافية، حتى يصبح القرص بالحجم المطلوب وسمك.
   ملاحظة: التعامل مع القرص تبلور أسهل إذا كان خارج الحلبة قليلاً أكثر ثخانة. 3 x 20 ميليلتر من جل عادة كافية. هذه الخطوة يقلل من فقدان للجزر الصغيرة التي يغسل أنبوب ويضيف [اغروس] جزيرة فقيرة إلى خارج القرص لتسهيل معالجة القرص.
10. إعداد القرص كل على حدة، وتتبع دقيق للأمر عينة إذا وضع أقراص متعددة على كل شريحة.
11. ضع الشرائح على سطح مستو من الجليد الرطب، مع غطاء، لمدة 10 دقائق أو حتى يتصلب الهلام. من الصعب أكثر الشرائح القرص قبالة الزجاج إذا يجف.
12. قم بتسمية خزعة تجهيز/تضمين أشرطة الأنسجة مع قلم رصاص، واحد لكل عينة. الجاف للجزء الخلفي الشريحة لتفادي ترطيب الورقة الزرقاء.
13. برفق باستخدام حافة شفرة حلاقة حادة، دفع القرص في كل اتجاه تحريرها من الزجاج. عند ذلك الشرائح بسهولة، ببطء دفع القرص من الشريحة المجهر على المناديل الورقية الزرقاء. ضع القرص وجانب شقة أسفل، مباشرة على الورق.
14. حفظ القرص مسطحة، طي الورقة حول القرص لمنع الحركة، ضع القرص في ورقة مطوية في الكاسيت، وأغلق الكاسيت. إذا كان القرص لا شريحة نظيفة قبالة الزجاج، إضافة هلام أكثر و/أو إرجاع الشريحة للجليد لبضع دقائق إضافية.
15. تغرق في الكاسيت في برنامج تلفزيوني في كوب. عملية البارافين التضمين في نفس اليوم مورفولوجية الأمثل.

4-البارافين التضمين

ملاحظة: عملية أقراص هلام جزيرة ليلى إلى كتل البارافين باستخدام سلسلة جفاف مختصر كما هو موضح أدناه. هذا الأسلوب الأمثل باستخدام معالج الآلي، ولكن المعالجة اليدوية وينبغي أن تسفر عن نتائج مماثلة.

1. تزج أشرطة الكاسيت في الإيثانول 85% لمدة 15 دقيقة.
2. تزج أشرطة الكاسيت في الإيثانول 95% لمدة 15 دقيقة.
3. تزج أشرطة الكاسيت في الإيثانول 100% لمدة 15 دقيقة. كرر مرتين لما مجموعة ثلاث يغسل.
4. تزج أشرطة الكاسيت في زيلين نفط لمدة 15 دقيقة. كرر مرتين لما مجموعة ثلاث يغسل.
5. تزج أشرطة الكاسيت في البرافين المنصهر لمدة 10 دقائق.
6. نقل الأشرطة إلى البرافين المنصهر الطازجة لمدة 10-30 دقيقة.
7. فتح الكاسيت وبسط الورقة الزرقاء بعناية. إزالة القرص هلام، تتبع من سطح مستو الذي اعترض على الورقة. تضمين القرص في العفن صغيرة، مع السطح (المحتوية على جزيرة ليلى) أسفل، موازية لسطح القطع. لسد العجز، بعناية إزالته من الكاسيت وتضمين ذلك في قالب صغير بطرف لافتاً نحو سطح القطع.

5-البارافين تمزيقها وتلطيخ

1. قم بتسمية الشرائح تسلسلياً إذا كانت مطلوبة من مقاطع المسلسل.
2. وقد 5 مقاطع البارافين ميكرومتر قطع طريق هيستوتيتشنولوجيست ذوي خبرة. لتعظيم العائد، حفظ كافة المقاطع التي تحتوي على المواد. وبصفة عامة، يسمح تجميع الأقسام 20 القبض على معظم المواد.
3. تخزين المقاطع في درجة حرارة الغرفة. أقسام قابلة للبقع النسيجي الروتينية (مثل H & E) والفلورة (مثل الأنسولين والجلوكاجون و DAPI). تحسين التثبيت لمولدات المضادات الأخرى، إذا لزم الأمر.

النتائج

تخطيطي يتضح من خطوات لإعداد القرص جل يرد في الشكل 1. هذا جل القرص نتائج الأسلوب في البارافين المقاطع التي تحتوي على عدد كاف من الجزر الصغيرة الموزعة في طائرة واحدة للسماح بمعنى القياس الكمي لنتائج. ويبين الشكل 2 الصور المنخفضة-التكبير من ال...

Discussion

يوفر هذا الأسلوب التضمين معدلة هلام-المستندة إلى قرص بسيطة وغير مكلفة، وطريقة فعالة لتوليد عائد عالية من الجزيرات كل قسم. بناء القرص جل على سطح زجاج مسطح يسهل انتشار الجزر إلى توزيع حتى على مساحة محددة تحديداً جيدا. نشر الجزيرات في قرص ثابت يوفر ميزة وضع العديد من الجزر الصغيرة في طائرة ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tube	Norgen Bioteck Corp	P/N 10113
Ranin Classic Starter Kit	ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipette PR-2	ShopRanin	17008648
Low Binding Tip (1000 μL)	Genesee Scientific	24-430
Low Binding Tip (200 μL)	Genesee Scientific	24-412
Low Binding Tip (20 μL)	Genesee Scientific	24-404
Low Binding Tip (10 μL)	Genesee Scientific	24-401
10% Formalin solution	Sigma	HT501128
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
Heatblock	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Agarose blue beads- Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Dulbecco's PBS	Life technologies	14190-144
Tissue processing cassette	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 tissue processor	Thermo-Shandon LLC
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, INC	2701
Xylene	Fisher Chemical	X5SK-4
Paraffin	McCormick Scientific	39503002
Microtome	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
Insulin antibody	DAKO	A0564
Glucagon antibody	Sigma	G2654
Fluoroshield with DAPI	Sigma	F6057
Alex fluor 594 secondary antibodies	Life technologies	A11076
Alex fluor 488 secondary antibodies	Life technologies	A11001