Pancreatic Islet Einbettung für Paraffin Abschnitte

Zusammenfassung

Ex-Vivo pancreatic Islet Studien sind wichtig für Diabetes-Forschung. Bestehende Techniken an kultivierte Inselchen in ihrer Muttersprache 3-dimensionale Architektur zu studieren sind zeitaufwendig, ineffizient und selten verwendete. Diese Arbeit beschreibt eine neue, einfache und effiziente Methode zur Erzeugung von qualitativ hochwertige Paraffin Abschnitte des gesamten kultivierten Inselchen.

Zusammenfassung

Experimente mit isolierten pankreatischen kleinen Inseln sind wichtig für Diabetes-Forschung, aber Inselchen sind teuer und der begrenzten Fülle. Inselchen enthalten einer gemischten Zellpopulation in einer strukturierten Architektur, die Funktion auswirkt, und menschliche Inselchen sind weit verbreitet in Zelle Typ Zusammensetzung variabel. Aktuelle häufig verwendete Methoden der kultivierte Inselchen zu studieren zählen Molekulare Studien auf ganze Inseln, begehen disparaten Inselchen Zelltypen zusammen, oder Mikroskopie oder Molekulare Studien über verteilte Inselzellen Inselchen Architektur zu stören. Für in Vivo Inselchen Studien ist Paraffin-eingebetteten Pankreas-Schnitt eine leistungsfähige Technik zellspezifische Ergebnisse in der nativen Pankreas-Umgebung zu bewerten. Post-Kultur Inselchen von Paraffin-Schnitt studieren würde bieten mehrere Vorteile: Erkennung von mehrere Ergebnisse für gleichen Inselchen (möglicherweise sogar die exakt gleichen Inselchen, mit Schnittserien), Handy-Typ-spezifische Messungen und Erhaltung Eingeborener kleine Insel Zell-Zell und Zelle-Substrat Interaktionen während experimentelle Exposition und zur Analyse. Jedoch isoliert vorhandene Techniken für die Einbettung von Inselchen Post-Kultur sind ineffizient, zeitaufwändig, anfällig für Verlust von Material und in der Regel produzieren Abschnitte mit unzureichenden Inselchen Zahlen bis zur Quantifizierung der Ergebnisse nützlich sein. Klinische Pathologie Zelle Block Vorbereitung Laboreinrichtungen sind unzugänglich und unpraktisch für grundlegende Forschungslabors. Wir haben eine verbesserte und vereinfachte Benchtop-Methode entwickelt, die Abschnitte mit stabile Erträge und Verteilung der Inselchen generiert. Feste Inselchen sind Nukleinsäuretablette in warmen histologischen Agarosegel und pipettieren in eine flache Scheibe auf einer standard-Glas-Folie, so dass die kleinen Inseln in einer Ebene verteilt sind. Nach standard Dehydrierung und einbetten können mehrere (10 +) 4-5 µm Abschnitte aus dem gleichen Inselchen Block geschnitten werden. Mit dieser Methode können auf Maus, Ratte und menschlichen Inselchen histologische und immunofluorescent Analysen durchgeführt werden. Dies ist eine effektive, kostengünstige, zeitsparende Ansatz zur Zelle-typspezifischen, intakt-Architektur Resultate von den kultivierten Inseln zu beurteilen.

Einleitung

Pankreas Langerhans-Inseln, die einzige Quelle des zirkulierenden Insulin, sind eine kritische Gewebe für Ermittler Diabetes Mellitus zu studieren. Aus jedem gegebenen Organismus haben Inselchen variabler Größe, Zelle Art Frequenz und Architektur^1,2,3. Die konventionelle Strategie in Vivo Struktur und Zusammensetzung der endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse Inselchen zu studieren ist durch Pankreas Gewebe^4,5-Schnitt. Da Inseln nur einen kleinen Bruchteil des Pankreas zellulären Gesamtgehalt bestehen, sind Molekulare Studien auf isolierte Inseln durchgeführt. Ex-Vivo Inselchen Kultur Experimente testen ansprechen auf Nährstoffe, bieten gen Modulation (Transfektion, Transduktion) oder experimentelle Behandlungen wichtige Einblicke in Mechanismen moduliert endokrine Zelle überleben, Verbreitung und Funktion ^{5 , 6}.

Ex-Vivo Inselchen Experimente sind oft mit molekularen Studien der ganzen Inseln oder histologische oder Molekulare Studien der dispergierten Inselzellen gewachsen in monomolekularen Film^5,6analysiert. Molekulare Analyse der ganzen Inseln führt die schwere Einschränkung der mehrfache Zelltypen, die falsch-negativen oder falsch-positiven Ergebnissen auf jede einzelne Zelle Art hochgerechnet führen kann. Zelle Dispersion auf Deckgläsern für Post-Kultur-Mikroskopie ermöglicht Handy-Typ-spezifische Ergebnis Messung, aber stört Inselchen Architektur, die Reaktion auf Intervention verändern kann und Identifizierung von architekturbezogenen Ergebnisse ausschließt. Darüber hinaus kann in der Regel nur ein einziges Ergebnis gemessen werden; zum Beispiel um Beta-Zell-Proliferation und Beta-Zelltod unter den gleichen Bedingungen zu messen, müssen zwei separate Experimente durchgeführt werden. Diese Ansätze sind auch blind für Inter Inselchen Variabilität, eine Fläche von zunehmendes Interesse im Bereich. Sortier Inselzellen durch Durchflusszytometrie für Zelle-Typ-spezifischen molekularen Studien oder einzellige RNA Studien sind elegant, aber teuer, zeitaufwändig, begrenzt durch Gewebe Fülle, Beseitigung von Architektur und nicht gut geeignet, um routinemäßige Zelle Kulturanalysen ^{5 , 7}. konfokale Bildgebung des gesamten-Mount Immunostained Inselchen bietet qualitativ hochwertige Daten intakt-Architektur, aber ist sehr arbeitsintensiv, und von jeder Probe gewonnene Daten beschränkt sich auf Ergebnisse in einem einzigen Immunostaining⁸erkennbar.

Die Möglichkeit, qualitativ hochwertige Paraffin Abschnitte des Post-Kultur ganze Inseln erzeugen würden viele dieser Bedenken ansprechen. Hohen Kosten, niedrig-Fülle Inselchen Gewebe von einzigartigen genetischen Modellen oder von menschlichen Organspendern oder Inselchen Status Post in Vivo oder in Vitro experimentelle Manipulation, sind kostbar. Erhalten mehrere Paraffin Abschnitte von den gleichen Inseln könnten mehrere Typ-zellspezifische intakt-Architektur Analysen aus dem gleichen Experiment.

Bestehende Techniken an Insel-Pellets für Schnitt erzeugen sind unvollkommen. Histologie-optimierte Agarose ist eine wässrige niedrigen Schmelzpunkt-Gel, die weit verbreitet ist in der Verarbeitung von histologischer und zytologischen Proben einschließlich fragmentierte oder kleine Gewebeproben, die schwer zu Prozess-⁹. Ein Inselchen Einbettung Ansatz ist, unterbrechen die Inselchen in Agarose in einem Microcentrifuge Schlauch, Zentrifugieren pellet-das Material, Abrufen des Agar-Steckers dann verarbeiten und embed für^10,11-Schnitt. Extrahieren von verfestigten Probe von der Unterseite des Rohres ist zeitaufwändig und schwierig, was zu gelegentlichen Fragmentierung der Probe und Verletzungsgefahr. Die Inseln sind in der Spitze des Steckers, führt zu unzureichenden Inselchen Verteilung in Abschnitten, die von dieser Methode erhalten konzentriert. Der Runde Unterseite des Steckers erschwert einbetten, so dass eine kleine Insel-Armen Region für Schnitt dargestellt wird. Insgesamt führt diese Methode zu geringe Ausbeute und aufgehäuften Inselchen Verteilung in den sich daraus ergebenden Abschnitten.

Diese neue Methode ist eine vereinfachte und verbesserte Ansatz für die Vorbereitung der Insel Abschnitte. Inselchen sind konzentriert in einem kleinen Volumen und dann auf die glatte Oberfläche des einen Objektträger, eine kleine Scheibe mit den kleinen Inseln in einer Ebene zu bilden. Die Histogel-Insel-Scheibe ist für Paraffin, die Einbettung in eine verkürzte Dehydrierung und Xylol Infiltration Protokoll verarbeitet. Der bisherige Ansatz, der die Inseln in der Unterseite eines Microfuge Rohres konzentriert, wird auch als Vergleich durchgeführt. Diese neue Technik verbessert die Ausbeute an Inseln pro Abschnitt, die Aufteilung der Inseln in den einzelnen Abschnitten und nimmt weniger Zeit, die Insel-Blöcke auf Kassetten zu übertragen. Diese Technik eignet sich für kleine Insel Biologen oder andere Wissenschaftler studieren kleine Stücke des Gewebes, die Produktivität zu maximieren wollen verwenden eines Low-Fülle Gewebes durch die Messung mehrere Ergebnisse für ein einzelnes Sample in seiner nativen Gewebearchitektur.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tiere wurden durch die University of Massachusetts Medical School institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt. Menschlichen Inselchen Studien wurden von UMass Institutional Review Board bestimmt, nicht für IRB Überprüfung oder Befreiung zu qualifizieren, weil sie nicht den Gebrauch von menschlichen Probanden einbeziehen.

1. Insel Isolation und Kultur

1. Inselchen zu isolieren und getrennt von kontaminierenden exokrinen und duktalen Gewebe mit der Methode Ihrer Wahl.
   Hinweis: Diese Methode wurde mit kleinen Inseln isoliert von Kollagenase duktale Insufflation und Ficoll Trennung¹² (Nagetier) oder nach der Auslieferung Inselchen aus der integrierten Islet Vertriebsprogramm (IIDP¹³, Mensch) optimiert. Inselchen wurden mit einer Mikropipette P200 handverlesen.
2. Zur Optimierung der Morphologie der Insel ermöglichen Sie Inselchen in 10 mL komplette Insel Medium (RPMI mit 10 % FBS, Penicillin/Streptomycin und 5,5 Mmol/L Glucose) in eine Feuchte Kammer, die mit 5 % CO₂ bei 37 ° c über Nacht erholen Obwohl dieser Schritt nicht erforderlich ist, um Abschnitte zu erhalten, die Inseln sind nach einer Erholungszeit mehr intakt (siehe Abbildung 2).

(2) Insel Fixierung

1. Mit einer Low-Bindung-P200-Spitze, ca. 250 Inselchen äquivalente (IEQ)¹³ mit einem kalibrierten Raster unter einem Stereomikroskop in ein 1,5 mL geringe Bindung Microfuge Rohr aussuchen. Low-Bindung Tipps und Röhren reduzieren Inselchen Verlust.
2. Ermöglichen Sie Inselchen, sich an der Unterseite des Microfuge Rohres. Entfernen Sie die meisten überstand mit P200 pipettieren Spitze, kümmert sich nicht um alle Inseln zu entfernen.
3. Fügen Sie 1 mL PBS. Rohr in eine schwingende Eimer Zentrifuge zentrifugieren, bis die Geschwindigkeit 200 X g erreicht und dann Anhalten der Spins. Den überstand zu entfernen. Wiederholen Sie die PBS waschen, für eine Gesamtmenge von zwei Wäschen.
4. Fügen Sie 500 µL 10 % Formalin-Lösung oder Paraformaldehyd 4 % frisch zubereitet. 30 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Für die Ergebnisse bei dieser Methode getestet waren diese Fixierung Methoden zu unterscheiden. Kürzere Fixierung kann auch möglich sein; Es wird empfohlen, die Dauer der Fixierung für gewünschtes Ergebnis zu optimieren.
5. Entfernen Sie das Fixiermittel mit P200 Spitze.
6. Fügen Sie 1 mL PBS. Zentrifugieren Sie Rohr, bis die Geschwindigkeit 200 X g erreicht und dann Anhalten der Spins. Den überstand zu entfernen. Wiederholen Sie die PBS waschen, für eine Gesamtmenge von zwei Wäschen.
7. Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.

3. Vorbereitung der Insel CD (Abbildung 1)

1. Schmelzen Sie bei der ersten Verwendung des Gels (z. B. Histogel) bei 70 ° C zu und Aliquote in 1,5 mL Microfuge Rohre für langfristige Lagerung. Aliquoten Volumen ist nicht kritisch, da Aliquote wiederverwendet werden können.
2. Das Gel (ca. 100 µL pro Probe) bei 70 ° C warm, indem man Microfuge-Röhrchen mit Gel aliquoten in einem Heizblock eingestellt auf 70 ° c
3. Übertragen Sie Agarose blaue Perlen (10 µL für jede Probe) in einem 1,5 mL sauber Microfuge Rohr. Gründlich Aufschwemmen der Perlen vor dem pipettieren.
   Hinweis: Blaue Perlen werden mit den Inseln um visuelle Identifizierung des eingebetteten Materials in der Agarose-Taste und der paraffinblock bei gemischt. Die Anzahl der blauen Perlen verwendet, ist nicht entscheidend für das Ergebnis, aber vermeiden Sie übermäßige Perlen (> 5 x die Anzahl der Inseln) ermöglichen optimale Verteilung der Inselchen in Abschnitten.
4. Waschen Sie die blauen Perlen mit 1mL PBS, zweimal. Spinnen Sie für jedes waschen die Perlen 1 min bei 800 X g. Nach der zweiten Wäsche Aufschwemmen der Perlen im (n+ 2) x 10 µL PBS, wobei n die Anzahl der Probenröhrchen ist; zum Beispiel wäre das PBS-Volumen hinzu die Perlen für 2 Probenröhrchen 40 µL.
5. Zentrifugieren Sie der Microfuge Röhrchen mit Inselchen (kurze Spin 200 X g) und entfernen Sie die meisten des Überstands. Die Spitze einer 10 µL Mikropipette Spitze mit einer Schere oder einem Messer abgeschnitten und jedes Insel-Rohr, mit einer sauberen Spitze für jede Probe 10 µL Perlen verleihen. Verwechseln Sie nicht (zur Vermeidung von Inselchen zu verlieren).
6. Zentrifugieren Sie Inselchen und Perlen (kurze Spin 200 X g). Entfernen Sie so viel PBS wie möglich mit unbeschnittenen 10 µL Mikropipette Spitze.
7. Beschriften Sie den Objektträger für Probenidentifikation. Zwei bis drei Proben können auf jeder Folie zubereitet werden. Legen Sie die Folie, auf der Bank in der Nähe der Heizblock mit erwärmten Gel. Schneiden Sie die Spitzen der drei bis fünf 20 µL geringe Bindung Mikropipette Tipps pro Probe mit einer Rasierklinge oder Schere. Laden Sie zwei P20 Mikropipetten mit geschnittenen Tipps zum schnellen Wechsel von einem zum anderen ermöglichen.
8. Mit der ersten mikropipette, 15-20 µL warme Gel fügen Sie das Inselchen/Perlen Microfuge Rohr hinzu; sofort zu mischen, Luftblasen zu vermeiden; und übernehmen Sie die flüssigen Agar/Inseln/Perlen-Mischung auf die Folie zu bilden ein < 1 cm Durchmesser Scheibe. Legen Sie die Disk am Rand der Folie, so dass Platz für den äußeren Gel-Ring (nächster Schritt). Tippen Sie auf die Folie vorsichtig ein paar Mal um zu den kleinen Inseln und Perlen zu begleichen.
9. Fügen Sie mithilfe einer zweiten Mikropipette 20 µL warme Gel in das Probenröhrchen. Mit der ersten mikropipette, Mischung neue Gel mit alle verbleibenden Inseln/Perlen, wieder in den Heizblock Erwärmung, wenn es beginnt zu festigen, dann wenden Sie diese Mischung auf die Folie, um die original-CD. Wiederholen Sie bei Bedarf mit zusätzlichen vorgeschnittenen Tipps, bis die Disc die gewünschte Größe und Dicke ist.
   Hinweis: Handhabung der gelierten Disc ist einfacher, wenn der äußere Ring etwas dicker ist. 3 x 20 µL Gel ist in der Regel ausreichend. Dieser Schritt minimiert Verlust von kleinen Inseln durch Rohr Waschungen und fügt Insel-Armen Agarose an der Außenseite der Scheibe Scheibe Handhabung zu erleichtern.
10. Bereiten Sie jede Scheibe einzeln und verfolgen Sie vorsichtig beispielauftrag wenn mehrere Disks auf jeder Folie zu platzieren.
11. Legen Sie die Folien auf einer ebenen Fläche von nassem Eis, mit einem Deckel für 10 Minuten oder bis das Gel verfestigt sich. Es ist schwieriger, die Disc aus dem Glas zu schieben, wenn es trocknet.
12. Label-Biopsie Verarbeitung/Einbettung Gewebe Kassetten mit Bleistift, eine pro Probe. Trocknen Sie die Rückseite der Folie zu vermeiden, das blaue Papier anfeuchten.
13. Mit der stumpfen Kante einer Rasierklinge, schieben Sie die Disc in jede Richtung aus dem Glas zu befreien. Wenn es leicht gleitet, drücken Sie die Scheibe langsam aus den Mikroskop-Objektträger auf dem blauen Tissue-Papier. Legen Sie die Diskette, die flache Seite nach unten direkt auf dem Papier.
14. Falten Sie die Scheibe flach halten, das Papier um die Scheibe zu Bewegung zu verhindern, legen Sie die Disk in gefaltetes Papier in der Kassette und schließen die Kassette. Wenn die Disc aus dem Glas nicht sauber schieben, fügen mehr Gel bzw. die Folie, um für ein paar Minuten Eis zurück.
15. Tauchen Sie die Kassette mit PBS-Puffer in einen Becher füllen. Prozess für Paraffin einbetten am selben Tag für optimale Morphologie.

(4) Paraffin einbetten

Hinweis: Prozess Scheiben das Inselchen Gel, Paraffin-Blöcke mit einer abgekürzten Dehydrierung Serie wie unten beschrieben. Diese Technik wurde durch eine automatisierte Prozessor optimiert, aber manueller Bearbeitung sollten ähnliche Ergebnisse produzieren.

1. Tauchen Sie Kassetten in 85 % Ethanol, 15 Minuten lang.
2. Tauchen Sie Kassetten in 95 % igem Ethanol für 15 Minuten.
3. Tauchen Sie Kassetten in 100 % igem Ethanol für 15 Minuten. Wiederholen Sie zweimal für eine Gesamtmenge von drei Wäschen.
4. Tauchen Sie Kassetten in Xylol für 15 Minuten. Wiederholen Sie zweimal für eine Gesamtmenge von drei Wäschen.
5. Tauchen Sie Kassetten in geschmolzenem Paraffin für 10 Minuten.
6. Transfer-Kassetten zum frisch geschmolzenem Paraffin für 10-30 Minuten.
7. Vorsichtig öffnen der Kassette und packen Sie das Blaubuch. Entfernen Sie die Gel-Disc, die flache Oberfläche, die entgegengesetzt war auf dem Papier Überblick zu behalten. Die Scheibe in eine kleine Form mit (Insel-haltigen) Fläche nach unten, Parallel zu der Schnittfläche einbetten. Für den Stecker vorsichtig aus der Kassette herausnehmen und in eine kleine Form mit der Spitze in Richtung der Schnittfläche einbetten.

(5) Paraffin-Schnitt und Färbung

1. Beschriften Sie Dias nacheinander, wenn Schnittserien erforderlich sind.
2. Haben Sie 5 µm Paraffin Abschnitte durch eine erfahrene histotechnikers geschnitten. Um den Ertrag zu maximieren, speichern Sie alle Abschnitte, die Material enthalten. Im allgemeinen ermöglicht sammeln 20 Abschnitte Erfassung von die meisten des Materials.
3. Lagern Sie Abschnitten bei Raumtemperatur. Abschnitte sind Routine histologischen Flecke (z. B. H & E) und Immunfluoreszenz (z. B. Insulin, Glukagon und DAPI) zugänglich. Fixierung für andere Antigene, bei Bedarf zu optimieren.

Ergebnisse

Eine illustrierte schematische Darstellung der Schritte zur Vorbereitung der Gel-Disc ist in Abbildung 1dargestellt. Dieses Gel Scheibe Methodenergebnisse in Paraffin-Abschnitte, die eine ausreichende Anzahl von Inseln verteilt in einer Ebene um sinnvolle Quantifizierung der Ergebnisse enthalten. Abbildung 2 zeigt niedrige Vergrößerung Bilder der daraus resultierenden Abschnitte um die Anzahl der Inseln erfasst pro Abschnitt zu...

Diskussion

Diese modifizierte Gel-Disk-basierte Einbettungs-Methode bietet eine einfache, kostengünstige, und effiziente Möglichkeit, eine hohe Ausbeute an Inseln pro Abschnitt zu generieren. Bau der Gel-Disc auf einer flachen Glasoberfläche erleichtert Verbreitung Inselchen in eine gleichmäßige Verteilung über einen klar definierten Bereich. Verbreitung der Inseln in eine flache Scheibe bietet den Vorteil, setzen viele Inselchen in der Ebene des Abschnitts, Ertrag zu optimieren und damit weniger Inselchen verwendet werden. D...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Eppendorf tube	Norgen Bioteck Corp	P/N 10113
Ranin Classic Starter Kit	ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipette PR-2	ShopRanin	17008648
Low Binding Tip (1000 μL)	Genesee Scientific	24-430
Low Binding Tip (200 μL)	Genesee Scientific	24-412
Low Binding Tip (20 μL)	Genesee Scientific	24-404
Low Binding Tip (10 μL)	Genesee Scientific	24-401
10% Formalin solution	Sigma	HT501128
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
Heatblock	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Agarose blue beads- Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Dulbecco's PBS	Life technologies	14190-144
Tissue processing cassette	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 tissue processor	Thermo-Shandon LLC
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, INC	2701
Xylene	Fisher Chemical	X5SK-4
Paraffin	McCormick Scientific	39503002
Microtome	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
Insulin antibody	DAKO	A0564
Glucagon antibody	Sigma	G2654
Fluoroshield with DAPI	Sigma	F6057
Alex fluor 594 secondary antibodies	Life technologies	A11076
Alex fluor 488 secondary antibodies	Life technologies	A11001