Isole pancreatiche incorporamento per sezioni di paraffina

Riepilogo

Ex vivo dell'isolotto pancreatico studi sono importanti per la ricerca sul diabete. Le tecniche esistenti per studiare isolotti coltivati nella loro architettura 3-dimensionale nativo sono che richiede tempo, inefficiente e utilizzati raramente. Questo lavoro descrive un metodo nuovo, semplice ed efficiente per la generazione di sezioni di paraffina di alta qualità di isolotti tutta coltivati.

Abstract

Gli esperimenti usando isolotti pancreatici isolati sono importanti per la ricerca sul diabete, ma gli isolotti sono costosi e di abbondanza limitata. Isolotti contengono una popolazione di cellule miste in un'architettura strutturata che gli impatti funzione e isolotti umani sono ampiamente variabile nella composizione di tipo cellulare. Attuali metodi utilizzati di frequente per studiare isolotti coltivati includono studi molecolari su isolotti interi, tipi di cellule dell'isolotto disparati lumping insieme, o microscopia o studi molecolari su cellule disperse dell'isolotto, interrompendo l'architettura dell'isolotto. Per in vivo gli studi dell'isolotto, paraffina pancreas sezionamento è una potente tecnica per valutare i risultati di cellula-specifico nell'ambiente del pancreas nativo. Studiando la post-cultura isolotti dalla divisione di paraffina sarebbe offrono diversi vantaggi: rilevamento di risultati multipli sulla stessi isolotti (potenzialmente anche lo stessa esatta isolotti, utilizzando sezioni di serie), le misure di cellula-tipo-specifico e mantenimento nativo isolotto-cellula e cellula-substrato interazioni sia durante l'esposizione sperimentale che per l'analisi. Tuttavia, le tecniche esistenti per l'incorporamento isolato isolotti post-cultura sono inefficienti, che richiede tempo, soggetta a perdita di materiale e generalmente producono sezioni con numeri di isolotto inadeguata per essere utili per quantificare i risultati. Impianti di preparazione delle cella blocco del laboratorio di patologia clinica sono inaccessibili e poco pratico per i laboratori di ricerca di base. Abbiamo sviluppato un metodo di banco migliorato, semplificato che genera sezioni con resa robusta e distribuzione degli isolotti. Fissi isolotti sono risospese in gel di agarosio istologico caldo e pipettati in un disco piatto su un vetrino standard, tale che gli isolotti sono distribuiti in un aereo. Dopo disidratazione standard e incorporamento, più (10 +) 4-5 µm sezioni possono essere tagliati dallo stesso blocco dell'isolotto. Utilizzando questo metodo, analisi istologiche ed immunofluorescenti possono essere eseguite sul topo, ratto e isolotti umani. Si tratta di un approccio efficace, poco costoso, risparmio di tempo per valutare i risultati specifici del tipo di cellula, architettura intatta da isolotti coltivati.

Introduzione

Isole di Langerhans, la sola fonte di insulina, di circolazione sono un tessuto critico per gli investigatori studiando il diabete mellito. Da qualsiasi dato organismo, isolotti hanno dimensione variabile, frequenza di tipo cellulare e architettura^1,2,3. La strategia convenzionale di studiare in vivo struttura e composizione endocrina delle cellule degli isolotti pancreatici è sezionando pancreas tessuto^4,5. Poiché gli isolotti comprendono solo una piccola frazione del totale contenuto cellulare pancreatica, gli studi molecolari sono svolti su isolotti isolati. Ex vivo dell'isolotto cultura esperimenti di verifica risposta a nutrienti, modulazione genica (trasfezione, trasduzione), o trattamenti sperimentali forniscono comprensione importante nei meccanismi che modulano la funzione, la proliferazione e sopravvivenza delle cellule endocrine ^{5 , 6}.

Ex vivo esperimenti isolotto spesso sono analizzati utilizzando gli studi molecolari degli isolotti interi o studi istologici o molecolari delle cellule dell'isolotto disperso coltivate in monostrato^5,6. L'analisi molecolare degli isolotti interi introduce l'avvertimento serio di mescolanti tipi di cellule, che possono produrre risultati falsi-negativi o falsi positivi quando estrapolati per qualsiasi tipo di cellula individuale. Dispersione delle cellule sul coprioggetto per post-cultura microscopia permette la misura di esito di cellula-tipo-specifico, ma sconvolge architettura dell'isolotto, che può alterare la risposta ad intervento e preclude l'identificazione dei risultati legati al architettura. Inoltre, generalmente solo un singolo risultato può essere misurato; ad esempio, per misurare la proliferazione delle cellule beta e la morte delle cellule beta nelle stesse condizioni, due esperimenti separati devono essere eseguite. Questi approcci sono anche ciechi alla variabilità inter-isolotto, un'area di crescente interesse nel campo. Le cellule dell'isolotto ordinamento tramite flusso cytometry per studi molecolari specifici del tipo di cellula o di cella singola RNA studi sono eleganti ma costoso, richiede tempo, limitato da abbondanza di tessuto, eradicare l'architettura e non ben si adatta ad analisi di routine delle cellule cultura ^{5 , 7}. formazione immagine confocal di intero-monta immunostained isolotti fornisce dati intatti-architettura di alta qualità, ma è alta intensità di manodopera, e i dati ottenuti da ciascun campione sono limitati ai risultati identificabili in un singolo immunostaining⁸.

La capacità di generare sezioni di paraffina di alta qualità di isolotti interi post-cultura consentirebbe di affrontare molte di queste preoccupazioni. Tessuto dell'isolotto ad alto costo, basso-abbondanza da modelli genetici unici o da donatori di organi umani, o isolotti stato post in vivo o in vitro manipolazione sperimentale, sono preziosi. Come ottenere di più sezioni di paraffina dalle isolette stesse consentirebbe analisi multiple di cellula-tipo-specifico, architettura intatta dallo stesso esperimento.

Le tecniche esistenti per generare pellet dell'isolotto per il sezionamento sono imperfette. Istologia-ottimizzato dell'agarosi sono un gel acquoso basso punto di fusione che è ampiamente usato nell'elaborazione di campioni istologici e citologici inclusi campioni di tessuto piccolo o frammentati che sono difficili da processo⁹. Un isolotto l'incorporamento di approccio è quello di sospendere gli isolotti in agarosio in un tubo del microcentrifuge, centrifugare a pellet il materiale, recuperare la spina di agar, poi elaborare e incorporare per il sezionamento^10,11. Estrarre il campione solidificato dalla parte inferiore del tubo è che richiede tempo e difficile, portando a occasionali frammentazione del campione e rischio di lesioni personali. Gli isolotti sono concentrati nella punta della spina, che conduce alla distribuzione inadeguata dell'isolotto in sezioni ottenute da questo metodo. Il fondo rotondo della spina complica l'incorporamento tale che una regione dell'isolotto-poveri può essere presentata per il sezionamento. Nel complesso, questo metodo porta a bassa resa e distribuzione ragruppata isolotto nelle sezioni risultante.

Questo nuovo metodo è un approccio semplificato e migliorato per la preparazione di sezioni dell'isolotto. Gli isolotti sono concentrati in un piccolo volume e poi messo sulla superficie liscia di un vetrino da microscopio per formare un piccolo disco, con gli isolotti in un unico piano. Il disco Histogel-isolotto è successivamente trattato per inclusione in un protocollo di infiltrazione di xilene e ridotta disidratazione a paraffina. L'approccio precedente, che si concentra sugli isolotti nella parte inferiore di un tubo di microfuge, avviene anche come termine di paragone. Questa nuova tecnica migliora il rendimento degli isolotti per ogni sezione, la distribuzione degli isolotti in ogni sezione e richiede meno tempo per trasferire i blocchi dell'isolotto a cassette. Questa tecnica è utile per i biologi dell'isolotto o altri gli scienziati che studiano i piccoli pezzi di tessuto che desiderano massimizzare produttivo utilizzano di un tessuto basso-abbondanza misurando i risultati multipli su un singolo campione nella sua architettura di tessuto nativo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal comitato di uso e UMass Medical School istituzionale Animal Care. Gli studi umani dell'isolotto sono stati determinati mediante la UMass Institutional Review Board a non qualificarsi per revisione IRB o esenzione perché non implicano l'uso di soggetti umani.

1. isolotto isolamento e coltura

1. Isolotti di isolare e separare dalla contaminazione del tessuto esocrino e duttale utilizzando il metodo di vostra scelta.
   Nota: Questo metodo è stato ottimizzato utilizzando isolotti isolati di insufflazione ductal collagenosi e Ficoll separazione¹² (roditore) o post-shipment isolotti dal programma integrato di distribuzione dell'isolotto (IIDP¹³; umani). Gli isolotti sono state raccolte a mano con una micropipetta P200.
2. Per ottimizzare la morfologia dell'isolotto, consentire isolotti recuperare una notte nel mezzo di isolotto completa di 10 mL (RPMI con 10% FBS, penicillina/streptomicina e glucosio 5,5 mmol/L) in una camera umidificata contenente 5% CO₂ a 37 ° C. Anche se questo passaggio non è necessario per ottenere le sezioni, le isolette sono più intatte dopo un periodo di recupero (Vedi Figura 2).

2. isolotto fissazione

1. Utilizzando una punta di basso-associazione P200, accuratamente circa 250 isolotto equivalenti (IEQ)¹³ utilizzando una griglia calibrata sotto un microscopio stereoscopico in una provetta da 1,5 mL basso associazione microfuge. Basso-associazione consigli e tubi riducono la perdita dell'isolotto.
2. Consentire isolotti a depositarsi sul fondo del tubo del microfuge. Rimuovere il surnatante maggior parte con una punta di pipetta P200, facendo attenzione a non per rimuovere qualsiasi isolotti.
3. Aggiungere 1 mL di PBS. Centrifugare la provetta in una centrifuga di Benna oscillante fino a quando la velocità raggiunge i 200 x g e quindi fermare la rotazione. Eliminare il surnatante. Ripetere il lavaggio con PBS, per un totale di due lavaggi.
4. Aggiungere 500 µ l di soluzione di formalina al 10% o paraformaldeide 4% appena fatte. Difficoltà a temperatura ambiente per 30 minuti. Per i risultati testati in questo metodo, questi metodi di fissazione erano indistinguibili. Più breve fissazione può anche essere possibile; si consiglia di ottimizzare la durata della fissazione per il risultato desiderato.
5. Rimuovere il fissativo con una punta di P200.
6. Aggiungere 1 mL di PBS. Centrifugare la provetta fino a quando la velocità raggiunge i 200 x g e quindi fermare la rotazione. Eliminare il surnatante. Ripetere il lavaggio con PBS, per un totale di due lavaggi.
7. Procedere immediatamente alla fase successiva.

3. preparazione del disco dell'isolotto (Figura 1)

1. Al primo utilizzo, sciogliere il gel (ad esempio, Histogel) a 70 ° C e fare le aliquote in 1,5 mL microfuge tubi per immagazzinaggio a lungo termine. Aliquotare il volume non è critico, poiché le aliquote possono essere riutilizzate.
2. Caldo il gel (circa 100 µ l per campione) a 70 ° C inserendo microfuge provetta contenente l'aliquota di gel in un blocco di calore impostato a 70 ° C.
3. Trasferimento dell'agarosi blu perline (10 µ l per ogni campione) in una provetta pulita microfuge 1,5 mL. Risospendere accuratamente le perle prima di pipettaggio.
   Nota: Perline blu sono mescolati con gli isolotti di assistere nell'identificazione visiva del materiale incorporato nel pulsante di agarosio e il blocco di paraffina. Il numero di perline blu utilizzato non è fondamentale per il risultato, ma evitare eccessiva Perline (> 5 x il numero di isolotti) per consentire una distribuzione ottimale degli isolotti in sezioni.
4. Lavare le perle blue con 1mL di PBS, due volte. Per ogni lavaggio, girare le perline 1 min a 800 x g. Dopo il secondo lavaggio, risospendere le perline a (n+ 2) x 10 µ l di PBS, dove n è il numero di provette; ad esempio, per 2 provette dei campioni, il volume di PBS per aggiungere ai talloni sarebbe 40 µ l.
5. Centrifugare la provetta microfuge contenente isolotti (breve rotazione a 200 x g) e rimuovere la maggior parte del surnatante. Tagliare la punta di una punta di una micropipetta 10 µ l con forbici o una lama e aggiungere 10 µ l di perline in ogni provetta dell'isolotto, utilizzando una punta pulita per ogni campione. Non mescolare (per evitare di perdere gli isolotti).
6. Centrifugare a isolotti e perline (breve rotazione a 200 x g). Rimuovere tanto PBS come possibile con un integrale punta micropipetta 10 µ l.
7. Marcare i vetrini microscopio per identificazione dei campioni. Due o tre campioni possono essere preparati su ogni diapositiva. Porre il vetrino sul banco vicino il blocco di calore con gel riscaldato. Tagliare le punte di tre-cinque 20 consigli di micropipetta obbligatoria bassa µ l per campione con una lama di rasoio o forbici. Caricare due P20 Micropipette con punte di taglio per consentire il rapido passaggio da uno a altro.
8. Utilizzando la micropipetta prima, aggiungere 15-20 µ l di gel caldo al tubo microfuge isolotti/perline; miscelare immediatamente, evitando bolle; e applicare la miscela liquida di agar/isolotti/perline alla diapositiva per formare un < disco 1 cm di diametro. Posizionare il disco vicino al bordo della diapositiva, lasciando spazio per l'anello esterno gel (passo successivo). Tocca la diapositiva delicatamente un paio di volte a risolvere gli isolotti e perline.
9. Utilizzando una micropipetta seconda, aggiungere 20 µ l di gel caldo alla provetta del campione. Utilizzando il prima micropipetta, mix nuovo gel con qualsiasi isolotti/perline restanti, ri-riscaldamento del blocco di calore se inizia a solidificare, quindi applicare questa miscela alla diapositiva, che circondano il disco originale. Ripetere, se necessario, con ulteriori suggerimenti pre-tagliati, fino a quando il disco è la dimensione desiderata e lo spessore.
   Nota: La gestione del disco gelificato è più facile se l'anello esterno è leggermente più spessa. Di solito, 3 x 20 µ l del gel è sufficiente. Questo passaggio minimizza la perdita di isolotti da tubo lavaggi e aggiunge isolotto-poveri agarosio all'esterno del disco per facilitare la gestione dei dischi.
10. Preparare individualmente ogni disco e tenere traccia accurata di ordine del campione se posizionando più dischi su ogni diapositiva.
11. Porre i vetrini su una superficie piana di ghiaccio bagnato, con un coperchio, per 10 minuti o fino a quando il gel si solidifica. È più difficile da far scorrere il disco fuori il vetro se si asciuga.
12. Biopsia di etichetta elaborazione/incorporamento cassette per tessuti con la matita, uno per ogni campione. Asciugare la parte posteriore della diapositiva per evitare di bagnare la carta blu.
13. Utilizzando il bordo non tagliente di una lama di rasoio, premere delicatamente il disco in ogni direzione per liberarlo dal vetro. Quando scivola facilmente, spingere lentamente il disco dal vetrino da microscopio sulla carta tessuto blu. Posizionare il disco, il lato piatto verso il basso, direttamente sulla carta.
14. Mantenere il disco piatto, piegare la carta intorno al disco per evitare qualsiasi movimento, inserire il CD in carta piegata nella cassetta e chiudere la cassetta. Se il disco non scorre in modo pulito il vetro, aggiungere più gel e/o ritorno lo scivolo di ghiaccio per un paio di minuti.
15. Immergere la cassetta in PBS in un becher. Processo per lo stesso giorno per morfologia ottimale di inclusione a paraffina.

4. inclusione in paraffina

Nota: Processo il gel dell'isolotto dischi a blocchetti di paraffina usando una serie di disidratazione abbreviato come descritto di seguito. Questa tecnica è stata ottimizzata utilizzando un processore automatizzato, ma l'elaborazione manuale dovrebbe produrre risultati simili.

1. Immergere le cassette in 85% di etanolo per 15 minuti.
2. Immergere le cassette in etanolo al 95% per 15 minuti.
3. Immergere le cassette in etanolo al 100% per 15 minuti. Ripetere due volte per un totale di tre lavaggi.
4. Immergere le cassette in xilene per 15 minuti. Ripetere due volte per un totale di tre lavaggi.
5. Immergere le cassette in paraffina fusa per 10 minuti.
6. Trasferire cassette al fresco paraffina fusa per 10-30 minuti.
7. Aprire la cassetta con cautela e scartare la carta blu. Rimuovere il disco di gel, tenendo traccia della superficie piana che si opponeva alla carta. Incorporare il disco in uno stampo piccolo, con la superficie piatta (isolotto-contenenti) verso il basso, parallelo alla superficie di taglio. Per la spina, attentamente rimuoverlo dal cassetto e incorporarlo in uno stampo piccolo con la punta rivolta verso la superficie di taglio.

5. paraffina sezionamento e colorazione

1. Etichettare i vetrini in sequenza se le sezioni di serie sono necessari.
2. Hanno 5 µm paraffina sezioni tagliate da un esperto istotecnico. Per massimizzare la resa, salvare tutte le sezioni contenenti materiale. In genere, raccogliendone 20 sezioni, cattura della maggior parte del materiale.
3. Memorizzare sezioni a temperatura ambiente. Le sezioni sono suscettibili di immunofluorescenza (ad es., insulina, glucagone e DAPI) e le macchie istologiche sistematiche (ad es., H & E). Ottimizzare la fissazione per altri antigeni, se necessario.

Risultati

Un disegno schematico illustrato i passaggi per preparare il disco gel è illustrato nella Figura 1. Questo risultati del metodo di disco gel nelle sezioni della paraffina che contengono un numero sufficiente di isolotti distribuiti in un unico piano per consentire significativa quantificazione dei risultati. La figura 2 Mostra il basso ingrandimento immagini delle sezioni risultante per illustrare il numero di isolotti catturato...

Discussione

Questo metodo di incorporamento gel a base di disco modificato fornisce un semplice, poco costoso e un modo efficace per generare un rendimento elevato degli isolotti per ogni sezione. Costruire il disco gel su una superficie di vetro piano facilita spalmare isolotti in una distribuzione uniforme su un'area ben definita. Diffondere gli isolotti in un disco piatto offre il vantaggio di immissione molti isolotti nel piano della sezione, ottimizzando il rendimento e permettendo minori isolotti essere utilizzato. Lo spessore...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tube	Norgen Bioteck Corp	P/N 10113
Ranin Classic Starter Kit	ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipette PR-2	ShopRanin	17008648
Low Binding Tip (1000 μL)	Genesee Scientific	24-430
Low Binding Tip (200 μL)	Genesee Scientific	24-412
Low Binding Tip (20 μL)	Genesee Scientific	24-404
Low Binding Tip (10 μL)	Genesee Scientific	24-401
10% Formalin solution	Sigma	HT501128
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
Heatblock	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Agarose blue beads- Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Dulbecco's PBS	Life technologies	14190-144
Tissue processing cassette	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 tissue processor	Thermo-Shandon LLC
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, INC	2701
Xylene	Fisher Chemical	X5SK-4
Paraffin	McCormick Scientific	39503002
Microtome	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
Insulin antibody	DAKO	A0564
Glucagon antibody	Sigma	G2654
Fluoroshield with DAPI	Sigma	F6057
Alex fluor 594 secondary antibodies	Life technologies	A11076
Alex fluor 488 secondary antibodies	Life technologies	A11001