متساوي القياس كونتراكتيليتي القياس الشريان المساريقي العلوي الماوس باستخدام أسلاك ميوجرافي

Summary

يتم استخدام تقنية ميوجراف الأسلاك للتحقيق في وظائف العضلات الملساء والأوعية الدموية، وأدوية جديدة للشاشة. نحن تقرير بروتوكول مفصلاً لقياس contractility متساوي القياس الشريان المساريقي العلوي الماوس وفحص جديد إرخاء العضلات الملساء والأوعية الدموية.

Abstract

يتم استخدام تقنية ميوجراف الأسلاك لتقييم كونتراكتيليتي للعضلات الملساء والأوعية الدموية في الرد على ديبولاريزيشن ويضع GPCR/مثبطات والمخدرات. ويستخدم على نطاق واسع في العديد من الدراسات على الوظائف الفسيولوجية للعضلات الملساء والأوعية الدموية والآلية المرضية لأمراض الأوعية الدموية مثل ارتفاع ضغط الدم، واستحداث أدوية ارتخاء العضلات الملساء. الفأر حيوان نموذجية مستخدمة على نطاق واسع مع مجموعة كبيرة من النماذج المرض والسلالات المحورة وراثيا. قدمنا هذا الأسلوب لقياس متساوي القياس تقلص الشريان المساريقي العلوي الماوس بالتفصيل. شريحة 1.4 ملم من الشريان المساريقي العلوي المقاومة الماوس معزولة وشنت في دائرة ميوجراف بتمرير اثنين من الأسلاك الصلب عن طريق التجويف به. بعد خطوات الموازنة والتطبيع، كان potentiated الجزء السفينة بحل عالية-ك⁺ مرتين قبل الفحص الانكماش. كمثال لتطبيق هذا الأسلوب في تطوير العقاقير، قمنا بقياس أثر ارتخاء مادة طبيعية الرواية، نيولينسينيني، معزولة عن عشب صيني، أجنة البذور لوتس (جذور اللوتس (جايرتن.) على الماوس المساريقي العلوي الشرايين. كانت تحفز أجزاء السفينة التي شنت على الدائرة ميوجراف مع حل عالية-ك⁺ . عند التوتر القوة وصلت إلى مرحلة متواصلة مستقرة، أضيفت الجرعات التراكمية من نيولينسينيني إلى الدائرة. وجدنا أن نيولينسينيني كان لها أثر ارتخاء تعتمد على الجرعة على تقلص العضلات الملساء، مما يشير إلى أن يتحمل نشاط محتمل ضد ارتفاع ضغط الدم. وباﻹضافة إلى ذلك، كما يمكن البقاء على قيد الحياة على الأقل 4 ساعات بعد تصاعد الجزء السفينة والحفاظ على كونتراكتيليتي الناجمة عن الحل عالية-ك⁺ لمرات عديدة، فإننا نقترح أن يمكن استخدام نظام ميوجراف سلك لعملية تستغرق وقتاً طويلاً لفحص المخدرات.

Introduction

وكان النظام ميوجراف السفينة الصغيرة المستخدمة هنا لقياس انكماش متساوي القياس من السفن الصغيرة المقاومة بأقطار داخلية تتراوح من 100 إلى 400 ميكرون. معزولة السفن الصغيرة (حوالي 2 مم طويل) أدرجت بأسلاك قطرها 40 ميكرومتر اثنين وكانت في ذلك الحين شنت على الفكين ميكرومتر-جانب محول طاقة والتتابع. كان هذا الأسلوب ميوجراف اقترح أولاً في عام 1972¹ وثم وضعت أساسا عن طريق مولفاني وله الزملاء^3،2،4،،من⁵⁶. والآن أسلوب ناضجة مع المعدات مستقرة وسهلة الأداء قياسية تطبيع الداخلي^7،،من⁸⁹. ونحن تستخدم هذا الأسلوب مع بعض التعديلات للقياسات في الشريان المساريقي العلوي الماوس.

خطوط العضلات الملساء والأوعية الدموية على جدران الأوعية الدموية كلها تقريبا. وظيفتها الأساسية لتوليد القوى من خلال تقلص في الاستجابة للمحفزات المختلفة. كونتراكتيليتي طبيعي للعضلات الملساء والأوعية الدموية أمر ضروري لتنظيم ضغط الدم والتغذية الملحق¹⁰. تنظيم نتائج ضغط الدم في مجموعة متنوعة من الأمراض، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم وفشل القلب واحتباس الدم. غير طبيعية واقترح العديد من الدراسات أن ضغط الدم غير طبيعي يرتبط دائماً مع اختلال العضلات الملساء والأوعية الدموية كونتراكتيليتي^7،11،،من¹²¹³. يسمح أسلوب ميوجراف التحقيق في كونتراكتيليتي متساوي القياس سفن الماوس المستحث بالمنبهات المختلفة بما في ذلك فاسوكونستريكتورس ومثبطات والمخدرات. قياسات ناجحة من الانكماش سوف تساعدنا على فهم آليات الحفاظ على ضغط الدم، وأمراض من أمراض الأوعية الدموية المرتبطة بالعضلات الملساء واستكشاف النهج العلاجية رواية.

العديد من الأعشاب الصينية قد استخدمت على نطاق واسع للعلاج السريري لأمراض الأوعية الدموية؛ ومع ذلك، مكوناتها الفعالة عادة ما زال غير معروف. وهكذا، عزل وتحديد المكونات الفعالة مهم جداً لتطوير أدوية جديدة. ميوجراف أسلاك متعددة التكنولوجيا يوفر نهج بسيط لفحص المكونات النشطة في الأعشاب. لقد أفادت دراسات عديدة باستخدام نظام ميوجراف سفينة صغيرة للتحقيق في تقلص الشريان المساريقي العلوي الماوس وتحديد المركبات الطبيعية مع النشاط المضادة ارتفاع ضغط الدم^12،،من¹³¹⁴. هنا، يمكننا وصف مفصل البروتوكول للأسلوب ميوجراف وتقييم أثر ارتخاء نيولينسينيني المعزولة من أجنة بذور اللوتس (جايرتنجذور اللوتس ). ¹⁴.

Protocol

وافق الحيوانية التلاعب "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة "نموذج الحيوان بحوث مركز نانجينغ".

1-حل إعداد

1. إعداد هيبيس-تيرودي الحل (ح تي) باستخدام 137.0 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل و 1.8 مم كاكل₂، 1 مم مجكل₂∙6H₂س، 5.6 ملم د-الجلوكوز و 10 مم هيبيس، 7.3-7.4 درجة الحموضة.
2. إعداد حل تيرودي حبيس دون الكالسيوم (Ca^{2 +}-مجاناً ح تي) استخدام مم 140.6 كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل، 1 مم مجكل₂∙6H₂س، 5.6 ملم د-الجلوكوز و 10 ملم حبيس، 7.3-7.4 درجة الحموضة.
3. إعداد حل تيرودي حبيس 124 مم بوكل (عالية ك⁺) 15.7 ملم كلوريد الصوديوم، مم 124.0 بوكل، كاكل 1.8 مم₂، 1 مم مجكل₂∙6H₂س، 5.6 ملم د-الجلوكوز، و 10 ملم حبيس، الأس الهيدروجيني باستخدام باستخدام 7.3-7.4.

2-تجربة إعداد

1. يسخن ح تي والحلول عالية-ك⁺ باستخدام حمام مائي 37 درجة مئوية.
2. قم بتشغيل نظام ميوجراف والبيانات اقتناء الأجهزة والكمبيوتر.
3. ملء بعناية جميع الدوائر ميوجراف مع 5 مل ح تي الحل.
4. ملء أطباق بيتري اثنين مع 20 مل من 4 ° ج ح تي و Ca^{2 +}-مجاناً ح تي الحلول، على التوالي، وتخزين على الجليد.
5. ملء طبق بيتري مغلفة 10 سم مع 20 مل من محلول ح تي، والحفاظ عليه في درجة حرارة الغرفة.

3-الماوس تشريح الشريان المساريقي العلوي

1. Euthanize العمر 8-12 أسبوع C57BL/6J الإناث أو الذكور ماوس بخلع عنق الرحم. دبوس الماوس باستمرار مع البطن مواجهة.
2. ترطيب البطن مع الإيثانول 70%. ثم قطع الجلد مع المقص على طول خط الوسط البطني من الفخذ، وجعل شقوق من بداية الشق الأول أسفل الساقين على كلا الجانبين. سحب الجلد مرة أخرى على كلا الجانبين؛ جعل شقوق مماثلة لفتح الصفاق.
3. باستخدام مقص، قص المريء والقولون والأنسجة الضامة الأخرى لعزل الجهاز الهضمي مع تغذية المفرج من الجسم تماما.
4. مع الملقط، نقل الجزء المعزول إلى الطبق الذي يحتوي على البرد ح تي إعدادها في الخطوة 2، 4، ولطف شطف الأنسجة في حل ح تي عدة مرات ليغسل الدم.
5. نقل الجزء المعزول في طبق بتري المغلفة بإعدادها في الخطوة 2، 5، وإجراء تشريح الشريان المساريقي العلوي في درجة حرارة الغرفة.
6. على نحو سلس المعدة وصائم، اللفائفي والاعور في اتجاه عقارب الساعة، ويعلقون على المعدة والاعور على الجانب الأيسر والأيمن، على التوالي.
7. تمتد السرير المفرج المساريقي العلوي وإصلاح الأمعاء باستخدام دبابيس لكشف تشريح الشرايين المساريقي العلوي.
   ملاحظة: في ظل هذه الظروف، الشرايين على رأس الأوردة.
8. تشغيل نقل مصدر الضوء مجهر مجسم، وتشريح الشرايين تحت المجهر. تأكد من أن الأنسجة كاملة هي مغمورة في الحل.
9. المشبك الأنسجة الدهنية حول الشرايين مع الملقط، وعزل الشرايين بقطع جميع الأنسجة الضامة مع مقص التشريح. تجنب إصابة الشرايين.

4-الشرياني تصاعد

1. نقل وتزج شجرة الشريان المساريقي العلوي في كاليفورنيا البارد^{2 +}-الحرة حل ح تي (أعد في الخطوة 2، 4) قبل لقط الشرايين الزائدة بالملقط.
2. اقتطاع نسبة 1.4 ملم من الشريان الدانية لجدار الأمعاء من ممر المساريقي العلوي، واستخدام الملقط اثنين لفتح كلا الجانبين من هذا الجزء من الشريان بعناية.
3. إعداد جزأين من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ طولها 2.5 سم، ووضعها في الطبق نفسه.
4. المشبك بلطف واحدة من نهاية الشريان باستخدام الملقط، وإدراج اثنين من الأسلاك بعناية في تجويف الشريان واحداً تلو الآخر مع مساعدة من الملقط آخر. تأكد من أن الأسلاك يتم الاحتفاظ بها مباشرة، ولا تلمس البطانة.
5. استخدام الملقط اثنين، المشبك اثنين من الأسلاك الصلب خارج السفينة الخيوط في وقت واحد، ونقل السفينة بعناية من طبق بيتري إلى غرفة ميوجراف كانت مليئة بحل ح تي (الخطوة 2، 3).
6. برغي الفكين بعيداً لإفساح المجال لتصاعد. المشبك كلا الجانبين من واحد من اثنين من الأسلاك تم إدراجها باستخدام الملقط اثنين، ومكان السفينة في الفجوة الفك (الشكل 1A).
7. التفاف على جانبي الأسلاك فرضت حول مسامير الفك متصلاً الميكرومتر (الشكل 1B).
8. إصلاح المسمار الأيسر بالتواء في اتجاه عقارب الساعة. تصويب السلك باستخدام الملقط الأيمن, ثم إصلاح المسمار الأيسر بالتواء في اتجاه عقارب الساعة (الشكل 1). تأكد من أن السفينة دائماً داخل الفجوة الفك، ولكن لا تلمس الفك لتجنب الضرر.
9. إغلاق الفكين هما استخدام الميكرومتر (الشكل 1). تأكد من جوز اثنين يتم إغلاق كافية ولكن أن لا تلامس بعضها البعض، وأن السلك غير المثبتة على رأس سلك ثابت.
10. استخدام الملقط الأيمن، بعناية إضعاف السلك مفكوك في زاوية الفك متصلة بقوة محول الطاقة، والتفاف من عكس اتجاه عقارب الساعة حول المسمار الجانب الأيمن (الشكل 1E). ثم، إصلاح المسمار. كرر هذه الخطوة على الجانب الأيسر من الأسلاك وإصلاح الجانب الأيسر المسمار (الشكل 1F).
11. تحريك الفكين قليلاً عن بعضها البعض بالتناوب بعناية الميكرومتر (الشكل 1). تجنب تمتد السفينة. استخدام الملقط لنقل الأسلاك إلى جانب ميكرومتر إلى الطائرة الأفقي للأسلاك إلى جانب محول طاقة. تدوير الميكرومتر بعناية حيث أن تتسع الفجوة بين فكي اثنين فقط لاثنين من الأسلاك.
12. كرر الخطوات من 4.2-4.11 جبل الشرايين على الدوائر الأخرى. توصيل جميع الدوائر بالمعدات وتغطية الدوائر، تعلق إمدادات الأكسجين 100% ومسبار درجة حرارة وبدء تشغيل التدفئة إلى 37 درجة مئوية. فتح رسم برامج الحاسوب واضغط على زر ابدأ في نافذة عرض الرسم البياني لبدء التسجيل.
13. حجته لحوالي 20 دقيقة.

5-التطبيع

ملاحظة: بغية توحيد الشروط التجريبية والحصول على استجابة فسيولوجية موثوقة من السفن، هو إجراء تطبيع اللازمة¹⁵. وفقا للعلاقة بين القوة النشطة ومحيط الداخلية للسفينة، النظام ميوجراف سلك لديها برنامج تطبيع قياسية لتقييم محيط الداخلية (IC) السفينة المحملة^{5،8، 9}. بإيجاز، لحساب IC (ميكرومتر) وقراءة الميكرومتر وإدخال القيمة كقيمة X ومحول إخراج القوة، أي يستريح الجدار التوتر (mN/مم)، كقيمة Y. البرنامج سوف يعود منحنى مجهزة من (X, Y) وحساب IC المقابلة لضغط ترانسمورال من 100 مم زئبق (IC₁₀₀). يتم تعيين السفينة إلى محيط الداخلية تم تسويتها (جيم₁) القصوى عند استجابة نشطة.

1. تعيين قوات إلى الصفر لجميع القنوات على الجهاز، وحجته لآخر 1-2 دقيقة.
2. حدد إعدادات التطبيع من "دمت القائمة، وقم بإعداد المعلمات كما يلي:
   معايرة العدسة (ملم/div): 0.36؛ تستهدف الضغط (الكوري): 13.3؛ IC₁/IC₁₀₀: 0.9؛ متوسط الوقت (بالثواني) على الإنترنت: 2؛ تأخير الوقت (بالثواني): 60. انقر فوق الزر موافق لإغلاق نافذة الإعدادات تطبيع دمت .
3. قم بتحديد قناة اهتمام من دمت القائمة لفتح نافذة تطبيع دمت للقناة المقابلة. أدخل القيم الثابتة في الإطار كما يلي: الأنسجة اندبوينتس a1: 0.1؛ الأنسجة اندبوينتس a2: 4؛ قطر السلك (ميكرومتر): 40. يعرض الإطار طول السفينة المحسوب ك 1.40 ملم.
4. قراءة الميكرومتر الدائرة الأنسجة المناسبة. أدخل القيمة في المربع القراءة ميكرومتر ، وانقر فوق الزر إضافة نقطة . هذه القيمة هي القيمة الأولى من س (X0). بعد فترة تأخير s 60، يعرض الإطار القوة والضغط الفعال (أرتب) المقابلة لهذه القيمة ميكرومتر. في نفس الوقت، يصبح المربع ميكرومتر القراءة النشطة.
5. تمتد السفينة يجري تطبيعها بتحول الميكرومتر في اتجاه عقارب الساعة. أدخل قيمة ميكرومتر في المربع القراءة ميكرومتر ، وانقر فوق الزر إضافة نقطة . الانتظار لفترة تأخير 60 s مرة أخرى.
6. كرر الخطوة 5، 5، لا تزال تمتد السفينة، وإضافة قيم ميكرومتر حتى النافذة بعرض قيمة "X ميكرومتر₁"، الذي هو الإعداد ميكرومتر المحسوبة المطلوبة على امتداد السفينة إلى IC₁.
7. تعيين الميكرومتر X القيمة₁ .
   ملاحظة: أن التوتر تطبيع هو عادة mN 1-2.

6. تسجيل تقلص الشريان

ملاحظة: تم إعداد جميع الحلول، بما في ذلك ح تي والحل عالية-ك⁺ المستخدمة في هذا القسم، في الخطوة 2، 1.

1. بعد التطبيع وحجته السفينة في الدائرة لمدة 15-20 دقيقة.
   ملاحظة: هذه لا حاجة إلى تغيير الحل في هذه الخطوة.
2. تحدي السفينة مع الحل عالية-ك⁺ مرتين.
   1. للطعن في السفينة، يحل محل الحل ح تي مع 5 مل من محلول عالي ك⁺ للحث على تقلص مدة 10 دقيقة، تليها الغسيل مع 5 مل من محلول ح تي 3-4 مرات.
      ملاحظة: قد تقلص نموذجي قوة قصوى 3 mN وقوة المطرد مستمر حول 2.5 mN¹². إذا كان التحدي الأول يولد قوة قصوى أدناه 2.5 mN أو يقلل من قوة مستمرة مع مرور الوقت أو التحدي الثاني الذي يولد قوة أقل بكثير من الجرعة المرة الأولى، يتم تجاهل السفينة ولن تستخدم لإجراء مزيد من التحقيقات.
3. تحدي السفينة مع 5 مل من محلول عالي ك⁺ للحث على الانكماش. بعد 5 دقائق، إضافة 0.5 ميليلتر من حل الأسهم (10 ملم في [دمس]) نيولينسينيني¹⁴ في قاعة للاسترخاء السفينة بتركيز 1 ميكرومتر نيولينسينيني نهائية.
4. عندما تكون القوة مستقرة (وهذا عادة ما يستغرق عدة دقائق)، إضافة آخر ميليلتر 0.5 لحل نيولينسينيني الأسهم في الدائرة لزيادة التركيز إلى 2 ميكرومتر. أضف 1 ميليلتر حل الأسهم في كل مرة لزيادة التركيز إلى 4، 6، 8 و 10 ميكرون لتوليد t أنه منحنى الاستجابة للجرعة.
   ملاحظة: الأسهم وتركيزات العامل تختلف بين المخدرات.

النتائج

ونحن قياس contractility متساوي القياس الشريان المساريقي العلوي الماوس باستخدام نظام ميوجراف أسلاك متعددة وقيمت أثر ارتخاء نيولينسينيني تنقيته من أجنة بذور اللوتس (جايرتنجذور اللوتس ). ¹⁴-الشريان المساريقي العلوي المقاومة الماوس كانت معزولة وتنظيفها من الأنس...

Discussion

ارتفاع ضغط الدم تحد صحة العامة على نطاق واسع نظراً لحدوث مضاعفات خطيرة، بما في ذلك القلب والأوعية الدموية و أمراض الكلي¹⁶. فهم الآلية المرضية لارتفاع ضغط الدم، واستكشاف المزيد من الأدوية الخافضة للضغط قد أصبح مهمة ملحة في هذا المجال. ولدت ضغط الدم والحفاظ على المقاومة المحيطي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi wire myograph system	DMT	610-M
Stainless steel wire	DMT	400447
Geuder dissection scissor	DMT	400431
Dumont forceps	DMT	300413
PowerLab/8SP	ADInstruments	ML785
Software	ADInstruments	LabChart 5
NaCl	SigmaAldrich	S5886
KCl	SigmaAldrich	P5405
CaCl2	SigmaAldrich	C4901
MgCl2·6H2O	SigmaAldrich	M2393
D-Glucose	SigmaAldrich	G6152
HEPES	Sangon Biotech	A100511-0250
NaOH	SigmaAldrich	S8045
DMSO	SigmaAldrich	D2650