Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

Riepilogo

La tecnica di myograph di filo è utilizzata per studiare le funzioni muscolari lisce e schermo nuove droghe. Segnaliamo un protocollo dettagliato per misurare la contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica del mouse e per lo screening di nuovi farmaci rilassanti di muscolo liscio vascolare.

Abstract

La tecnica di myograph di filo viene utilizzata per valutare la contrattilità della muscolatura liscia vascolare in risposta alla depolarizzazione, GPCR agonisti/inibitori e farmaci. È ampiamente usato in molti studi sulle funzioni fisiologiche del muscolo liscio vascolare, la patogenesi di malattie vascolari quali l'ipertensione e lo sviluppo di farmaci miorilassanti muscolo liscio. Il mouse è un animale di modello ampiamente usato con una grande piscina di modelli di malattia e ceppi geneticamente modificati. Abbiamo introdotto questo metodo per misurare la contrazione isometrica dell'arteria mesenterica del mouse in dettaglio. Un segmento di 1.4 millimetri dell'arteria mesenterica resistenza del mouse è stato isolato e montato su una camera di myograph passando due fili di acciaio attraverso il relativo lumen. Dopo i passaggi di equilibrazione e normalizzazione, il segmento di vaso è stato rafforzato da una soluzione di high-K⁺ due volte prima del dosaggio di contrazione. Come un esempio dell'applicazione di questo metodo nello sviluppo della droga, abbiamo misurato l'effetto rilassante di una nuova sostanza naturale, neoliensinine, isolata da un'erba cinese, embrioni del seme del loto (Nelumbo nucifera (Gaertn.) mouse mesenterica arterie. I segmenti di nave montati sulla camera di myograph sono stati stimolati con una soluzione di high-K⁺ . Quando la tensione di forza ha raggiunto una fase stabile e sostenuta, dosi cumulative di neoliensinine sono stati aggiunti alla camera. Abbiamo trovato che neoliensinine aveva un effetto miorilassante dose-dipendente sulla contrazione del muscolo liscio, così suggerendo che esso rechi potenziale attività contro l'ipertensione. Inoltre, come il segmento di nave può sopravvivere almeno 4 ore dopo il montaggio e mantenere la contrattilità indotta dalla soluzione high-K⁺ per molte volte, ci suggeriscono che il sistema di myograph di filo può essere utilizzato per il lungo processo di screening di stupefacenti.

Introduzione

Il sistema di myograph piccolo vascello usato qui era per misurare la contrazione isometrica dei vasi di piccola resistenza con diametri interni che vanno da 100 a 400 µm. isolato piccoli vasi (circa 2 mm di lunghezza) sono stati inseriti da due fili di diametro da 40 µm e sono stati quindi montato sulle mascelle micrometro-sul lato e trasduttore in modo sequenziale. Questa tecnica di myograph era in primo luogo suggerita in 1972¹ e poi sviluppata principalmente da Mulvany e suoi colleghi^2,3,4,5,6. Ora è una tecnica matura con attrezzatura stabile, prestazione facile e una normalizzazione standard procedura^7,8,9. Abbiamo utilizzato questo metodo con alcune modifiche per misurazioni nell'arteria mesenterica del mouse.

Muscolo liscio vascolare linee le pareti dei vasi sanguigni quasi tutti. La loro funzione fondamentale è quello di generare forze attraverso la contrazione in risposta a vari stimoli. La normale contrattilità del muscolo liscio vascolare è essenziale per la regolazione della pressione arteriosa e nutrizione supplemento¹⁰. Regolazione anormale della pressione sanguigna si traduce in una varietà di malattie, compreso ipertensione, infarto e ischemia. Parecchi studi hanno suggerito che anomala della pressione sanguigna è sempre associata a muscolo liscio vascolare disfunzionale contrattilità^7,11,12,13. Il metodo myograph consente di indagine di isometrica contrattilità dei vasi del mouse indotto da vari stimoli, tra cui i vasocostrittori, inibitori e farmaci. Misure di successo di contrazione ci aiuterà a comprendere i meccanismi di mantenimento della pressione sanguigna e la patogenesi delle malattie vascolari del muscolo liscio-collegato e di esplorare nuovi approcci terapeutici.

Molte erbe cinesi sono stati ampiamente usate per il trattamento clinico delle malattie vascolari; Tuttavia, la loro efficaci ingredienti solitamente rimangono sconosciuti. Quindi, isolamento e identificazione dei componenti efficaci è molto importante per lo sviluppo di nuovi farmaci. La tecnologia multi-filo myograph offre un approccio semplice per lo screening di componenti attivi in erbe. Abbiamo segnalato diversi studi utilizzando il sistema di myograph dei piccoli vasi per indagare la contrazione dell'arteria mesenterica del mouse e identificato composti naturali con attività anti-ipertensione^12,13,14. Qui, descriviamo il dettagliato protocollo per il metodo di myograph e di valutare l'effetto rilassante del neoliensinine isolato dagli embrioni dei semi di loto (Nelumbo nucifera Gaertn.) ¹⁴.

Protocollo

Manipolazioni degli animali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università modello animale ricerca centro di Nanchino.

1. soluzione preparazione

1. Preparare la soluzione di Tyrode HEPES (H-T) utilizzando 137,0 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 1mm MgCl₂∙6H₂O, 5,6 mM D-glucosio e 10 mM HEPES, pH 7,3-7,4.
2. Preparare soluzione HEPES-Tyrode senza calcio (Ca^{2 +}-libero H-T) utilizzando 140,6 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5,6 mM D-glucosio e 10 mM HEPES, pH 7,3-7,4.
3. Preparare soluzione HEPES-Tyrode utilizzando 124 mM KCl (alta K⁺) utilizzando 15,7 mM NaCl, 124,0 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 1mm MgCl₂∙6H₂O, 5,6 mM D-glucosio e 10 mM HEPES, pH 7,3-7,4.

2. esperimento preparazione

1. Preriscaldare il H-T e soluzioni High-K⁺ usando un bagno di acqua di 37 ° C.
2. Accendere il computer, di sistema di myograph e di hardware di acquisizione dati.
3. Riempire con cura tutte le myograph camere con 5 mL di soluzione di H-T ogni.
4. Riempire due capsule di Petri con 20 mL di 4 ° C H-T e Ca^{2 +}-free soluzioni H-T, rispettivamente e conservare il ghiaccio.
5. Riempire un piatto Petri ricoperto di 10 cm con 20 mL di soluzione di H-T e mantenerla a temperatura ambiente.

3. dissezione dell'arteria mesenterica Mouse

1. Eutanasia di un mouse di C57BL/6J 12-week-old 8 femmina o maschile di dislocazione cervicale. Pin il mouse verso il basso con l'addome rivolto verso l'alto.
2. Inumidire l'addome con etanolo al 70%. Quindi, tagliare la pelle con le forbici lungo la linea mediana ventrale dall'inguine e fare incisioni dall'inizio della prima incisione verso il basso per le gambe su entrambi i lati. Tirare la pelle indietro su entrambi i lati; fare delle incisioni simili per aprire il peritoneo.
3. Utilizzando le forbici, tagliare dell'esofago, del colon e altri tessuti connettivi per isolare completamente il tratto gastrointestinale con alimentazione sistema vascolare dal corpo.
4. Con il forcipe, spostare il segmento isolato nel piatto contenente il freddo H-T preparata al punto 2.4 e sciacquare delicatamente il tessuto in H-T soluzione diverse volte per lavare via il sangue.
5. Trasferire il segmento isolato in di Petri rivestito preparata al punto 2.5 ed eseguire la dissezione dell'arteria mesenterica a temperatura ambiente.
6. Appianare la stomaco, digiuno, dell'ileo e cieco in senso orario, e pin lo stomaco e l'intestino cieco sul lato sinistro e destro, rispettivamente.
7. Allungare il letto di vascolarizzazione mesenterica e difficoltà dell'intestino con i perni per esporre le arterie mesenteriche dissecate.
   Nota: In queste condizioni, le arterie sono in cima le vene.
8. Attivare la sorgente di luce di trasmissione di un microscopio stereoscopico e sezionare le arterie sotto il microscopio. Assicurarsi che l'intero tessuto sia immerso nella soluzione.
9. Morsetto del tessuto adiposo intorno le arterie con il forcipe e isolare le arterie, tagliando tutti i tessuti connettivi con forbici di dissezione. Evitare di ferirsi le arterie.

4. arteriosa di montaggio

1. Trasferimento e immergere l'albero dell'arteria mesenterica nel freddo Ca^{2 +}-libera soluzione H-T (preparata al punto 2.4) fissando le arterie in eccesso con il forcipe.
2. Tagliare una porzione di 1.4 millimetri dell'arteria prossimale alla parete intestinale di un arcade mesenterica e utilizzare due pinze per aprire entrambi i lati di questo segmento dell'arteria con attenzione.
3. Preparare due segmenti di filo di acciaio inossidabile 2,5 cm di lunghezza e metterli nel piatto stesso.
4. Serrare delicatamente un'estremità dell'arteria usando il forcipe e inserire delicatamente due fili nel lumen dell'arteria uno ad uno con l'aiuto di un'altra pinza. Assicurarsi che i fili sono mantenuti dritti e non toccano l'endotelio.
5. Utilizzando due pinze, morsetto simultaneamente i due fili di acciaio di fuori della nave filettata e trasferire con cautela la nave da di Petri ad una camera di myograph precedentemente riempita con H-T soluzione (punto 2.3).
6. Avvitare le ganasce a pezzi per fare spazio per il montaggio. Entrambi i lati di uno dei due fili inseriti utilizzando due pinze di serraggio e porre il recipiente nello spacco della mascella (Figura 1A).
7. Eseguire il wrapping di entrambi i lati del filo bloccato intorno viti della mascella collegato al micrometro (Figura 1B).
8. Fissare la vite a sinistra ruotando in senso orario. Raddrizzare il filo utilizzando la pinza destra, quindi fissare la vite destra ruotando in senso orario (Figura 1). Assicurarsi che il recipiente sia sempre all'interno dell'intercapedine della mascella, ma non toccare la mascella per evitare danni.
9. Chiudere le due ganasce utilizzando il micrometro (Figura 1). Assicurarsi che le due mascelle sono abbastanza vicina ma che non entrino in contatto tra loro e che il filo non fissato sia nella parte superiore il filo fisso.
10. Con attenzione utilizzando la pinza destra, piegare il filo svitato all'angolo della mascella collegata per trasduttore di forza e avvolgerlo in senso orario intorno alla vite di destra (Figura 1E). Quindi, fissare la vite. Ripetere questo passaggio sul lato sinistro del filo e fissare la vite sul lato sinistro (Figura 1F).
11. Spostare le ganasce leggermente divaricate ruotando attentamente il micrometro (Figura 1). Evitare l'allungamento della nave. Utilizzare pinze per spostare il filo sul lato di micrometro sul piano orizzontale del filo sul lato trasduttore. Ruotare delicatamente il micrometro affinché il divario tra le due ganasce può ospitare solo due fili.
12. Ripetere i passaggi da 4.2 – 4,11 per montare le arterie in altre sezioni. Collegare tutti gli alloggiamenti per le attrezzature, coprire gli alloggiamenti, allegare il rifornimento di ossigeno al 100% e una sonda di temperatura e iniziare il riscaldamento a 37 ° C. Aprire il software di creazione di grafici e premere il pulsante Start sulla finestra di Visualizzazione grafico per avviare la registrazione.
13. Equilibrare per circa 20 min.

5. normalizzazione

Nota: Al fine di standardizzare le condizioni sperimentali e per ottenere affidabile reattività fisiologica dei vasi, una procedura di normalizzazione è necessario¹⁵. Secondo il rapporto tra la forza attiva e la circonferenza interna della nave, il sistema di myograph di filo ha un programma di normalizzazione standard per valutare la circonferenza interna (IC) del serbatoio montato^{5,8, 9}. Brevemente, per calcolare IC (µm), leggere il micrometro e il valore di input come il valore di X e il trasduttore uscita forza, cioè, che riposa tensione parietale (mN/mm), come il valore di Y. Il programma tornerà una curva di (X, Y) e calcolare l'IC corrispondente ad una pressione transmurale di 100 mmHg (IC₁₀₀). La nave è impostata alla circonferenza interna normalizzata (IC₁) quando è massima la capacità di risposta attiva.

1. Impostare le forze a zero per tutti i canali sul dispositivo ed equilibrare per un altro 1-2 min.
2. Selezionare impostazioni di normalizzazione dal "menu di DMTe impostare i parametri come segue:
   Calibrazione dell'oculare (mm/div): 0,36; Pressione (kPa) di destinazione: 13,3; IC₁/IC₁₀₀: 0,9; Online con una media di tempo (secondi): 2; Tempo (secondi) di ritardo: 60. Fare clic sul pulsante OK per chiudere la finestra Delle impostazioni di normalizzazione di DMT .
3. Selezionare il canale di interesse dal menu di DMT per aprire una finestra di normalizzazione di DMT per il canale corrispondente. Immettere i valori costanti nella finestra come segue: tessuto punti finali a1: 0,1; Tessuto i punti finali a2: 4; Diametro del filo (µm): 40. La finestra Visualizza la lunghezza della nave calcolato come 1,40 mm.
4. Leggere il micrometro di camera del tessuto appropriato. Immettere il valore nella casella lettura micrometro e fare clic sul pulsante Aggiungi punto . Questo valore è il valore iniziale di X (X0). Dopo un tempo di ritardo 60 s, la finestra Visualizza la forza e la pressione effettiva (ERTP) corrispondente a questo valore di micrometro. Contemporaneamente, la casella di micrometro lettura diventa attiva.
5. Allungare la nave vengano normalizzata ruotando il micrometro in senso antiorario. Immettere il valore di micrometro nella casella lettura micrometro e fare clic sul pulsante Aggiungi punto . Attendere un tempo di ritardo di 60 s nuovamente.
6. Ripetere il passaggio 5.5, continuare ad allungare la nave e aggiungere micrometro valori fino a quando la finestra viene visualizzato il valore di "micrometro X₁", che è l'impostazione di micrometro calcolato necessario allungare la nave al suo IC₁.
7. Impostare il micrometro a X il valore₁ .
   Nota: La tensione normalizzata è in genere 1-2 mN.

6. arteria contrazione registrazione

Nota: Tutte le soluzioni, tra cui H-T e soluzione High-K⁺ utilizzati in questa sezione, sono state preparate al punto 2.1.

1. Dopo la normalizzazione, equilibrare la nave nella camera per 15-20 min.
   Nota: Questi è alcuna necessità di modificare la soluzione in questo passaggio.
2. Sfida la nave con soluzione High-K⁺ due volte.
   1. Per sfidare la nave, sostituire soluzione H-T con 5 mL di soluzione di High-K⁺ per indurre la contrazione per 10 min, seguita da lavaggio con 5 mL di soluzione di H-T 3 - 4 volte.
      Nota: La tipica contrazione ha una forza massima sopra 3 mN e una forza costante e sostenuta circa 2,5 mN¹². Se la prima sfida genera una forza massima sotto 2,5 mN o la forza sostenuta diminuisce con il tempo o la seconda sfida genera una forza molto inferiore rispetto alla dose di prima volta, la nave viene scartata e non essere utilizzata per ulteriori indagini.
3. Sfida la nave con 5 mL di soluzione di High-K⁺ per indurre la contrazione. Dopo 5 min, aggiungere 0,5 µ l della soluzione di riserva (10 mM in DMSO) neoliensinine¹⁴ nella camera per rilassarsi l'imbarcazione ad una concentrazione finale di 1 µM neoliensinine.
4. Quando la forza è stabile (solitamente ciò richiede alcuni minuti), aggiungere un altro 0,5 µ l di soluzione di riserva di neoliensinine nella camera per aumentare la concentrazione di 2 µM. aggiungere 1 µ l di soluzione di riserva ogni volta per aumentare la concentrazione di 4, 6, 8 e 10 µM per generare t curva dose-risposta di lui.
   Nota: Il magazzino e le concentrazioni di lavoro variano tra farmaci.

Risultati

Abbiamo misurato la contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica del mouse usando un sistema multi-filo myograph ed abbiamo valutato l'effetto rilassante di neoliensinine purificato dagli embrioni dei semi di loto (Nelumbo nucifera Gaertn.) ¹⁴. l'arteria mesenterica resistenza del mouse era isolato, pulita dei tessuti connettivi e tagliato in segmenti di 1,4 mm. Il segmento dell'arteria è stato inserito da due fili di acciaio in Ca^{2 +}-lib...

Discussione

L'ipertensione è una sfida di sanità pubblica diffusa grazie alle sue complicazioni severe, tra cui cardiovascolari e renali malattie¹⁶. Comprensione della patogenesi dell'ipertensione ed esplorare più farmaci anti-ipertensivi è diventato un compito urgente in questo campo. La pressione sanguigna è generata e mantenuta dalla resistenza periferica della circolazione. Secondo legge di Poiseuille, relativamente piccole arterie generano una grande percentuale di resistenza circolatoria e servono ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi wire myograph system	DMT	610-M
Stainless steel wire	DMT	400447
Geuder dissection scissor	DMT	400431
Dumont forceps	DMT	300413
PowerLab/8SP	ADInstruments	ML785
Software	ADInstruments	LabChart 5
NaCl	SigmaAldrich	S5886
KCl	SigmaAldrich	P5405
CaCl2	SigmaAldrich	C4901
MgCl2·6H2O	SigmaAldrich	M2393
D-Glucose	SigmaAldrich	G6152
HEPES	Sangon Biotech	A100511-0250
NaOH	SigmaAldrich	S8045
DMSO	SigmaAldrich	D2650