Ilhota pancreatic incorporação para cortes de parafina

Resumo

Ex vivo estudos de ilhotas pancreáticas são importantes para a pesquisa da diabetes. Técnicas existentes para estudar ilhotas cultivadas em sua arquitetura nativa 3-dimensional são demorados, ineficientes e raramente usado. Este trabalho descreve um método novo, simples e eficiente para a geração de cortes de parafina de alta qualidade de todo cultos Ilhéus.

Resumo

Experimentos utilizando ilhotas pancreáticas isoladas são importantes para a pesquisa do diabetes, mas ilhéus são caros e de abundância limitada. Ilhéus contêm uma população mista de célula em uma arquitetura estruturada que afeta a função e ilhotas humanas são amplamente variável na composição do tipo de célula. Atuais métodos usados com frequência para estudar ilhotas cultivadas incluem estudos moleculares, executados em toda Ilhéus, amontoando ilhéu diferentes tipos de células juntos, ou microscopia ou estudos moleculares em células das ilhotas dispersas, rompendo a arquitetura do Ilhéu. Estudos em vivo ilhéu, seccionamento de pâncreas de parafina é uma técnica poderosa para avaliar resultados de células específicas no ambiente nativo do pâncreas. Estudando a pós-cultura ilhotas secionando parafina que oferecem várias vantagens: deteção de vários resultados na mesmas ilhotas (potencialmente até as exato a mesma ilhotas, usando seções seriais), medições específicas do tipo de célula e mantendo nativo Ilhéu célula-célula e célula-substrato interações durante a exposição experimental e para análise. No entanto, as técnicas existentes para a incorporação de isolaram ilhotas pós-cultura são ineficientes, demorado, propenso a perda de material e geralmente produzem seções com números ilhéu inadequada para ser útil para quantificar os resultados. Instalações da preparação do bloco de célula laboratoriais de patologia clínica são inacessíveis e impraticável para laboratórios de pesquisa básica. Nós desenvolvemos um método de bancada melhorado e simplificado que gera seções com rendimento robusto e distribuição de ilhotas. Fixo de Ilhéus é resuspended em gel de agarose histológica quente e pipetado em um disco plano em uma corrediça de vidro padrão, tal que os ilhéus são distribuídos em um avião. Após desidratação padrão e incorporando, seções múltiplas (10 +) 4-5 µm podem ser cortadas do mesmo bloco ilhéu. Usando esse método, análises histológicas e imunofluorescência podem ser executadas em rato, rato e ilhotas humanas. Esta é uma abordagem eficaz, barata, economia de tempo para avaliar resultados de célula tipo-específicas, intacto-arquitetura de ilhotas culturas.

Introdução

Pancreáticas ilhotas de Langerhans, a única fonte de insulina, em circulação são um tecido crítico para os investigadores a estudar diabetes mellitus. De um determinado organismo, Ilhéus têm tamanho variável, frequência do tipo de célula e arquitetura^1,2,3. A estratégia convencional para estudar na vivo estrutura e composição de células endócrinas das ilhotas pancreáticas é secionando pâncreas tecido^4,5. Desde Ilhéus compõem apenas uma pequena fração do conteúdo total de celular do pâncreas, estudos moleculares são executados em ilhotas isoladas. Ex vivo ilhéu cultura experiências testando a resposta aos nutrientes, modulação de gene (transfeccao, transdução), ou tratamentos experimentais fornecem importantes insights sobre mecanismos de modulação da função, proliferação e sobrevivência de células endócrinas ^{5 , 6}.

Ex vivo experimentos ilhéu frequentemente são analisados usando estudos moleculares de ilhotas inteira ou estudos histológicos ou moleculares das ilhotas dispersas células cultivadas em monocamada^5,6. Análise molecular de ilhotas toda introduz a séria advertência entremear tipos de células, que podem produzir resultados falso-negativos ou falso-positivos quando extrapolados para qualquer tipo de célula individual. Dispersão de célula para lamínulas para microscopia de pós-cultura permite a medição de resultado de célula-tipo específico, mas interrompe a arquitetura do Ilhéu, que pode alterar a resposta à intervenção e impede a identificação dos resultados relacionados com arquitetura. Além disso, geralmente apenas um único resultado pode ser medido; por exemplo, para medir a proliferação de células beta e morte de células beta, nas mesmas condições, dois experimentos separados precisam ser executadas. Essas abordagens também são cegas à variabilidade inter ilhéu, uma área de interesse crescente no campo. Classificação células das ilhotas por citometria de fluxo para estudos moleculares de célula tipo-específicos, ou estudos de RNA de célula única são elegantes, mas caro, demorado, limitado pela abundância de tecido, erradicar a arquitetura e não é bem adequado para análises de cultura celular de rotina ^{5 , 7}. imagem latente confocal de ilhotas immunostained toda a montagem fornece alta qualidade intacta-arquitetura dados, mas é trabalhoso, e dados obtidos de cada amostra são limitados aos resultados identificáveis em um único immunostaining⁸.

A capacidade de gerar seções de alta qualidade da parafina de ilhotas toda pós-cultura abordaria muitas dessas preocupações. Tecido de ilhéu de alto custo e baixa-abundância de modelos genéticos únicos ou de doadores de órgãos humanos, ou ilhotas status post vivo em ou em vitro experimental manipulação, são preciosos. Obtenção de várias seções de parafina de Ilhéus mesmos permitiria múltiplas análises específicas do tipo de célula, arquitetura intacta no mesmo experimento.

Técnicas existentes para gerar pelotas ilhéu para secionar são imperfeitas. Histologia-otimizado agarose é um gel aquoso baixo ponto de fusão que é amplamente utilizado no processamento de amostras histológicas e citológicas, incluindo amostras de tecido pequeno ou fragmentados que são difíceis de processo⁹. Um ilhéu, incorporando a abordagem é para suspender as ilhotas em agarose em um tubo de microcentrifugadora, centrifugar para o material de Pelotas, recuperar a ficha de agar, então processar e incorporar para secionar^10,11. Extrair a amostra solidificada da parte inferior do tubo é demorado e difícil, levando a fragmentação ocasional da amostra e risco de danos pessoais. Os ilhéus concentram-se na ponta do plugue, levando a distribuição inadequada Ilhéu em seções obtidas por este método. O fundo redondo do plugue complica incorporando tais que uma região pobre em ilhéu possam ser apresentada para corte. Em geral, esse método leva ao baixo rendimento e distribuição ilhéu agrupados nas seções resultantes.

Este novo método é uma abordagem simplificada e melhorada para a preparação das seções do Ilhéu. Ilhotas são concentradas em um pequeno volume e então colocadas sobre a superfície lisa de uma lâmina de microscópio para formar um disco pequeno, com as ilhotas em um avião. O disco Histogel-ilhéu é processado posteriormente para incorporação em uma desidratação encurtada e protocolo de infiltração de xileno de parafina. A abordagem anterior, que concentra os ilhéus na parte inferior de um tubo de microcentrífuga, também é realizada como uma comparação. Essa nova técnica melhora o rendimento de ilhotas por seção, a distribuição das ilhotas em cada seção e leva menos tempo para transferir os blocos do Ilhéu para fitas. Essa técnica é útil para os biólogos ilhéu ou outros cientistas estudando pequenos pedaços de tecido que desejam maximizar produtivo usam de um baixa abundância tecido medindo vários resultados em uma única amostra em sua arquitetura de tecido nativo.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelo Comitê de uso e UMass Medical School institucional Animal Care. Estudos de ilhota humana foram determinados pelo Conselho de revisão institucional de UMass não qualificar para revisão do IRB ou isenção porque não envolvem o uso de cobaias humanas.

1. cultura e isolamento ilhéu

1. Ilhotas de isolar e separar de contaminar o tecido exócrino e ductal, usando o método de sua escolha.
   Nota: Este método foi otimizado usando ilhotas isoladas por insuflação ductal colagenase e Cyp2e1 separação¹² (roedores) ou pós-embarque ilhotas do programa de distribuição integrada ilhéu (IIDP¹³; humanos). Ilhéus foram escolhidos a dedo com uma micropipeta P200.
2. Para otimizar a morfologia do Ilhéu, permitir ilhotas de recuperar durante a noite em 10 mL de meio de ilhéu completa (RPMI com 10% FBS, penicilina/estreptomicina e glicose 5,5 mmol/L) numa câmara umidificada contendo 5% CO₂ a 37 ° C. Embora este passo não é necessário para obter as seções, os ilhéus são mais intactos após um período de recuperação (consulte a Figura 2).

2. ilhéu fixação

1. Usando uma ponta de P200 baixa-ligação, escolher aproximadamente 250 ilhéu equivalentes (IEQ)¹³ usando uma grade calibrada sob um estereomicroscópio em um tubo de microcentrífuga de ligação baixa 1,5 mL. Dicas e tubos de ligação de baixa reduzem a perda de ilhéu.
2. Permitir que Ilhéus repousar no fundo do tubo de microcentrífuga. Remova o sobrenadante mais com uma ponta da pipeta P200, tomando cuidado para não remover qualquer ilhotas.
3. Adicione 1 mL de PBS. Centrifugar o tubo em uma centrífuga de balde balançando até a velocidade atinge 200 x g e depois parará o spin. Remova o sobrenadante. Repita a lavagem PBS, para um total de duas lavagens.
4. Adicione 500 µ l de solução de formalina 10% ou paraformaldeído 4% acabadas. Fixar-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. Para os resultados testados neste método, estes métodos de fixação eram indistinguíveis. Fixação mais curta também pode ser possível; é recomendável para otimizar a duração de fixação para o resultado desejado.
5. Retire o fixador com uma ponta de P200.
6. Adicione 1 mL de PBS. Tubo de centrifugação até a velocidade atinge 200 x g e depois parará o spin. Remova o sobrenadante. Repita a lavagem PBS, para um total de duas lavagens.
7. Dirijam-se para a próxima etapa.

3. preparação do Ilhéu disco (Figura 1)

1. Na primeira utilização, derreta o gel (por exemplo, Histogel) a 70 ° C e faça alíquotas em 1,5 mL a tubos de microcentrífuga para armazenamento a longo prazo. Volume alíquota não é crítica, pois alíquotas podem ser reutilizadas.
2. Aquecer o gel (aproximadamente 100 µ l por amostra) a 70 ° C, colocando o tubo de microcentrífuga contendo gel de alíquota em um bloco de calor conjunto a 70 ° C.
3. Transferi contas de agarose azul (10 µ l de cada amostra) em um tubo de microcentrífuga limpos de 1,5 mL. Resuspenda minuciosamente as contas antes de pipetagem.
   Nota: Grânulos azuis são misturados com os ilhéus para auxiliar na identificação visual do material incorporado no botão de agarose e o bloco de parafina. O número de grânulos azuis usado não é crítico para o resultado, mas evitar excessivos grânulos (> 5 x o número de ilhotas) para permitir a distribuição ideal de ilhotas em seções.
4. Lave os grânulos azuis com 1mL de PBS, duas vezes. Para cada lavagem, gire os grânulos 1 min a x 800 g. Após a segunda lavagem, resuspenda os grânulos em (n+ 2) x 10 µ l de PBS, onde n é o número de tubos de amostra; por exemplo, para 2 tubos de amostra, o volume de PBS para adicionar as contas seria 40 µ l.
5. Centrifugar o tubo de microcentrífuga contendo ilhotas (breve spin para x 200g) e remover a maior parte do sobrenadante. Corte a ponta de uma dica de micropipeta de 10 µ l com tesoura ou lâmina e adicionar 10 µ l de grânulos para cada tubo ilhéu, usando uma ponteira limpa para cada amostra. Não misture (para evitar a perda de Ilhéus).
6. Centrifugação de Ilhéus e grânulos (breve spin para 200 x g). Remova o PBS tanto quanto possível com uma ponta de micropipeta de 10 µ l sem cortes.
7. Rotule as corrediças do microscópio para a identificação da amostra. Duas ou três amostras podem ser preparadas em cada slide. Coloque o slide no banco perto do bloco de calor com gel aquecida. Corte as pontas de três a cinco 20 pontas de micropipeta de baixa vinculação µ l por amostra com uma lâmina de barbear ou tesoura. Carrega duas micropipetas P20 com dicas de corte para permitir a rápida mudança de um para o outro.
8. Usando a primeira micropipeta, adicionar 15 a 20 µ l de gel quente para o tubo de microcentrífuga Ilhéus/grânulos; imediatamente misture, evitando bolhas; e aplique a mistura líquida de agar/Ilhéus/grânulos para o slide para formar um < disco de diâmetro de 1 cm. Coloque o disco perto da borda do slide, deixando espaço para o anel exterior gel (próximo passo). Toque o slide suavemente várias vezes para acertar as ilhotas e grânulos.
9. Usando uma segunda micropipeta, adicione 20 µ l de gel quente para o tubo de amostra. Em seguida, usando a primeira micropipeta, mistura novo gel com qualquer restantes Ilhéus/grânulos, re-aquecimento do bloco de calor se ele começa a se solidificar, aplica esta mistura para o slide, cercando o disco original. Repita, se necessário, usando dicas adicionais pré-cortada, até que o disco é o tamanho desejado e espessura.
   Nota: Manipular o disco gelificado é mais fácil se o anel exterior é ligeiramente mais grosso. Geralmente, 3 x 20 µ l de gel é suficiente. Esta etapa minimiza a perda de Ilhéus pelo tubo lavagens e adiciona agarose ilhéu-pobres para o exterior do disco para facilitar a manipulação de disco.
10. Prepare-se individualmente a cada disco e manter o controle cuidadoso da ordem da amostra se colocar vários discos em cada slide.
11. Coloque os slides sobre uma superfície plana de gelo molhado, com uma tampa, por 10 minutos ou até que o gel se solidifica. É mais difícil deslizar o disco fora do vidro se seca para fora.
12. Biópsia de rótulo processamento/incorporação de fitas de tecido com lápis, um por exemplo. Seca a parte de trás do slide para evitar molhar o papel azul.
13. Utilizando a extremidade sem corte de uma lâmina de barbear, empurre suavemente o disco em cada direção para livrá-lo do copo. Quando desliza facilmente, empurre lentamente o disco da lâmina de microscópio para o papel de tecido azul. Coloque o disco, o lado liso para baixo, diretamente no papel.
14. Mantendo o disco liso, dobre o papel ao redor do disco para evitar o movimento, coloque o disco no papel dobrado na gaveta e fechar a gaveta. Se o disco não deslizar limpa do copo, adicionar mais gel e/ou retornar a corrediça para gelo por mais alguns minutos.
15. Mergulhe a fita em PBS num copo. Processo para incorporação no mesmo dia para morfologia ideal de parafina.

4. parafina incorporação

Nota: O gel do Ilhéu de processo discos para blocos de parafina, usando uma série de desidratação abreviado conforme descrito abaixo. Esta técnica foi otimizada usando um processador automatizado, mas processamento manual deve produzir resultados semelhantes.

1. Mergulhe fitas em 85% de etanol durante 15 minutos.
2. Mergulhe fitas em etanol a 95% por 15 minutos.
3. Mergulhe fitas em etanol 100% por 15 minutos. Repita duas vezes para um total de três lavagens.
4. Mergulhe fitas em xilol durante 15 minutos. Repita duas vezes para um total de três lavagens.
5. Mergulhe fitas em parafina derretida por 10 minutos.
6. Transferi fitas para fresca parafina derretida por 10-30 minutos.
7. Cuidadosamente Abra a gaveta e desembrulhei o papel azul. Retire o disco de gel, mantendo-se a par da superfície plana que se opunha ao jornal. Inserir o disco em um molde pequeno, com a superfície plana (contendo ilhéu) para baixo, paralelo à superfície de corte. Para a ficha, cuidadosamente retire a gaveta e incorporá-lo em um molde pequeno com a ponta apontando em direção à superfície de corte.

5. parafina, corte e coloração

1. Rotular slides em sequência se seções seriais são necessárias.
2. Têm 5 µm parafina seções cortadas por um histotechnologist experiente. Para maximizar o rendimento, salve todas as seções que contenham material. Geralmente, coletar 20 seções permite a captura da maioria do material.
3. Armazenar as seções à temperatura ambiente. As seções são favoráveis à rotina histológicas manchas (por exemplo, H & E) e imunofluorescência (por exemplo, insulina, glucagon e DAPI). Otimize a fixação para outros antígenos, se necessário.

Resultados

Uma esquema ilustrada das etapas para preparar o gel de disco é mostrada na Figura 1. Este gel de disco método resulta em cortes de parafina que contêm um número suficiente de ilhotas distribuídas em um único plano para permitir significativa quantificação dos resultados. A Figura 2 mostra imagens de baixo-ampliação das seções resultantes para ilustrar o número de ilhotas capturado por seção. Em geral, > 35 Ilhéus...

Discussão

Este método de encastre modificado baseados em gel-disco fornece um simples, barato e eficiente maneira de gerar um alto rendimento de ilhotas por seção. Construir o disco de gel sobre uma superfície plana de vidro facilita o espalhamento ilhotas em uma distribuição uniforme sobre uma área bem definida. Espalhar as ilhotas em um disco plano oferece a vantagem de colocar muitas ilhotas no plano da secção, otimizando o rendimento e permitindo menos ilhotas ser usado. A espessura do disco pode ser ajustada para ate...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tube	Norgen Bioteck Corp	P/N 10113
Ranin Classic Starter Kit	ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipette PR-2	ShopRanin	17008648
Low Binding Tip (1000 μL)	Genesee Scientific	24-430
Low Binding Tip (200 μL)	Genesee Scientific	24-412
Low Binding Tip (20 μL)	Genesee Scientific	24-404
Low Binding Tip (10 μL)	Genesee Scientific	24-401
10% Formalin solution	Sigma	HT501128
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
Heatblock	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Agarose blue beads- Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Dulbecco's PBS	Life technologies	14190-144
Tissue processing cassette	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 tissue processor	Thermo-Shandon LLC
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, INC	2701
Xylene	Fisher Chemical	X5SK-4
Paraffin	McCormick Scientific	39503002
Microtome	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
Insulin antibody	DAKO	A0564
Glucagon antibody	Sigma	G2654
Fluoroshield with DAPI	Sigma	F6057
Alex fluor 594 secondary antibodies	Life technologies	A11076
Alex fluor 488 secondary antibodies	Life technologies	A11001