Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography

Summary

הטכניקה myograph החוט משמש כדי לחקור פונקציות השריר החלק בכלי הדם, תרופות חדשות מסך. אנחנו מדווחים על פרוטוקול מפורט עבור מודדים את contractility איזומטרי של עורק מצע המעי העליון העכבר, הקרנת מרפה החדש של השריר החלק בכלי הדם.

Abstract

הטכניקה myograph החוט משמש כדי להעריך את contractility של כלי הדם השרירים החלקים בתגובה depolarization, GPCR אגוניסטים/מעכבי, סמים. זה נמצא בשימוש נרחב מחקרים רבים בנושא פונקציות פיזיולוגיים של השריר החלק בכלי הדם, בפתוגנזה של כלי דם מחלות כגון יתר לחץ דם, ופיתוח של תרופות להרפיית שריר חלק. העכבר הוא חיה מודל נפוץ עם בריכה גדולה של מודלים של המחלה, זנים מהונדסים. הצגנו בשיטה זו כדי למדוד את התכווצות איזומטרי של העכבר עורק מצע המעי העליון בפירוט. קטע מ מ 1.4 של עורק מצע המעי העליון ההתנגדות העכבר היה מבודד, רכוב על תא myograph על-ידי העברת שני חוטי פלדה דרך לומן שלה. לאחר צעדים equilibration, נורמליזציה, קטע הקיבול היה potentiated על ידי פתרון גבוהה-K⁺ פעמיים לפני וזמינותו התכווצות. כדוגמה של היישום של שיטה זו של פיתוח תרופות, מדדנו את השפעת להרפיית הרומן חומר טבעי, neoliensinine, מבודד עשבים סיניים, העוברים של הזרע לוטוס (Nelumbo nucifera Gaertn..) על העכבר מצע המעי העליון העורקים. הקטעים כלי רכוב על תא myograph היו מגורה עם פתרון גבוהה-K⁺ . כאשר המתח כוח הגיעה תקופה ממושכת יציב, מינונים מצטברים של neoliensinine נוספו אל התא. מצאנו את שזה neoliensinine הייתה השפעה להרפיית למינון על התכווצות השריר החלק, ובכך רומז כי היא נושאת פעילות פוטנציאליות נגד יתר לחץ דם. בנוסף, כפי קטע הקיבול יכול לשרוד לפחות 4 שעות לאחר הרכבה ולתחזק contractility שנגזרות הפתרון גבוהה-K⁺ כי פעמים רבות, אנו ממליצים כי מערכת myograph תיל עשוי לשמש עבור התהליך זמן רב של והתרופות הקרנה.

Introduction

המערכת myograph כלי קטן המשמש כאן הייתה למדידת איזומטרי התכווצות של כלי התנגדות קטן עם קטרים פנימי 100 ועד 400 מיקרומטר. מבודד כלי שיט קטנים (כ-2 מ מ אורך) הוכנסו על ידי שני חוטים קוטר 40-מיקרומטר, היו אז רכוב על הלסתות מיקרומטר-צד וצד מתמר ברצף. טכניקה זו myograph היה הציע לראשונה בשנת 1972¹ ולאחר מכן פיתחו בעיקר על ידי Mulvany ו שלו עמיתים^2,3,4,5,6. עכשיו זה טכניקה בוגרת עם ציוד יציב, ביצועים קל ו^8,97,הליך סטנדרטי נורמליזציה. אנחנו מנוצל בשיטה זו עם כמה שיפורים עבור מידות עורק מצע המעי העליון העכבר.

השריר החלק בכלי הדם קווים הקירות של כמעט כל כלי הדם. הפונקציה הבסיסית שלהם היא לייצר כוחות באמצעות התכווצות בתגובה לגירויים שונים. Contractility נורמלי של השריר החלק בכלי הדם חיונית ויסות לחץ דם, תזונה תוספת של¹⁰. חריג ויסות לחץ דם תוצאות במגוון רחב של מחלות, כולל יתר לחץ דם, אי ספיקת לב, ischaemia. מספר מחקרים הראו כי לחץ דם חריג קשורה תמיד השריר החלק בכלי הדם מתפקדת contractility^7,11,12,13. שיטת myograph מאפשרת חקירת contractility איזומטרי של העכבר כלי המושרה על ידי גירויים שונים כולל vasoconstrictors, מעכבי וסמים. מדידות מוצלחת של התכווצות יסייע לנו להבין את המנגנונים של לחץ דם ותחזוקה בפתוגנזה של מחלות הקשורות השריר החלק בכלי הדם, וכן לבחון גישות טיפוליות הרומן.

צמחי מרפא סיניים רבים היה בשימוש נרחב לטיפול קלינית של מחלות לב וכלי דם; עם זאת, למרכיביהם יעיל בדרך כלל נשאר לא ידוע. לפיכך, בידוד וזיהוי של הרכיבים יעיל הוא מאוד חשוב עבור פיתוח תרופות חדישות. האזנה מרובה myograph הטכנולוגיה מציעה גישה פשוטה לסינון הרכיבים הפעילים של עשבי תיבול. יש דיווח על מספר מחקרים באמצעות מערכת myograph כלי קטן לחקור התכווצות עורק מצע המעי העליון העכבר ואנו לזהות תרכובות טבעיות עם פעילות אנטי-יתר לחץ דם^12,13,14. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור פעולת השירות myograph והערכת השפעת מרפה neoliensinine מבודדת מעוברים של זרע הלוטוס (GaertnNelumbo nucifera ). ¹⁴.

Protocol

מניפולציות בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של האוניברסיטה מודל החיה מחקר מרכז של נאנג'ינג.

1. פתרון הכנה

1. להכין פתרון HEPES-Tyrode (H-T) באמצעות 137.0 מ"מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, CaCl 1.8 מ מ₂, 1 מ מ MgCl₂∙6H₂O, 5.6 מ מ D-גלוקוז ו 10 מ מ HEPES, pH 7.3-7.4.
2. להכין HEPES-Tyrode פתרון ללא סידן (Ca^{2 +}-חינם H-T) באמצעות מ"מ 140.6 NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 1 מ MgCl₂∙6H₂O, 5.6 מ מ D-גלוקוז ו- 10 מ מ HEPES, pH 7.3-7.4.
3. להכין HEPES-Tyrode פתרון באמצעות 124 מ"מ אשלגן (K גבוה⁺) באמצעות 15.7 מ מ NaCl, 124.0 מ מ. אשלגן כלורי, מ מ 1.8 CaCl₂, 1 מ MgCl₂∙6H₂O, 5.6 מ מ D-הגלוקוז, ו- 10 מ מ HEPES, pH 7.3-7.4.

2. ניסוי הכנה

1. מחממים H-T ו פתרונות High-K⁺ שימוש באמבט מים 37 ° C.
2. הפעל את מערכת myograph, נתוני רכישת חומרה ומחשב.
3. למלא בקפידה צ'יימברס myograph כל 5 מ"ל של H-T פתרון לכל.
4. למלא שתי צלחות פטרי עם 20 מ של 4 ° C H-T ו- Ca^{2 +}-ללא פתרונות H-T, בהתאמה, ולאחסן על קרח.
5. מילוי ס מ-10 מצופה פטרי עם 20 מ של H-T פתרון ולתחזק אותה בטמפרטורת החדר.

3. מצע המעי העליון העכבר עורק

1. המתת חסד של 8-12-בת שבוע C57BL/6J נשית או גברית העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. להצמיד את העכבר עם הבטן שלו פונה כלפי מעלה.
2. להרטיב את הבטן עם 70% אתנול. ואז, לחתוך את העור עם מספריים לאורך הקו האמצעי הגחון מהמפשעה, ולבצע חתכים מנקודת ההתחלה של החתך הראשוני כלפי מטה הרגליים משני הצדדים. משוך את העור בחזרה משני הצדדים; לעשות חתכים דומה לפתיחה של הצפק.
3. בעזרת מספריים, חותכים את לוושט, המעי הגס, אחרים ורקמות לבודד לחלוטין על מערכת העיכול עם האכלה להערכת מן הגוף.
4. עם מלקחיים, להעביר את המקטע מבודד המנה המכיל את הקור H-T מוכן בשלב 2.4, ולשטוף בעדינות את הרקמה בפתרון H-T מספר פעמים כדי לשטוף את הדם.
5. להעביר את המקטע מבודד לתוך הפטרי מצופה מוכן בשלב 2.5, ולבצע עורק מצע המעי העליון בטמפרטורת החדר.
6. להחליק את קיבה, מעי, מעי ו caecum בכיוון השעון, להצמיד את הבטן ואת caecum בצד ימין ועל שמאל, בהתאמה.
7. למתוח את המיטה להערכת מצע המעי העליון ותקן המעי עם סיכות כדי לחשוף את העורקים מצע המעי העליון גזור.
   הערה: בתנאים אלה, העורקים הם מעל הורידים.
8. הפעל את מקור האור שידור של מיקרוסקופ סטריאוסקופי, לנתח את העורקים מתחת למיקרוסקופ. ודא כי הרקמה כולה הוא שקוע הפתרון.
9. תהדק את רקמות adipose סביב העורקים עם מלקחיים, לבודד את העורקים על ידי כריתת כל אל הרקמות במספריים לנתיחה. הימנע ופצעו את העורקים.

4. עורקי הרכבה

1. העברה, לטבול את העץ עורק מצע המעי העליון לתוך קר Ca^{2 +}-חינם פתרון H-T (להכין בשלב 2.4) על ידי מחבר חובק למעקה העורקים עודף עם מלקחיים.
2. לחתוך חלק מ מ 1.4 של העורק proximal לקיר המעי של ארקייד מצע המעי העליון, והשתמש מלקחיים שני כדי לפתוח את שני הצדדים של קטע עורק זה בזהירות.
3. להכין שני מקטעים של פלדת אל-חלד חוט 2.5 ס מ אורך, למקם אותם לתוך אותה המנה.
4. הצמד בעדינות את קצה אחד של העורק באמצעות מלקחיים והוסף בקפידה שני חוטי לתוך לומן של העורק אחד עם עזרה של מלקחיים אחר. ודא החוטים נשמרים ישר אל תיגע של אנדותל.
5. בעזרת מלקחיים שני, מהדק את שני חוטי פלדה מחוץ הספינה משורשרות בו זמנית, בזהירות להעביר את כלי הקיבול הפטרי לתא myograph מילא בעבר עם פתרון H-T (שלב 2.3).
6. בורג הלסתות בנפרד כדי לפנות מקום עבור הרכבה. תהדק את שני הצדדים של אחד שני החוטים שנוספו באמצעות מלקחיים שני, ולמקם את כלי הקיבול הפער הלסת (איור 1 א').
7. לעטוף את שני צידי החבל בחוזקה סביב הברגים של הלסת מחובר של מיקרומטר (איור 1B).
8. לתקן את הבורג השמאלי על ידי סיבוך עם כיוון השעון. ישרו את החוט בעזרת המלקחיים הימנית ולאחר מכן לתקן את הבורג הימני על ידי סיבוך עם כיוון השעון (איור 1C). ודא כי הכלי הוא תמיד בתוך הפער הלסת, אבל אל תגעו הלסת כדי למנוע נזק.
9. סגירת הלסתות שני שימוש של מיקרומטר (איור 1D). ודא כי שתי הלסתות נמצאים מספיק קרוב אבל זה שלא יגעו אחד את השני, כי החוט מבולבל הוא בראש החוט קבוע.
10. עם המלקחיים הימנית, מקפלים את החוט מוברגת בפינה של הלסת מחובר כדי לאלץ את מתמר, ובזהירות לעטוף את זה עם כיוון השעון מסביב הבורג צד ימין (איור 1E). לאחר מכן, לתקן את הבורג. חזור על שלב זה בצד שמאל של התיל ולתקן את הבורג מצד ימין (איור 1F).
11. להעביר את הלסתות פשוקות מתחלפות בקפידה את מיקרומטר (איור 1 ג'י). הימנע מתיחה הכלי. להשתמש מלקחיים כדי להעביר את החוט שבצד מיקרומטר במישור האופקי של החוט על הצד מתמר. לסובב את מיקרומטר בקפידה כך הפער בין שתי הלסתות יכול להכיל רק את שני החוטים.
12. חזור על שלבים 4.2 – 4.11 להר העורקים על גבי התאים האחרים. להתחבר כל התאים הציוד, לכסות את התאים, לצרף את אספקת חמצן 100% ובדיקה טמפרטורה, להפעיל חימום כדי 37 מעלות צלזיוס. פתח את תוכנת יצירת תרשימים, לחץ על לחצן התחל על חלון תצוגת תרשים כדי להתחיל להקליט.
13. Equilibrate למשך כ 20 דקות.

5. נורמליזציה

הערה: כדי לתקנן את התנאים ניסיוני וכדי להשיג אמין תגובתיות פיזיולוגית של כלי, הליך נירמול הוא הכרחי¹⁵. לפי היחס בין כוח פעיל לבין היקף פנימי של כלי השיט, מערכת myograph חוט יש תוכנית נורמליזציה סטנדרטי כדי להעריך את היקף פנימי (IC) של כלי הנטען^{5,8, 9}. בקצרה, כדי לחשב IC (מיקרומטר), לקרוא את מיקרומטר, קלט את הערך כמו הערך של X והמתמר פלט כוח, קרי, נח קיר מתח (mN/מ מ), כמו Y הערך. התוכנית להחזיר עיקול מצויד של (X, Y) ולחשב את IC המתאים בלחץ transmural של 100 מ מ כספית (₁₀₀IC). הספינה מוגדר היקף פנימי מנורמל (IC₁) כאשר התגובתיות פעיל הוא מקסימלי.

1. הגדר כוחות כאפס עבור כל הערוצים במכשיר, equilibrate עוד 1-2 דקות.
2. בחר הגדרות נורמליזציה של "תפריט DMT, ולהגדיר הפרמטרים כדלקמן:
   עינית כיול (מ מ/div): 0.36; המטרה לחץ (kPa): 13.3; IC-₁-/IC-₁₀₀: 0.9; באינטרנט בממוצע זמן (בשניות): 2; לעכב את זמן (בשניות): 60. לחץ על הלחצן אישור כדי לסגור את חלון הגדרות נורמליזציה DMT .
3. בחר הערוץ של עניין DMT תפריט כדי לפתוח חלון נורמליזציה DMT עבור הערוץ המתאים. הזן את הערכים קבוע לתוך החלון כדלקמן: רקמת והגישור a1: 0.1; רקמות והגישור a2: 4; קוטר החוט (מיקרומטר): 40. החלון מציג את אורך הכלי מחושב 1.40 מ מ.
4. קרא את מיקרומטר לשכת הרקמה המתאימה. הזן את הערך בתיבה קריאה מיקרומטר , ולחץ על לחצן הוסף נקודת . ערך זה הוא הערך ההתחלתי של X (X0). לאחר זמן השהיה s 60, החלון מציג את הכוח והלחץ יעיל (ERTP) המתאים לערך זה מיקרומטר. במקביל, תיבת מיקרומטר הקריאה הופכת לפעילה.
5. למתוח את הכלי להיות מנורמל ע מיקרומטר נגד כיוון השעון. הזן את הערך מיקרומטר לתוך התיבה מיקרומטר קריאה , ולחץ על לחצן הוסף נקודת . לחכות זמן השהיה של 60 s שוב.
6. חזור על שלב 5.5, להמשיך למתוח את כלי הקיבול, והוספת ערכי מיקרומטר עד החלון מציג את הערך של "מיקרומטר X₁", אשר הוא ההגדרה מיקרומטר מחושב נדרש למתוח את כלי הקיבול שלו IC₁.
7. הגדר את מיקרומטר ל X ערך₁ .
   הערה: המתח מנורמל בדרך כלל 1-2 mN.

6. העורק התכווצות הקלטה

הערה: כל הפתרונות, כולל H-T ו- High-K⁺ פתרון להשתמש בסעיף זה, הוכנו בשלב 2.1.

1. לאחר נורמליזציה, equilibrate את כלי הקיבול בבית הבליעה למשך 15-20 דקות.
   הערה: אלה הוא אין צורך לשנות את הפתרון בשלב זה.
2. לאתגר את הכלי עם פתרון גבוהה-K⁺ פעמיים.
   1. לאתגר את כלי הקיבול, החלף פתרון H-T 5 מ של High-K⁺ פתרון כדי לגרום להתכווצות למשך 10 דקות, ואחריו כביסה עם 5 מ של H-T פתרון 3 - 4 פעמים.
      הערה: התכווצות טיפוסי יש כוח מקסימלי 3 mN וכוח מתמשכת מתמיד סביב 2.5 mN¹². אם האתגר הראשון יוצר כוח מקסימלי מתחת 2.5 mN או הכוח מתמשכת יורדת עם הזמן, או האתגר השני יוצר כוח נמוך הרבה יותר המינון בפעם הראשונה, כלי הקיבול נמחקת, לא ישמש לחקירה נוספת.
3. לאתגר את הכלי עם 5 מ של High-K⁺ פתרון כדי לגרום להתכווצות. לאחר 5 דקות, להוסיף 0.5 µL של מניות פתרון (10 מ מ דימתיל סולפוקסיד) neoliensinine¹⁴ אל החדר להירגע הלכנו לאכול ריכוז 1 מיקרומטר neoliensinine הסופי.
4. כאשר הכוח הוא יציב (זה בדרך כלל לוקח מספר דקות), להוסיף עוד 0.5 µL של פתרון מניות neoliensinine לתוך החדר כדי להגדיל את ריכוז 2 מיקרומטר. להוסיף 1 µL של הפתרון מניות בכל פעם כדי להעלות את ריכוז 4, 6, 8 ו- 10 מיקרומטר לייצר t הוא מנה-תגובה עקומה.
   הערה: המניות ואת העבודה ריכוזים משתנים בין תרופות.

תוצאות

אנו למדוד את contractility איזומטרי של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות מערכת האזנה מרובה myograph, העריך את השפעת להרפיית neoliensinine מכל העוברים זרע הלוטוס (GaertnNelumbo nucifera ). ¹⁴. עורק מצע המעי העליון ההתנגדות העכבר היה מבודד, ניקה של רקמות החיבור ולחתוך לחלקים 1.4-mm. קטע ?...

Discussion

יתר לחץ דם הוא אתגר בריאות הציבור נפוצה בשל סיבוכים חמורים, כולל הלב וכלי הדם שלה מחלות כליה¹⁶. להבנת בפתוגנזה של יתר לחץ דם, לחקור יותר תרופות נגד יתר לחץ דם הפך להיות משימה דחופה בתחום זה. לחץ דם הוא נוצר ומתוחזק על ידי התנגדות היקפית של מחזור הדם. על פי החוק של Poiseuille, העורקים קט?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi wire myograph system	DMT	610-M
Stainless steel wire	DMT	400447
Geuder dissection scissor	DMT	400431
Dumont forceps	DMT	300413
PowerLab/8SP	ADInstruments	ML785
Software	ADInstruments	LabChart 5
NaCl	SigmaAldrich	S5886
KCl	SigmaAldrich	P5405
CaCl2	SigmaAldrich	C4901
MgCl2·6H2O	SigmaAldrich	M2393
D-Glucose	SigmaAldrich	G6152
HEPES	Sangon Biotech	A100511-0250
NaOH	SigmaAldrich	S8045
DMSO	SigmaAldrich	D2650