التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية

Summary

نقدم هنا، البروتوكولات لتحديد إيمونومودولاتورس 1) الفيروسات المشفرة التي تروج للنسخ المتماثل المفصليات وعوامل المضيف 2) حقيقية النواة التي تقيد المفصليات النسخ المتماثل. تسمح هذه الأساليب المستندة إلى الأسفار والتلألؤ الباحثين سرعة الحصول على قراءات الكمية من النسخ المتماثل المفصليات في فحوصات التبسيط مع انخفاض نسب الإشارات إلى الضجيج.

Abstract

قد استخدمت على نطاق واسع تحديد العوامل الخلية المضيفة التي تقيد النسخ المتماثل الفيروس تدخل الجيش الملكي النيبالي-والجينوم التحرير على أساس فحص الأنظمة الأساسية. ومع ذلك، وهذه الشاشات تجري عادة في الخلايا التي بطبيعة الحال المتساهلة لمسببات المرض الفيروسي قيد الدراسة. ولذلك، النسخ المتماثل قوية من الفيروسات في ظروف السيطرة قد تحد من النطاق الديناميكي لهذه الشاشات. وعلاوة على ذلك، قد تكون هذه الشاشات غير قادر على التعرف بسهولة على مسارات الدفاع الخلوية التي تقيد فيروس النسخ المتماثل إذا كان الفيروس تكييف جيد للبلد المضيف وقادرة على التصدي للدفاعات المضادة للفيروسات. في هذه المقالة، يصف لنا نموذجا جديداً لاستكشاف التفاعلات الفيروس--المضيف عن طريق استخدام شاشات مركز على العدوى وبطبيعة الحال فاشلة قبل سيتناقش مثل فيروس التهاب الفم الحويصلي (منظمة). وعلى الرغم من قدرة منظمة للنسخ المتماثل في طائفة واسعة من الحشرات ديبتيران والمضيفين الثدييات، يخضع منظمة عدوى بعد الدخول، وفاشلة في مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا المستمدة من الحشرات ليبيدوبتيران، مثل العثة الغجرية (Lymantria dispar). ومع ذلك، هذه الالتهابات منظمة فاشلة يمكن أن تكون "إنقاذ" عندما يتم اختراق الدفاعات المضادة للفيروسات الخلايا المضيفة. يصف لنا كيف سلالات منظمة ترميز الجينات مراسل مريحة والتقييدية ديسبار ل. يمكن إقران خطوط الخلايا إلى شاشات الإعداد لتحديد المضيف العوامل الداخلة في تقييد المفصليات. وعلاوة على ذلك، نعرض أيضا أداة أدوات الفحص هذه في تحديد العوامل فيروسي المرمزة أن إنقاذ منظمة النسخ المتماثل أثناء كوينفيكشن أو من خلال التعبير حمل خارج الرحم، بما في ذلك ترميز بفيروسات الثدييات. تقييد النسخ المتماثل منظمة في الخلايا ديسبار لام الطبيعية توفر نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية عند الكشف عن الظروف التي من شأنها أن تعزز منظمة الإنقاذ، مما يتيح استخدام التبسيط التﻷلؤ fluorescence القائم وفحوصات لمراقبة التغييرات في منظمة النسخ المتماثل. هذه المنهجيات قيمة لفهم التفاعل بين المضيف الردود المضادة للفيروسات والعوامل الفيروسية التهرب من الحصانة.

Introduction

قدرة الفيروس على تكرار منتجة في مضيف معين في جزء تحكمها توافر العوامل الخلية المضيفة التي تدعم دخول الفيروسية والنسخ المتماثل¹. يمكن أن تمليها مجموعة المضيف الفيروس أيضا قدرة الفيروس للدفاعات المضادة للفيروسات الخلوية العداد بخلاف ذلك من شأنه أن يعرقل النسخ المتماثل الفيروسية^2،3. وهو النتيجة لهذه التفاعلات المعقدة الفيروس--المضيف في نهاية المطاف أن تقرر ما إذا كان فيروس سوف تكون قادرة على إكمال دورة الحياة في مضيف معين. نظراً للعواقب المحتملة المسببة للأمراض للمضيف إذا تستتبعه هذه النسخ المتماثل الفيروسية، من الأهمية بمكان وضع استراتيجيات تجريبية لزيادة فهمنا للتفاعلات الرئيسية الفيروسات--المضيف التي يمكن ترجيح كفة الميزان بين فاشل والإنتاجية الالتهابات. توضيح الميزات الجزيئية للفيروس--المضيف التفاعل ستكون مفيدة في وضع الاستراتيجيات العلاجية المضادة للفيروسات الجديدة والبديلة.

مع ظهور الحمض النووي الريبي التدخل ([رني])^4،5 وأدوات تحرير الجينوم (مثلاً.، كريسبر-Cas9، والزنك إصبع نوكلياسيس، تالينس)⁷من^6،، فقد أصبح ممكناً تجريبيا لتغيير جداول التعبير عن العوامل الخلوية على نطاق الجينوم واستكشاف أثر هذه التعديلات على فيروس النسخ المتماثل. وفي الواقع، [رني] والجينوم-تحرير-تعتمد شاشات عديدة أجريت في أنواع الخلايا المضيفة اللافقاريات والفقاريات التي قد كشف النقاب عن جوانب جديدة للفيروس--المضيف التفاعلات^8،،من^{910، 11 , 12}. عادة ما تستخدم هذه الشاشات الفيروسات ترميز الصحفيين، مثل لوسيفراس اليراع (لوك) أو البروتينات الفلورية (مثلاً.، التجارة والنقل، دسريد)، التي توفر وسيلة مريحة كمياً تقييم التعبير الجيني الفيروسي كقراءات للنسخ المتماثل الفيروسية^9،12. هذه الاستراتيجية يسمح للباحثين تحديد العوامل المضيفة التي أما تعزز أو استعداء النسخ المتماثل الفيروسية كما يتضح من الزيادة أو النقصان، على التوالي، في الفيروسية مراسل إشارات^9،12. ومع ذلك، في الغالبية العظمى من الحالات، أجريت هذه الشاشات باستخدام الفيروسات التي يتم تكييفها جيدا لنوع الخلية المضيفة التي كانت تجري دراسة. في حين أن هذه الاستراتيجية يمكن أن تكون هامة لفهم العلاقات كوفولوتيوناري بين مسببات الأمراض الفيروسية ومضيفيهم الطبيعية، أنها تشكل شواغل أساسية بشأن استخدامها في الكشف عن العوامل المضادة للفيروسات المضيف. وفي هذه الحالات، إشارة تحسينا في مراسل الفيروس عند [رني] هو ينظر ضربة قاضية ل، أو المنظمة من عامل الهاتف الخلوي عادة ما يحول دون تكرار الفيروسية. أولاً، إذا كان فيروس بالفعل قادرة على تكرار قوة في الخلية المضيفة يجري بحثها بموجب شروط مراقبة، مجموعة ديناميكية من الشاشة (أي، القدرة على التمييز بين الخلفية وإشارات مراسل الفيروسية المعززة) قد تكون محدودة. ثانيا، هذه المسألة تتفاقم الأوضاع فيها الفيروس تكييف جيدا للخلية المضيفة وفعالة في التصدي لسبل الدفاع المضيف مستهدفون في الشاشة.

نظراً للشواغل المذكورة أعلاه فيما يتعلق بتفاعل الفيروسات التقليدية-المضيف فحص أساليب، قمنا بتطوير نموذج جديد لدراسة التفاعلات المضيف الفيروسات التي تستغل التهابات المفصليات فاشل بطبيعة الحال في خلايا الحشرات ليبيدوبتيران. هذه الاستراتيجية مستمدة من ملاحظة أن المفصليات البشرية مدروسة، منظمة، يخضع لعدوى فاشلة في الخلايا المشتقة من العثة الغجرية (L. dispar)¹³. منظمة وبطبيعة الحال المنقولة بواسطة الحشرات ديبتيران (أي، ذباب الرمل) للمضيفين الثدييات، وقد ثبت تجريبيا لتصيب مجموعة واسعة من اللافقاريات وخلية المضيفين الفقاريات على حد سواء في الثقافة و في فيفو¹⁴. 11-ك. بايت سلبي بمعنى واحد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي الجينوم من منظمة ترميز مرناس سوبجينوميك الخمسة التي تترجم كل إلى البروتينات التي تشكل virion المغلفة. ومع ذلك، أتاحت منظمة عكس النظم الوراثية إنشاء النسخ المتماثل المختصة سلالات ترميز لوك أو البروتينات الفلورية، بالإضافة إلى خمسة الطبيعية منظمة الجينات المنتجات^15،،من¹⁶¹⁷. لأن هذه البروتينات مراسل لا تدمج virion منظمة، أنها توفر قراءات مريحة للتعبير الجيني منظمة التي تحدث بعد الدخول. استخدام سلالات منظمة ترميز بروتينات فلورية خضراء أو لوك، لقد سبق بينا أن التعبير الجيني منظمة قيودا صارمة على دخول الخلايا LD652 وأن التتر منظمة لا تزيد مدة 72 ساعة بعد الإصابة (hpi). وفي المقابل، كوينفيكشن الخلايا LD652 مع بوكسفيروس الثدييات، فيروس اللقاحية (فاكف)، ومنظمة يؤدي إلى زيادات لوغاريتمي في التعبير الجيني منظمة والتتر من هذه النقطة الزمنية. فاكف يخضع التعبير الجيني المبكر وتكرار الحمض النووي، والتعبير الجيني المتأخر في LD652 الخلية الالتهابات، ولكن دورة النسخ المتماثل فاكف فاشلة في نهاية المطاف بسبب virion غير مكتملة morphogenesis¹⁸. جينوم الحمض النووي ~ 192 كيلو بايت كبيرة فاكف ترميز البروتينات > 200، كثير منها عرض خصائص إيمونومودولاتوري التي تروج للنسخ المتماثل الفيروسية عن طريق قمع المضيف الاستجابات المناعية¹⁹. ولذلك، افترضنا أن المرجح إيمونومودولاتورس فاكف التي تحول دون ردود ديسبار L. عادة تقييد النسخ المتماثل لمنظمة وساطة "الإنقاذ" للنسخ المتماثل لمنظمة في خلايا LD652 التي كوينفيكشن فاكف. ودعما لذلك، تنقذ معاملة الخلايا LD652 مع المانع الثاني بوليميريز الحمض النووي الريبي المضيف والاكيتنوميسين د أيضا منظمة النسخ المتماثل في الخلايا LD652، مما يشير إلى أن الاستجابات المضيف النسخ المعتمدة على كتلة منظمة النسخ المتماثل بعد الدخول¹³.

الملاحظات المذكورة أعلاه تشير إلى أن الطابع التقييدي الطبيعي للخلايا LD652 للإصابة بمنظمة قد توفر خلفية منخفضة نسبيا عند الكشف عن الظروف التي من شأنها أن تعزز إشارات مرمزة بمنظمة مراسل (أي، تلك التي تمنع المضيف الدفاعات المضادة للفيروسات). هنا، نحن نقدم الطرق لاستخدام الفلورية أو فحوصات لوك المستندة إلى الشاشة لظروف تخفيف قيود منظمة في الخلايا ليبيدوبتيران. أولاً، نحن إظهار كيف يمكن استخدام هذه الاختبارات لتحديد العوامل immunomodulatory فيروسي المرمزة التي كسر قيود منظمة أثناء أما تجارب كوينفيكتيون أو من خلال التعبير حمل خارج الرحم العوامل الفيروسية المرشح. على سبيل مثال، نحن لتوضيح كيف استخدمنا هذه تقنيات الفحص لتحديد ترميز poxvirus البروتينات A51R كأسرة جديدة من العوامل إيمونومودولاتوري التي إنقاذ منظمة النسخ المتماثل في الغياب عوامل poxvirus الأخرى¹³. ثانيا، نحن لتوضيح كيف يمكن استخدام [رني] الفحص في التهابات خلية منظمة LD652 تقييداً لتحديد المضيف التوكسينات العوامل الداخلة في المفصليات تقييد¹³مباشرة.

Protocol

1-العام Lymantria dispar (LD652) خلية والثقافة الفيروس

1. خلية LD652 استزراع وتصفيح
   1. لثقافة ديسبار لام-المشتقة من الخلايا LD652، الحفاظ على أحادي الطبقة خلايا في نمو متوسطة (جدول المواد) المحتضنة في 27 درجة مئوية تحت الغلاف الجوي العادي. الحفاظ على الخلايا في أطباق الأنسجة-الثقافة-تعامل 10 سم وممر الخلايا عند الوصول إلى كونفلوينسي 80%.
   2. للوحة، وإزاحة الخلايا LD652 ملتصقة من اللوحة التي بيبيتينج وسائل الإعلام مرارا وتكرارا على أحادي الطبقة (لا تتطلب هذه الخلايا تريبسينيزيشن إلى إزاحة)، وتمييع العينة في وسائط النمو كثافة تقريبية 1 × 10⁵ خلايا/مل. "الماصة؛" 1 مل من الثقافة/بئر المخفف من صفيحة 24-جيدا. البذور على الأقل نوع الآبار ثلاث نسخ متماثل في المعاملة لكل نقطة الوقت (بحد أقصى ثمانية معالجات/اللوحة).
   3. السماح للخلايا بتسوية للحد ني ح 1.
2. إعداد فيروس اللقاحية
   1. لإعداد المخزون فاكف، وتضخيم الفيروس في الحلة خلايا²⁰ أو كلية "القرد الأخضر الأفريقي" الخلايا (الخلايا 1 بكالوريوس العلوم أو بكالوريوس العلوم-40)^20،،من²¹²².
      ملاحظة: فاكف سلالة Western Reserve (فاكف-WR) يعمل جيدا في الاختبارات الموصوفة هنا.
   2. تيتراتي سلالة فاكف عن طريق البلاك المقايسة 1 بكالوريوس العلوم أو بكالوريوس العلوم-40 خلايا^20،22.
      ملاحظة: جميع أشارت إلى تعدد فاكف للعدوى (وزارة الداخلية) الموصوفة هنا عن LD652 التهابات خلية تستند التتر التي تم الحصول عليها من فحوصات البلاك BSC-40.
3. إعداد فيروس التهاب الفم الحويصلي
   1. إعداد مخزون منظمة، تضخيم الفيروس في الخلايا BHK²³.
   2. تيتراتي منظمة بمقايسة البلاك على بكالوريوس العلوم-40 أو BHK خلية مونولاييرس^13،23.
      ملاحظة: كل "منظمة أشهر" الموصوفة هنا عن LD652 التهابات خلية تستند التتر التي تم الحصول عليها من فحوصات البلاك BSC-40.

2. المستندة إلى الأسفار منظمة الإنقاذ المقايسة تستخدم الإصابة المشتركة وتصوير خلية يعيش

1. البذر والعدوى من الخلايا LD652
   1. لوحة 40,000 LD652 الخلايا/البئر دائرة 8-جيدا.
   2. لتصوير خلية يعيش المستندة إلى الأسفار، استخدام سلالات منظمة ترميز البروتينات الفلورية. استخدام التجارب التي عرضت هنا منظمة-دسريد¹⁷، سلالة منظمة المؤتلف الذي يعبر عن البروتين دسريد الحرة التي هي لا تنصهر فيها أي بروتين منظمة أخرى.
      ملاحظة: منظمة العدوى من الخلايا LD652 لا سيتوباثيك من 96 hpi، وثم موت الخلية ليس عاملاً من عوامل التباس عند تقييم النسخ المتماثل منظمة داخل هذا الإطار الزمني.
   3. تعد منظمة دسريد وفاكف-فلوريدا-التجارة والنقل في وسائل الإعلام الحرة المصل (الإدارة المستدامة للغابات؛ جدول المواد) وزارة الداخلية في 1 و 25، على التوالي.
      ملاحظة: فاكف-فلوريدا-التجارة والنقل هو سلالة فاكف المؤتلف الذي يعبر عن التحام بين لوك وبروتينات فلورية خضراء²⁴. استخدام موي من 25 أو أكبر لسلالات فاكف يضمن أن جميع LD652 الخلايا المصابة¹³. إذا كان استخدام فيروس كوينفيكتينج مختلفة، ووزارة الداخلية سيكون يحددها المستخدم تجريبيا. يجب أن تقام في الآبار مكررة كل علاج العدوى وتشمل العلاجات موك المصابة التي يتم إضافة فقط الإدارة المستدامة للغابات إلى الخلايا.
   4. احتضان الخلايا في 0.2 مل العدوى ح 2 في 27 درجة مئوية.
   5. تغسل الخلايا مع 0.5 مل/جيدا من وسائط النمو.
   6. احتضان الخلايا في 25 ميكرومترات خلية صلاحية صبغ (جدول المواد) في وسائط النمو لمدة 45 دقيقة في 27 درجة مئوية.
   7. نضح وسائط الإعلام وغسل الآبار 1 x مع 0.5 مل/جيدا لإزالة الصبغة الزائدة.
   8. الحفاظ على الخلايا في 0.3 مل/جيدا من وسائط النمو.
2. يعيش خلية التقاط الصور
   1. تشغيل مجهر [كنفوكل] 30 دقيقة في وقت مبكر وتحميل طبق دائرة 8-جيدا.
      ملاحظة: يمكن تصويرها الخلايا LD652 في درجة حرارة الغرفة تتراوح ما بين 20-25 درجة مئوية، ولكن للظروف المثلى، ينبغي تعديل درجة حرارة الغرفة إلى 27 درجة مئوية.
   2. إعداد الإعدادات المناسبة الإثارة/الانبعاثات لكل البروتين علامة مضيئة لتصويرها، فضلا عن إعدادات الصورة التباين المرحلة.
   3. ضبط كثافة الليزر لكل قناة.
      ملاحظة: قد يتطلب تشغيل تجربة رائدة لتحديد نطاق شدة الفلورسنت إشارة لاحظت طوال الوقت لاستخدامها في التجربة الأخيرة.
   4. استخدام الهدف العاشر 10، التقاط الصور المرحلة الأسفار وعلى النقيض من كل ح 1 – 5 كل مدة العدوى تصل إلى نقطة في وقت المطلوب (على سبيل المثال-، hpi 48 – 72).
      ملاحظة: من المهم التقاط عرض من حقول متعددة في كل بئر دقة تقدير معدلات الإصابة في جميع أنحاء الثقافة.
3. تحليل الصور
   1. استخدام برمجيات تحليل الصورة لتحليل الصورة الآلي للقنوات الفلورسنت المناسب (مثلاً.، 405 نانومتر، 488 نانومتر، 568 nm).
   2. لحساب النسبة المئوية للخلايا التي يتم المصابة، بتقسيم العدد الإجمالي للخلايا الفلورسنت التي تشير إلى الإصابة بمنظمة (مثلاً.، الخلايا دسريد الإيجابية لمنظمة دسريد العدوى) من العدد الكلي لخلايا قابلة للتطبيق المسمى بالخلية صلاحية صبغ ل كل حقل من عرض عبر جميع العلاجات.

3-العامة بروتوكول العدوى الفيروسية لفحوصات الإنقاذ منظمة على أساس التﻷلؤ في الخلايا LD652

1. إعداد العدوى
   1. 30 دقيقة قبل الإصابة، تحسن مخزونات منظمة-لوك¹⁶ (سلالة المؤتلف منظمة تعرب عن هذا البروتين لوسيفراس اليراع الحر لا تنصهر فيها أي بروتين منظمة أخرى). إذا المعايرة للإنقاذ منظمة-لوك خلال كوينفيكتيون فاكف، أيضا ذوبان فيروس فاكف-WR على الجليد.
      فيروسات أخرى (إلى جانب فاكف-WR) ملاحظة: قد إنقاذ منظمة-لوك خلال كوينفيكشن، ولكن هذا سيكون يحدد تجريبيا قبل كل مستخدم.
   2. إعداد العدوى عن طريق إضعاف منظمة-لوك في وجود أو عدم وجود فاكف-WR في الإدارة المستدامة للغابات أن يتحقق وزارة الداخلية من 10 و 25، على التوالي، عند إضافة وحدة تخزين إجمالي العدوى من 0.2 مل/حسنا.
2. عدوى الخلايا
   1. نضح ناضجة LD652 الإعلام بعناية لتجنب الإخلال أحادي الطبقة وتلقيح مع 0.2 مل من الفيروسات/جيدا. ويعرف هذا الوقت 0 hpi. إضافة SFM العقيمة إلى آبار إضافية لتكون بمثابة علاجات التحكم السلبي "إصابة صورية".
   2. احتضان الخلايا في العدوى ح 2 في 27 درجة مئوية.
   3. في hpi 2، إزالة العدوى عن طريق الاستنشاق واستبدال مع 1 مل/حسنا وسائط النمو LD652.
   4. السماح بالعدوى إلى المضي قدما hpi 24 – 72.

4-لوسيفراس بالانزيم

1. إعداد خلية ليساتيس
   1. عناية نضح المادة طافية وإضافة 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس)/حسنا.
   2. استخدام المكبس لحقنه 1 مل، كشط الخلايا في دببس.
   3. نقل الخلايا إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي، وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
   4. ومن ناحية أخرى، تعد 1 تمييع x 5 x مراسل تحلل المخزن المؤقت (رلب) في العقيمة H₂o.
   5. وعقب الطرد المركزي، نضح دببس دون إزعاج بيليه الخلية.
   6. ريسوسبيند كل بيليه في 150 ميليلتر من 1 x RLB.
   7. تجميد أذاب العينات 1 x باستخدام حضانة 5-دقيقة في ثلاجة-80 درجة مئوية متبوعاً ذوبان سريع في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة. تخزين ليساتيس في-80 درجة مئوية حتى على استعداد لتحليل.
2. تحليل لوسيفراس
   1. ذوبان الجليد ليساتيس على الجليد.
   2. "الماصة؛" 20 ميكروليتر من في بئر الميكروسكوبية 96-بئر سوداء أو بيضاء صلبة.
   3. إضافة 100 ميكروليتر من كاشف الإنزيم لوسيفراس لكل بئر.
   4. قياس شدة الضوء باستخدام لومينوميتير الفور (وسيكون الإعدادات المناسبة للومينوميتيرس معينة يحددها المستخدم تجريبيا).
3. تحليل الإنزيم لوسيفراس
   1. تطبيع لو إشارات لكل معاملة للقراءات لو تم الحصول عليها من مراقبة العلاج (نتائج الممثل). بعد أن تم إجراء تجارب مستقلة على الأقل ثلاثة، يمكن تحليل يعني لو تم الحصول عليها من كل مجموعة العلاج/التحكم بالاختبارات الإحصائية المناسبة.

5-إيمونوبلوت

1. استخدام ليساتيس استخراج لفحوصات لوك للحزب الديمقراطي الصربي صفحة و immunoblotting اللاحقة، باستخدام الكواشف المناسبة والأجهزة.

6. عيار منظمة من الثقافات الخلية LD652

1. لوحة LD652 الخلايا وفقا للخطوة 1، 1.
2. الفيروسية تصيب الخلايا وفقا للخطوة 3.
3. في النقاط الزمنية المرغوبة، جمع في supernatants في أنابيب ميكروسينتريفوجي العقيمة.
4. بيليه الخلايا باستخدام 1,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية ونقل سوبيرناتانتس بأنابيب جديدة.
5. تخزين سوبيرناتانتس في-80 درجة مئوية أو المضي قدما في المعايرة بمقايسة البلاك على الخلايا BSC-40.
   ملاحظة: إذا المعايرة منظمة من الثقافات الخلية LD652 يحتوي على فاكف، فإنه من المستحسن إضافة 100 ميكروغرام/مل السيتوزين أرابينوسيدي (أراك) إلى بكالوريوس العلوم-40 ثقافة وسائل الإعلام داخل hpi 2، للحيلولة دون تشكيل لويحات على بكالوريوس العلوم-40 مونولاييرس¹³المتبقية فاكف الجسيمات. أراك هو مثبط فيروسية دنا بوليميريز كتل "الحمض النووي فاكف" النسخ المتماثل²⁵ ولكن لا يؤثر على النسخ المتماثل لمنظمة.

7-اختلافات منظمة على أساس التﻷلؤ إنقاذ فحوصات في الخلايا LD652: [رني] وتجارب تعداء بلازميد

1. إعداد دسرنا لوساطة [رني] ضربة قاضية لفيروسي أو استضافة المحاضر
   1. التصميم الخاصة بالجينات الإشعال الذيل في نهاية 5 ' مع تسلسل المروج T7 (تاتاكجاكتكاكتاتاجج) لاستهداف أما الفيروس كوينفيكتينج (مثلاً، فاكف) أو ديسبار L. مرناً المحاضر للفائدة. كبسولة تفجير هذه ينبغي أن إنتاج منتج PCR من 400 – 600 شركة بريتيش بتروليوم لفعاله [رني] بوساطة ضربة قاضية. انظر مرس et al. استخدام ¹³ لمتواليات التمهيدي أدناه إلى ضربة قاضية فاكف أو ديسبار ل. النصوص بوساطة دسرنا [رني] في الخلايا LD652.
      ملاحظة: نشرت ديسبار L. مرناً يمكن التعرف على النصوص من ديسبار L. الترنسكربيتوم قواعد بيانات^26،،من²⁷²⁸.
   2. تولد من دنا قالب عبر RT-PCR (توليف كدنا: دورة 1 من 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة؛ بكر: دورات 40 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 50 درجة مئوية لمدة 30 s، و 68 درجة مئوية ل 45 s كل).
   3. تنقية المنتج PCR باستخدام مجموعة أدوات تنقية PCR.
   4. استخدام المنتج بكر المنقي كقالب، المختبر في تدوين وتنقية دسرنا تستخدم في المختبر وتدوين وتنقية مجموعة.
2. تعداء دسرنا أو بلازميد الحمض النووي في الخلايا LD652
   1. البذور 1 × 10⁵ خلايا/جيدا صفيحة 24-جيدا وترك الخلايا تسوية على الأقل 1 ح.
   2. لكل بئر تكون ترانسفيكتيد، يضعف 4 ميكروليتر من تعداء الكاشف إلى 100 ميكروليتر من الإدارة المستدامة للغابات. احتضان لمدة تصل إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يمكن تغيير هذا جعل مزيج رئيسي لجميع ترانسفيكشنز التي يتعين القيام بها.
   3. إضعاف ما يصل إلى 1 ميكروغرام دسرنا أو مجموع بلازميد الحمض النووي مع 100 ميكروليتر من الإدارة المستدامة للغابات لكل بئر يكون ترانسفيكتيد. احتضان لمدة تصل إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: قد سبق وجدنا أن تعداء من 1 ميكروغرام من الخلايا دسرنا/10⁵ LD652 كافية > ضربة قاضية 80% أما الفيروسية أو استضافة محاضر¹³، لكن جرعة دسرنا اللازمة لتعديل التجريبية الإطار ups/الظروف سيتعين يجب تحديد تجريبيا.
   4. الجمع بين تخفيف تعداء الكاشف ودسرنا/بلازميد الحمض النووي بنسبة 1:1 (مثلاً، 100 ميكروليتر من دسرنا المخفف مختلطة مع 100 ميكروليتر من كاشف تعداء المخفف) واحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   5. في الوقت نفسه، غسل الآبار مع 1 مل/بشكل جيد للإدارة المستدامة للغابات، ثم قم بإضافة 500 ميكروليتر من الإدارة المستدامة للغابات لكل بئر.
   6. أضف ببطء تعداء دسرنا كاشف (أو بلازميد الدنا) خليط دروبويسي في كل بئر.
   7. احتضان الكاشف تعداء مع الخلايا ح 5.
      1. ل [رني] استبدال التجارب التي تنطوي على ضربة قاضية للنصوص المشفرة بواسطة فيروس كوينفيكتينج (مثلاً، فاكف)، الكاشف تعداء بعد فترة الحضانة تعداء 5-ح مع فيروس العدوى تتضمن منظمة-لوك (مع أو بدون فاكف أو فيروس كوينفيكتينج آخر) (الخطوة 3). بعد ذلك، استبدال العدوى الفيروس تتضمن منظمة-لوك مع hpi الإعلام 2 كاملة النمو. يمكن إجراء فحوصات لوك (خطوة 4) ثم على ليساتيس المستخرج في نقاط زمنية مختلفة تحديد إذا كان ضربة قاضية من كوينفيكتينج نسخ الفيروس تؤدي إلى خسارة في لوك منظمة الإنقاذ.
      2. لتجارب [رني] مع [رني] النصوص ديسبار L. ، استبدال هذا المزيج تعداء مع وسائط النمو الكامل والسماح بضربه قاضية تنجم عن 24 ساعة قبل الإصابة مع منظمة-لوك (الخطوة 4). يمكن إجراء فحوصات لوك (خطوة 4) ثم على ليساتيس المستخرج في نقاط زمنية مختلفة لتحديد إذا كان ضربة قاضية النصوص ديسبار L. يعزز لوك منظمة الإنقاذ.
      3. للتجارب التي تنطوي على ترانسفيكتيونس ناقلات التعبير بلازميد معربا عن إيمونومودولاتورس مرشح، استبدال الكاشف تعداء والسماح للبروتين التعبير عن 24 ساعة قبل العدوى مع منظمة-لوك (الخطوة 4). يمكن إجراء فحوصات لوك (خطوة 4) ثم على ليساتيس المستخرج في نقاط زمنية مختلفة تحديد ما إذا كان التعبير عن البروتينات immunomodulatory مرشح يعزز لوك منظمة الإنقاذ.
         ملاحظة: الشروط تعداء الموضحة هنا باستخدام 1 ميكروغرام/بئر نتيجة الحمض النووي بلازميد في الكفاءة تعداء من 40 – 60%¹³.

النتائج

كمثال لخلية يعيش تطبيقات التصوير لمراقبة منظمة الإنقاذ عند كوينفيكشن فاكف، الخلايا LD652 كانت مطلي في طبق غرف 8-جيدا وثم إصابة صورية أو المصابين بمنظمة دسريد (موي = 1) في وجود أو عدم وجود فاكف-فلوريدا-التجارة والنقل (موي = 25). نظراً لأن منظمة دسريد تعرب عن دسريد بروتين حرة وهي ل?...

Discussion

هنا لقد قمنا بوصف فحوصات بسيطة على الأسفار والتلألؤ الشاشة للظروف التي إنقاذ منظمة النسخ المتماثل في الثقافات الخلية ليبيدوبتيران التقييدية. العدوى فاشل من منظمة في الخلايا ليبيدوبتيران يخلق نسبة الإشارة إلى الضوضاء ممتازة عند المعايرة للتعبير الجيني منظمة. على سبيل المثال، كانت الإشا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture plates	CELLTREAT	229106
24-well tissue culture plates	CELLTREAT	229124
10 cm tissue culture dishes	Corning	C430167
Grace’s Insect Medium	Sigma	G8142
EX-CELL 420	Sigma	14420C
Fetal Bovine Serum - Optima	Atlanta Biologicals	S12450
Growth medium			1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1% antibiotic-antimycotic solution and 10% Fetal bovine serum
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×)	Sigma	A5955
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma	D8662
Serum Free Media (SFM)	Thermo Fisher	10902096
Cytosine arabinoside	Sigma	C1768
Transfection reagent	Thermo Fisher	10362100
Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Corning	25950CQC
Reporter lysis buffer 5x	Promega	E3971
Luciferase Assay Reagent	Promega	E1483
96-Well Microplates	Corning	3915
Mouse anti-FLAG antibody	Wako	014-22383
Rabbit anti-firefly luciferase antibody	Abcam	ab21176
Mouse anti-actin antibody	Sigma	A2066
Mouse anti-VSV M	N/A	N/A	Dr. John Connor (Boston University)
Mouse anti-VACV I3L	N/A	N/A	Dr. David Evans (University of Alberta)
8-well Chambered dish	Lab-Tek II	155409
Cell viability dye	Thermo Fisher	C12881
FLUOstar microplate reader	BMG Labtech	FLUOstar
Confocal microscope	Olympus	FV10i-LIV
Image analysis software	Olympus	v1.18	cellSens software
Eppendorf 5702 ventilated centrifuge	Eppendorf	22628102
Odyssey Fc Infrared Imaging System	Li-COR Biosciences	Odyssey Fc
LD652 cells	N/A	N/A	Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada)
BSC-40 cells	ATCC	CRL-2761
BHK cells	ATCC	CCL-10
HeLa cells	ATCC	CCL-2
BSC-1 cells	ATCC	CCL-26
in vitro transcription and purification kit	Thermo Fisher	AM1626
PCR purification kit	Qiagen	28104