Myography 와이어를 사용 하 여 마우스 Mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정

요약

선법 myograph 혈관 부드러운 근육 기능과 화면 새로운 약물을 조사 하는 데 사용 됩니다. 우리 보고 마우스 mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정 및 혈관 평활 근의 새로운 relaxants 심사에 대 한 자세한 프로토콜.

초록

와이어 myograph 기술은 depolarization 응답, GPCR 촉진제/저 해제 및 약. 에 혈관 부드러운 근육의 수축 평가 하는 데 사용 됩니다. 그것은 혈관 부드러운 근육의 생리 기능, 고혈압 등 혈관 질환의 병 인 및 부드러운 근육 이완 약물의 개발에 많은 연구에서 널리 이용 된다. 마우스는 널리 사용 되는 모델 동물 질병 모델, 유전자 변형된 종자의 큰 수영장. 자세히 마우스 mesenteric 동맥의 수축 isometric을 측정 하기 위해이 방법을 도입 했습니다. 마우스 mesenteric 저항 동맥의 1.4 m m 세그먼트 격리 되었고 그것의 루멘을 통해 두 개의 강철 와이어를 전달 하 여 myograph 챔버에 장착. 평형 및 정규화 단계 후 선박 세그먼트 수축 분석 결과 이전에 두 번 하이-K⁺ 솔루션으로 potentiated 이었다. 신약 개발에서이 방법의 응용 프로그램의 예를 들어, 마우스 mesenteric에 새로운 자연 물질, neoliensinine, 중국 약초, 연꽃 씨 (Nelumbo nucifera Gaertn.)의 배아에서에서 분리의 이완 효과 측정 동맥입니다. Myograph 챔버에 장착 된 선박 세그먼트 높은-K⁺ 솔루션으로 자극 했다. 힘 긴장에 안정적인 지속적인된 단계에 도달 하면 neoliensinine의 누적 복용량 챔버에 추가 되었습니다. 우리는 neoliensinine 했다 복용량 의존 이완 효과 부드러운 근육 수축에 따라서 고혈압에 대 한 잠재적인 활동 곰 제안 발견. 또한, 선박 세그먼트 장착 후 적어도 4 시간을 살아남을 수 있고 여러 번, 우리는 제안에 대 한 높은-K⁺ 솔루션에 의해 유도 된 수축 유지 와이어 myograph 시스템 마약 검사의 시간이 걸리는 과정에 사용할 수 있습니다.

서문

여기에 사용 된 작은 그릇 myograph 시스템 되었고 측정에 대 한 내부 직경 100에서 400 µ m. 고립 된 작은 배 (약 2 m m 긴)에 이르기까지 작은 저항 혈관의 수축 isometric 두 40 µ m 직경 철사에 의해 삽입 된 그 마이크로미터 측면과 변환기 쪽 턱에 순차적으로 탑재. 이 myograph 기술은 1972¹ 에서 처음 제안 되었고 Mulvany와 그의 동료^2,3,4,,56에 의해 주로 개발. 그것은 지금 안정 장비, 쉬운 성능 및 표준 정규화 절차^7,,89성숙한 기술. 우리 마우스 mesenteric 동맥에서 측정에 대 한 몇 가지 수정이 방법을 활용.

혈관 평활 근 거의 모든 혈관의 벽을 라인. 그들의 기본적인 함수는 다양 한 자극에 대 한 응답에서 수 축을 통해 힘을 생성 하는. 혈관 부드러운 근육의 정상적인 수축 혈액 압력 조절에 필수적 이며 영양 보충¹⁰. 다양 한 질병, 고혈압, 심장 마비와 뇌. 을 포함 하 여 혈압의 비정상적인 규제 여러 연구 결과 비정상적인 혈압은 항상 역 기능 혈관 평활 근 수축^7,11,,1213와 관련 된 제안 했다. Myograph 메서드는 vasoconstrictors, 저 해제 및 약물을 포함 하 여 다양 한 자극에 의해 유도 된 마우스 선박의 isometric 수축의 조사 수 있습니다. 수축의 성공적인 측정 혈압 유지 보수와 새로운 치료 접근을 탐구 하 고 혈관 부드러운 근육 관련 질환의 pathogenesis의 메커니즘을 이해 하는 데 도움이 됩니다.

많은 중국 약초; 혈관 질환의 임상 치료에 널리 사용 된 그러나, 그들의 성분에 일반적으로 알 수 없는 남아 있습니다. 따라서, 절연 및 효과적인 구성 요소 식별 새로운 약물의 개발에 대 한 매우 중요 하다. 멀티 와이어 myograph 기술 심사 허브에 활성 구성 요소에 대 한 간단한 접근을 제공 합니다. 우리 마우스 mesenteric 동맥 수축 조사를 작은 그릇 myograph 시스템을 사용 하 여 여러 연구 결과 보고 하 고 반대로 고혈압 활동^12,,1314자연 화합물 발견. 여기, 우리는 자세한 설명 로터스 씨 (Nelumbo nucifera Gaertn.)의 배아에서 분리 된 neoliensinine의 이완 효과 평가 하 고 myograph 메서드에 대 한 프로토콜 ¹⁴.

프로토콜

동물 조작 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 모델 동물 연구 센터 남 경 대학에 의해 승인 되었다.

1. 솔루션 준비

1. HEPES Tyrode 솔루션 (H-T) 137.0 m NaCl, 2.7 m KCl m m, 1.8 m m CaCl₂, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5.6 m m D-포도 당, 및 10 mM HEPES를 사용 하 여 준비 pH 7.3-7.4.
2. 칼슘 없이 HEPES Tyrode 솔루션 준비 (캘리포니아^{2 +}-H T 무료) 140.6 m NaCl m, 2.7 m KCl m, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5.6 m m D-포도 당, 및 10 mM HEPES, pH 7.3-7.4를 사용 하 여.
3. HEPES Tyrode 솔루션 124 mM 15.7 m m NaCl, 124.0 m m KCl, 1.8 m m CaCl₂, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, D-포도 당, 그리고 10 mM HEPES, pH를 5.6 m m를 사용 하 여 KCl (높은 K⁺)를 사용 하 여 준비 7.3-7.4.

2. 실험 준비

1. H-T와 37 ° C 물 목욕을 사용 하 여 높은-K⁺ 솔루션 예 열.
2. Myograph 시스템, 데이터 수집 하드웨어와 컴퓨터를 켭니다.
3. 신중 하 게 모든 myograph 챔버 채울 H T 솔루션의 5 mL.
4. 4 ° C H-T와 캘리포니아의^{2 +}20 mL 두 접시를 채워-H T 솔루션, 각각, 얼음 저장 고.
5. H-T 솔루션의 20 mL와 코팅된 10 cm 배양 접시를 실내 온도에 그것을 유지.

3. 마우스 Mesenteric 동맥 해 부

1. 자 궁 경부 전위에 의해 8 12 주 된 C57BL/6J 여성 또는 남성 마우스를 안락사. 향하도록 하는 복 부와 함께 마우스를 고정.
2. 70% 에탄올과 복 부 축 그리고는 사 타 구니에서 피부 복 부 정중 선 따라가 위로 잘라 첫 번째 절 개의 시작에서 아래쪽으로 양쪽에 다리를 절 개 하 게 합니다. 양쪽;에 다시 피부를 당겨 복 여 비슷한 절 개를 확인 합니다.
3. 가 위를 사용 하 여 잘라는 식도, 대 장 및 시체에서 맥 관 구조와 위장을 완전히 다른 결합 조직.
4. 집게와 피를 씻어 감기 H T 단계 2.4에서에서 준비 하 고 부드럽게 조직의 여러 번 H T 솔루션에서 린스를 포함 하는 접시에 격리 된 세그먼트를 이동 합니다.
5. 2.5 단계에서 준비 코팅된 페 트리 접시에 격리 된 세그먼트를 전송 하 고 실 온에서 mesenteric 동맥 해 부를 수행 합니다.
6. 위, 공장, 회장, caecum 시계 방향에서 밖으로 부드럽게 하 고 각각 위장과 caecum 왼쪽과 오른쪽 측면에 고정.
7. Mesenteric 맥 관 구조 침대 스트레칭 및 해 부 mesenteric 동맥을 노출 하는 핀 소장을 수정.
   참고:이 조건 하에서 동맥 혈관 위에 있습니다.
8. 해 부 현미경 동맥 및 전송 입체 현미경의 광원을 켭니다. 솔루션에는 전체 조직 몰입은 다는 것을 확인 하십시오.
9. 집게와 동맥 주위 지방 조직 클램프 그리고 해 부가 위 잘라 모든 결합 조직에 의해 동맥을 분리. 동맥을 부상 하지 마십시오.

4. 동맥 장착

1. 전송 및 mesenteric 동맥 나무에는 감기 캘리포니아^{2 +}담가-무료 H T 솔루션 (단계 2.4에서에서 준비) 집게와 초과 동맥을 죄 여.
2. 동맥의 1.4 m m 부분에서 mesenteric 아케이드의 창 자 벽에 인접 잘라내어 두 개의 집게를 사용 하 여이 동맥 세그먼트의 양쪽 모두를 신중 하 게 열.
3. 스테인레스 스틸 와이어 길이, 2.5 c m의 두 세그먼트를 준비 하 고 같은 그릇에 넣어.
4. 부드럽게 클램프, 집게를 사용 하 여 동맥의 한쪽 끝을 신중 하 게 다른 집게의 도움으로 하나 하나 동맥의 루멘으로 2 개의 철사를 삽입 합니다. 전선을 똑바로 유지 됩니다 endothelium 만지지 마십시오 확인 하십시오.
5. 두 개의 집게를 사용 하 여 스레드 선박 외부 두 개의 강철 와이어 클램프를 동시에, 그리고 신중 하 게 H T 솔루션 (2.3 단계)으로 가득 이전 myograph 약 실에 페 트리 접시에서 선박을 전송.
6. 설치를 위한 공간을 만들기 위해 떨어져 턱을 나사. 두 개의 집게를 사용 하 여 두 개의 삽입된 와이어 중의 양쪽 모두를 클램프과 턱 간격 (그림 1A)에 배를 놓습니다.
7. 나사 마이크로미터 (그림 1B)에 연결 된 턱의 주위 클램프 와이어의 양쪽을 감싸 줍니다.
8. 시계 방향으로 왜곡 하 여 왼쪽 나사를 해결. 오른쪽 집게를 사용 하 여 와이어를 곧게 다음 시계 방향으로 (그림 1C)을 왜곡 하 여 오른쪽 나사를 해결 합니다. 배는 항상 턱 간격 안에 다는 것을 확인 하지만 손상을 피하기 위해 턱을 만지지 마십시오.
9. 마이크로미터 (그림 1D)를 사용 하 여 두 개의 문 턱을 닫습니다. 두 턱은 충분히 가까이 하지만 그들은 서로 고정된 와이어 고정된 와이어 상단은 만지지 마십시오 있는지 확인 하십시오.
10. 오른쪽 집게를 사용 하 여 신중 하 게 변환기, 강제로 연결 하는 턱의 모서리에 풀 었된 와이어를 접어 하 고 시계 방향으로 오른쪽 나사 (그림 1E) 주위 포장. 그런 다음 나사를 수정 합니다. 와이어의 왼쪽된 측면에서이 단계를 반복 하 고 왼쪽 나사 (그림 1 층)을 수정.
11. 마이크로미터 (그림 1G)을 신중 하 게 회전 하 여 약간 떨어져 턱을 이동 합니다. 선박을 스트레칭 하지 마십시오. 집게를 사용 하 여 변환기에서 와이어의 수평 평면에 와이어 마이크로미터 측에 이동. 두 턱 사이의 간격 단지 2 개의 철사를 수용할 수 있도록 신중 하 게는 마이크로미터를 회전 합니다.
12. 4.2-4.11 동맥 다른 챔버에 탑재 단계 반복 합니다. 장비에 모든 챔버를 연결, 챔버 커버, 100% 산소 공급 및 온도 프로브 연결 고 37 ° c에 난방 시작 차트 소프트웨어 열고 녹음을 시작 차트 뷰 창에서 시작 버튼을 누릅니다.
13. 약 20 분 동안 equilibrate.

5입니다. 정규화

참고: 실험 조건을 표준화 하 고 혈관의 믿을 수 있는 생리 적인 응답을 얻을, 정규화 절차는 필요한¹⁵입니다. 활성 힘 및 선박의 내부 둘레 사이의 관계에 따라 와이어 myograph 시스템에 탑재 된 선박^{5,8, 내부 둘레 (IC)를 평가 하는 표준 정규화 프로그램 9}. 짧게,를 계산 하는 IC (µ m), 읽고는 마이크로 미터 X 값 변환기로 값을 입력 힘, 즉, 휴식 하는 벽 긴장 (mN/m m), Y 값으로 출력 합니다. 프로그램 (X, Y)의 맞춤된 곡선을 반환 하 고 100 mmHg (IC₁₀₀)의 과거 압력에 해당 하는 IC를 계산. 선박 정규화 된 내부 둘레 (IC₁)로 설정 되어 때 활성 응답은 최대한.

1. 장치에서 모든 채널에 대 한 0 힘을 설정 하 고 다른 1-2 분에 대 한 equilibrate.
2. 정규화 설정 에서 선택 하는 "DMT 메뉴, 그리고 다음과 같이 매개 변수 설정:
   접 안 렌즈 교정 (mm/div): 0.36; 압력 (kPa) 대상: 13.3; IC₁/IC₁₀₀: 0.9; 온라인 평균 시간 (초): 2; 지연 시간 (초): 60. DMT 정규화 설정 창을 닫고 확인 버튼을 클릭 합니다.
3. 해당 채널에 대 한 DMT 정규화 창을 열려면 DMT 메뉴 에서 관심의 채널을 선택 합니다. 창에 다음과 같은 상수 값을 입력: 조직 종점 a1: 0.1; 조직 종점 a2: 4; 와이어 직경 (µ m): 40. 창 1.40 m m로 계산 된 선박 길이 표시합니다.
4. 적절 한 조직 챔버의 마이크로미터를 읽기. 마이크로미터 읽기 상자에 값을 입력 하 고 지점 추가 단추를 클릭 합니다. 이 값은 (X0) X의 초기 값이입니다. 60 s 지연 시간 후 창 힘 및이 마이크로 미터 값에 해당 하는 효과적인 압력 (ERTP)를 표시 합니다. 동시에, 마이크로 미터 독서 상자 활성화 됩니다.
5. 스트레치는 마이크로미터 반시계 방향으로 선회 하 여 정규화 되 고 선박. 마이크로미터 읽는 상자에 마이크로 미터 값을 입력 하 고 지점 추가 단추를 클릭 합니다. 60의 지연 시간을 기다린 s 다시.
6. 반복 단계 5.5, 선박, 스트레칭 "마이크로 미터 X₁", 해당 IC₁그릇을 스트레칭 하는 데 필요한 계산 된 마이크로미터 설정의 값을 표시 하는 창까지 마이크로 미터 값을 추가 하는 계속 해 서.
7. 마이크로 미터 x₁ 값을 설정 합니다.
   참고: 정규화 된 긴장은 일반적으로 1-2만.

6. 동맥 수축 녹음

참고: H-T와이 섹션에서 사용 되는 하이-K⁺ 솔루션을 포함 한 모든 솔루션 단계 2.1에서에서 준비 되었다.

1. 정규화 후 15-20 분 동안 상공에 있는 배를 equilibrate.
   참고:이이 단계에서 솔루션을 변경할 필요가 없습니다.
2. 높은-K⁺ 솔루션으로 배를 두 번 도전 한다.
   1. 선박에 도전, H-T 솔루션을 H T 솔루션의 5 mL로 3-4 회 세척 뒤 10 분 동안 수축 유도 하 고 K⁺ 솔루션의 5 mL 바꿉니다.
      참고: 일반적인 수축 3 미네소타와 2.5 mN¹²주위 일정 지속적인된 힘 극대 힘이 있다. 2.5 mN 아래 최대한 힘을 생성 하는 첫 번째 도전 또는 지속적인된 힘 감소 시간 또는 처음 복용량 보다는 더 낮은 힘을 생성 하는 두 번째 도전, 선박 삭제 되 고 추가 조사를 위해 사용 되지 않습니다.
3. 수 축을 유도 하 고 K⁺ 솔루션의 5 mL와 선박을 도전 한다. 5 분 후 1 µ M neoliensinine의 최종 농도에 선 긴장을 챔버로 neoliensinine 재고 솔루션 (DMSO에 10 m m)¹⁴ 의 0.5 µ L를 추가 합니다.
4. 힘은 안정 (이 일반적으로 몇 분 걸립니다), 4, 6, 8 및 10 µ M t를 생성 하 게 농도 증가 하는 농도를 2 µ M. 추가 1 µ L 재고 솔루션의 각 시간 증가를 챔버로 neoliensinine 재고 솔루션의 또 다른 0.5 µ L를 추가 그는 복용량 응답 곡선.
   참고: 재고와 작업 농도 약 마다 다릅니다.

결과

우리는 멀티 와이어 myograph 시스템을 사용 하 여 마우스 mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정 하 고 로터스 씨 (Nelumbo nucifera Gaertn.)의 배아에서 정화 neoliensinine의 이완 효과 평가 ¹⁴. 마우스 mesenteric 저항 동맥은 고립 된 결합 조직의 청소 하 고 1.4 m m 세그먼트를 잘라. 동맥 세그먼트에 캘리포니아^{2 +}2 개의 강철 철사에 의해 삽입 된-무료 페 트리 ...

토론

고혈압은 심혈 관 질환 등 심각한 합병증 및 신장 질환¹⁶광범위 한 보건 도전 이다. 고혈압의 병 인을 이해 하 고 탐구 더 고혈압 약물이이 분야에서 긴급 작업 되고있다. 혈압은 생성 하 고 순환의 주변 저항에 의해 유지. Poiseuille의 법률, 상대적으로 작은 동맥 순환 저항의 큰 비율을 생성 하 고 혈압^3,10의 지배적인 생산자로 봉사. 따라...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi wire myograph system	DMT	610-M
Stainless steel wire	DMT	400447
Geuder dissection scissor	DMT	400431
Dumont forceps	DMT	300413
PowerLab/8SP	ADInstruments	ML785
Software	ADInstruments	LabChart 5
NaCl	SigmaAldrich	S5886
KCl	SigmaAldrich	P5405
CaCl2	SigmaAldrich	C4901
MgCl2·6H2O	SigmaAldrich	M2393
D-Glucose	SigmaAldrich	G6152
HEPES	Sangon Biotech	A100511-0250
NaOH	SigmaAldrich	S8045
DMSO	SigmaAldrich	D2650