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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous présentons ici les protocoles afin d’identifier les immunomodulateurs 1) virus codé qui favorisent la réplication arbovirus et facteurs de l’hôte 2) eucaryotes que restreignent la réplication des arbovirus. Ces méthodes à base de fluorescence et de luminescence aux chercheurs d’obtenir rapidement des afficheurs quantitatives de réplication arbovirus dans les essais simplistes avec des rapports signal sur bruit faibles.

Résumé

RNA interference - et génome édition axée sur les plateformes de dépistage ont été couramment pour identifier les facteurs de cellule hôte qui restreignent la réplication du virus. Toutefois, ces écrans sont généralement effectuées dans des cellules qui sont naturellement permissives au pathogène viral à l’étude. Par conséquent, la réplication robuste de virus dans des conditions de contrôle peut limiter la plage dynamique de ces écrans. En outre, ces écrans peuvent être incapables d’identifier facilement les voies de défense cellulaire qui restreignent la réplication du virus si le virus est bien adapté à l’hôte et capable de lutter contre les défenses antivirales. Dans cet article, nous décrivons un nouveau paradigme pour explorer les interactions virus-hôte grâce à l’utilisation des écrans qui se centre sur les infections naturellement avortées par arbovirus tels que les virus de la stomatite vésiculaire (VSV). Malgré la capacité de la VSV à reproduire dans un large éventail d’insectes diptères et hôtes mammifères, VSV subit une infection postérieure à la création avortée dans une variété de lignées cellulaires dérivées de lépidoptères, tels que la spongieuse (Lymantria dispar). Cependant, ces infections VSV avortées peuvent être « sauvées » lorsque les défenses antivirales des cellules hôte sont compromises. Nous décrivons comment VSV souches gènes codant de journaliste commode et restrictives dispar L. lignées cellulaires peuvent être couplées aux écrans de configuration afin d’identifier les facteurs de l’hôte impliqués dans restriction des arbovirus. En outre, nous montrons également l’utilité de ces outils de dépistage pour l’identification des facteurs virally codés que sauver la réplication VSV pendant la co-infection ou par le biais de l’expression ectopique, y compris celles encodées par des virus chez les mammifères. La limitation naturelle de la réplication dans les cellules de dispar L. VSV fournit un rapport signal sur bruit élevé lorsque le dépistage pour les conditions qui favorisent le sauvetage VSV, permettant ainsi l’utilisation d’épreuves simplistes luminescence et fluorescence dotés de surveiller les modifications dans la réplication de VSV. Ces méthodes sont utiles pour comprendre l’interaction entre réponses antivirales de l’hôte et des facteurs viraux évasion immunitaire.

Introduction

La capacité d’un virus de façon productive répliquer dans un hôte particulier est régie en partie par la disponibilité des facteurs de cellule hôte prenant en charge l’entrée virale et réplication1. La gamme de virus-hôte peut aussi être dictée par la capacité d’un virus à compteur cellulaire antivirale défenses qui seraient autrement empêcher la réplication virale2,3. Il est le fruit de ces interactions hôte-virus complexe qui décident en dernier ressort si un virus sera en mesure de terminer son cycle de vie dans un hôte particulier. Étant donné les conséquences potentiellement pathogènes pour l’hôte si la réplication virale s’ensuit, il est essentiel d’élaborer des stratégies expérimentales pour approfondir notre compréhension des interactions virus-hôte clés qui peuvent faire pencher la balance entre avortée et productif infections. Élucider les caractéristiques moléculaires de l’interaction virus-hôte jouera un rôle déterminant dans le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques antivirales.

Avec l’avènement de l’ARN interférence (ARNi)4,5 et les outils de retouche du génome (e.g., CRISPR-Cas9, Zinc finger nucleases, TALENs)6,7, il est devenu expérimentalement possible de modifier la expression des facteurs cellulaires sur tout le génome, échelles et d’analyser l’impact de ces modifications sur la réplication virale. En effet, les nombreux RNAi et génome édition dotés d’écrans ont été menées dans les types de cellule hôte d’invertébrés et de vertébrés qui ont dévoilé de nouvelles facettes de virus-hôte interactions8,9,10, 11 , 12. ces écrans emploient généralement virus codant des journalistes, comme la luciférase firefly (LUC) ou protéines fluorescentes (e.g., GFP, DsRed), qui fournissent un moyen pratique d’évaluer quantitativement l’expression de gènes viraux comme une lecture pour la réplication virale9,12. Cette stratégie permet aux chercheurs d’identifier les facteurs de l’hôte qui soit promouvoir ou antagonisent la réplication virale, comme en témoignent les augmentations ou diminutions, respectivement, en journaliste virale signaux9,12. Toutefois, dans la grande majorité des cas, ces écrans ont été réalisées à l’aide de virus qui sont bien adaptés pour le type de cellule hôte dans lequel ils sont à l’étude. Si cette stratégie peut être importante pour la compréhension des relations coévolutive entre les virus pathogènes et leurs hôtes naturels, il pose des préoccupations fondamentales au sujet de leur utilisation en découvrant facteurs antiviraux de l’hôte. Dans ces cas, une amélioration dans la journaliste virus signal à Arni knockdown est recherchée ou à l’inactivation d’un facteur cellulaire qui normalement empêche la réplication virale. Tout d’abord, si un virus est déjà capable de se répliquer fermement dans la cellule hôte examinée dans des conditions de contrôle, la plage dynamique de l’écran (c'est-à-dire, la capacité de distinguer entre le fond et journaliste virale accrue des signaux) peut être limitée. Deuxièmement, ce problème est aggravé par les situations dans lesquelles le virus est bien adapté à la cellule hôte et efficace à la lutte contre les voies de défense hôte qui sont ciblés sur l’écran.

En raison de préoccupations ci-dessus au sujet de l’interaction virus-hôte traditionnelles méthodes de dépistage, nous avons développé un nouveau paradigme pour étudier les interactions virus-hôte qui exploitent les infections naturellement abortif arbovirus dans des cellules d’insectes lépidoptères. Cette stratégie découle d’une observation que l’arbovirus humaine bien étudiés, VSV, subit une infection avortée dans les cellules dérivées de la spongieuse (L. dispar)13. VSV est naturellement transmise par des insectes diptères (c.-à-d., phlébotomes) aux hôtes mammifères et il a été démontré expérimentalement pour infecter un large éventail d’invertébrés et vertébrés hôtes dans les deux cellules de culture et in vivo14. Le génome d’ARN simple brin sens négatif 11-Ko de la VSV encode les ARNm subgénomique cinq qui sont chacun traduits les protéines qui composent le virion enveloppé. Cependant, systèmes de génétique inverses VSV ont permis la création de souches aptes à la réplication encodage LUC ou protéines fluorescentes, outre les cinq VSV naturelle gène produits15,16,17. Comme ces protéines journaliste ne sont pas incorporées dans le virion VSV, ils proposent une lecture commode pour l’expression de gène VSV qui survient après l’entrée. À l’aide de souches VSV codant la GFP ou LUC, nous avons déjà montré que l’expression des gènes VSV est strictement limitée à l’entrée des cellules LD652 et que les titres VSV n’augmentent pas par une infection après 72 heures (hpi). En revanche, la co-infection des cellules LD652 VSV et les mammifères poxvirus, virus de la vaccine (VACV), provoque une augmentation logarithmique de l’expression des gènes VSV tant des titres par ce point dans le temps. VACV subit l’expression des gènes précoces, réplication de l’ADN et la fin expression génique dans les infections de cellules LD652, mais le cycle de réplication VACV est finalement avorté en raison de virion incomplète morphogenèse18. Le grand génome d’ADN ~ 192-Ko de VACV encode les protéines > 200, dont beaucoup affichent des propriétés immunomodulatrices qui favorisent la réplication virale par la suppression de l’hôte des réponses immunitaires19. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que le « sauvetage » de la réplication dans les cellules LD652 de la co-infection VACV VSV a été probablement véhiculé par immunomodulateurs VACV qui inhibe les réponses dispar L. normalement limiter la réplication VSV. À l’appui de cela, le traitement des cellules LD652 avec l’inhibiteur de II hôte RNA polymérase actinomycine D sauve aussi réplication de la VSV dans les cellules LD652, indiquant que la transcription dépendante h6te bloque VSV réplication après l’entrée13.

Ces observations suggèrent que le caractère restrictif naturellement des cellules LD652 à l’infection de VSV peut fournir un fond relativement faible lorsque le dépistage pour les conditions qui améliorent les signaux codés VSV journaliste (c'est-à-direceux qui inhibent l’hôte défenses antivirales). Ici, nous fournissons les méthodes pour l’utilisation de la fluorescence ou analyses LUC à l’écran pour des conditions qui soulagent la restriction de la VSV dans des cellules chez les lépidoptères. Tout d’abord, nous montrons comment ces tests peuvent être utilisés pour identifier les facteurs immunomodulateurs virally codé qui cassent la restriction VSV au cours de deux expériences de co-infection ou par le biais de l’expression ectopique de facteurs viraux de candidat. À titre d’exemple, nous illustrons comment nous avons utilisé ces techniques de dépistage pour identifier les poxvirus codé A51R protéines comme une nouvelle famille de facteurs immunomodulateurs qui sauver réplication VSV en l’absence d’autres facteurs de poxvirus13. Deuxièmement, nous illustrons comment RNAi de dépistage dans les infections de cellule de VSV-LD652 restrictives peut servir à identifier directement facteurs de l’hôte eucaryote participant à arbovirus restriction13.

Protocole

1. GENERALITES Lymantria dispar (LD652) Culture de cellules et Virus

  1. LD652 cellule culture et placage
    1. À la culture dispar L.-dérivées des cellules LD652, maintenir une monocouche de cellules dans un milieu de culture (Table des matières) incubés à 27 ° C sous atmosphère normale. Maintenir les cellules en plats de tissu-culture-traitée de 10 cm et de passage des cellules en arrivant à confluence de 80 %.
    2. Plaque, déloger les cellules adhérentes de LD652 de la plaque en pipettant également les médias à plusieurs reprises sur la monocouche (ces cellules ne nécessitent pas de trypsinisation de déloger) et diluer l’échantillon dans les milieux de culture à une densité approximative de 1 x 105 cellules/mL. Pipette 1 mL de culture dilué/puits d’une plaque 24 puits. Graines d’un minimum de trois répliques puits/traitement type pour chaque point dans le temps (un maximum de huit traitements/plaque).
    3. Laissez les cellules à se contenter d’un minimum de 1 h.
  2. Préparation de virus de la Vaccine
    1. Pour préparer les stocks de VACV, amplifier le virus en HeLa cellules20 ou des cellules de rein de singe vert africain (cellules BSC-1 ou BSC-40)20,21,22.
      Remarque : La souche VACV Western Reserve (VACV-WR) fonctionne bien dans les essais décrits ici.
    2. Titrer l’essai VACV souche via le plaque sur BSC-1 ou BSC-40 cellules20,22.
      NOTE : Tous ont indiqué multiplicité VACV d’infection (MOI) décrites ici pour LD652 les infections cellulaires reposent sur des titres obtenus à partir des essais de plaque BSC-40.
  3. Préparation de virus de la stomatite vésiculeuse
    1. Pour préparer les stocks VSV, amplifier le virus dans les cellules BHK23.
    2. Titrer VSV par essai de plaque sur BSC-40 ou BHK cellulaires monocouches13,23.
      Remarque : Tous les MOIs de VSV décrites ici pour LD652 les infections cellulaires reposent sur des titres obtenus à partir des essais de plaque BSC-40.

2. basés sur la fluorescence VSV sauvetage dosage à l’aide de la co-infection et l’imagerie de cellules vivantes

  1. Ensemencement et l’infection des cellules LD652
    1. LD652 plaque 40 000 cellules/puits d’une chambre de 8 puits.
    2. Pour l’imagerie de cellules vivantes basés sur la fluorescence, utiliser des souches VSV codant des protéines fluorescentes. Les expériences présentées ici utilisent VSV-DsRed17, une souche recombinante de VSV qui exprime des protéines DsRed libres qui ne sont pas fusionné à toute autre protéine de la VSV.
      Remarque : L’infection des cellules LD652 VSV n’est pas cytopathogène par hpi 96 et, ainsi, la mort cellulaire n’est pas un facteur de confusion lors de l’évaluation de réplication VSV dans ce laps de temps.
    3. Préparer la VSV-DsRed et VACV-FL-GFP dans un milieu sans sérum (GDF ; Table des matières) à un MOI de 1 et 25, respectivement.
      Remarque : VACV-FL-GFP est une souche recombinante de VACV qui exprime une fusion entre LUC et GFP24. Un MOI de 25 ou plus pour les souches VACV s’assure que toutes les cellules de LD652 infecté13. Si vous utilisez un autre virus coinfecting, ministère de l’intérieur devront être déterminées empiriquement par l’utilisateur. Chaque traitement de l’infection doit être mis en place dans les puits dédoublés et inclure les traitements mock-infectés dans lequel seulement GDF est ajouté aux cellules.
    4. Incuber les cellules dans 0,2 mL d’inoculum pendant 2 h à 27 ° C.
    5. Laver les cellules avec 0,5 mL/bien des milieux de culture.
    6. Incuber les cellules à 25 μM de colorant de viabilité cellulaire (Table des matières) dans les milieux de croissance pendant 45 min à 27 ° C.
    7. Aspirer les médias et laver les puits 1 x 0,5 ml/bien pour enlever le colorant excédentaire.
    8. Maintenir les cellules en 0,3 mL/bien des milieux de croissance.
  2. Vivre la cellule image capture
    1. Tourner sur un microscope confocal 30 min à l’avance et un plat de 8 puits chambre de charge.
      Remarque : Les cellules de LD652 peuvent être photographiées à température ambiante allant de 20 à 25 ° C, mais pour des conditions optimales, la température de la pièce doit être ajustée à 27 ° C.
    2. Configurer les paramètres d’excitation/émission appropriés pour chaque protéine marqueur fluorescent à être photographiée, ainsi que les paramètres d’image de contraste de phase.
    3. Ajuster l’intensité du laser pour chaque canal.
      Remarque : Cela peut nécessiter une expérience pilote pour déterminer la plage d’intensité de signal fluorescent observée tout au long de temps à utiliser dans la dernière expérience en cours d’exécution.
    4. Avec l’objectif 10 X, enregistrez les images de contraste et de la fluorescence de phase de chaque bien chaque 1 – 5 h pour la durée de l’infection jusqu'à un certain point la durée souhaitée (par exemple., 48 – 72 hpi).
      Remarque : Il est important de saisir les multiples champs de vision dans chaque puits d’évaluer avec précision le taux d’infection dans l’ensemble de la culture.
  3. Analyse d’images
    1. Utiliser le logiciel d’analyse image pour analyse d’image automatique de canaux fluorescents appropriés (par ex.., 405 nm, 488 nm, 568 nm).
    2. Pour calculer le pourcentage de cellules qui sont infectés, divisez le nombre total de cellules fluorescentes indiquant une infection VSV (e.g., cellules DsRed positives pour les infections de VSV-DsRed) par le nombre total de cellules viables marquées par le colorant de viabilité cellulaire pour chaque champ de vision à travers tous les traitements.

3. le général Infection virale protocole pour VSV axée sur la Luminescence des dosages de sauvetage dans les cellules de LD652

  1. Préparation de l’inoculum
    1. 30 min avant l’infection, décongeler les stocks de VSV-LUC16 (un recombinant VSV souche qui se déclare libre firefly luciférase protéine ne fondue pas à toute autre protéine de la VSV). Si le dosage pour le sauvetage de VSV-LUC au cours de la co-infection VACV, également décongeler le virus VACV-WR sur la glace.
      Remarque : Autres virus (en dehors de VACV-WR) peuvent sauver VSV-LUC au cours de la co-infection, mais cela devra être déterminé empiriquement par chaque utilisateur.
    2. Préparation de l’inoculum en diluant VSV-LUC en présence ou en absence de VACV-WR dans la gestion durable des forêts tels qu’un MOI de 10 et 25, respectivement, est atteint lors de l’ajout d’un volume total d’inoculum de 0,2 mL/ainsi.
  2. Infection des cellules
    1. Aspirer mature LD652 médias avec précaution pour ne pas perturber la monocouche et ensemencer avec 0,2 mL de virus/puits. Ce temps est défini comme 0 hpi. Ajouter GDF stérile aux puits supplémentaires pour servir de « mock-infecté » des traitements de contrôle négatif.
    2. Incuber les cellules de l’inoculum pendant 2 h à 27 ° C.
    3. À 2 hpi, enlever l’inoculum par aspiration et remplacer par 1 mL/bien des milieux de culture LD652.
    4. Permettre l’infection aller de 24 à 72 hpi.

4. de luciferase

  1. Préparation des lysats cellulaires
    1. Soigneusement, aspirer le surnageant et ajouter 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (SPD) / bien.
    2. En utilisant le piston d’une seringue de 1 mL, gratter les cellules dans le SPD.
    3. Transférer les cellules dans un tube de microcentrifuge et centrifuger à 400 x g pendant 20 min à 4 ° C.
    4. Pendant ce temps, préparer 1 dilution x 5 x tampon de lyse de journaliste (RLB) stérile H2O.
    5. Après la centrifugation, aspirer le SPD sans déranger le culot cellulaire.
    6. Resuspendre chaque culot dans 150 µL de 1 x RLB.
    7. Gel-dégel des échantillons 1 x en utilisant une période d’incubation de 5 min dans un congélateur à-80 ° C suivi d’un dégel rapid dans un bain-marie à température ambiante. Stocker les lysats à-80 ° C jusqu’au moment de l’analyser.
  2. Analyse de luciferase
    1. Décongeler les lysats sur la glace.
    2. Distribuer 20 μL de lysat dans un puits d’une microplaque de 96 puits solide noir ou blanc.
    3. Ajouter 100 μl de réactif d’analyse luciférase dans chaque puits.
    4. Mesurez immédiatement l’intensité lumineuse à l’aide d’un luminomètre (paramètres appropriés pour luminomètres spécifiques devront être déterminées empiriquement par l’utilisateur).
  3. Analyse de test de luciférase
    1. Normaliser les signaux de LU pour chaque traitement de lectures LU obtenus à partir des traitements de lutte (Représentant des résultats). Après ont effectué au moins trois expériences indépendantes, la moyenne que lu provenant de chaque groupe de traitement/contrôle peut être analysée par les tests statistiques appropriés.

5. Immunoblot

  1. Utilisez les lysats extraites pour les dosages LUC pour SDS-PAGE et immunoblotting ultérieur, à l’aide d’instruments et réactifs appropriés.

6. titre de la VSV de Cultures de cellules LD652

  1. Plaque de LD652 cellules selon étape 1.1.
  2. Viral infectent les cellules selon l’étape 3.
  3. Aux moments désirés, recueillir les surnageants dans des microtubes stériles à.
  4. Les cellules à l’aide de 1 000 x g pendant 10 min à 4 ° C de granule et transférer les surnageants dans de nouveaux tubes.
  5. Stocker les surnageants à-80 ° C ou bien procéder à titrage par essai de plaque sur les cellules BSC-40.
    Remarque : Si le titrage VSV de cultures de cellules LD652 qui contenait des VACV, il est conseillé d’ajouter 100 μg/mL cytosine arabinoside (AraC) pour les milieux de culture de BSC-40 dans 2 hpi, pour empêcher que les particules résiduelles de VACV formant des plaques sur des monocouches de BSC-4013. AraC est un inhibiteur de l’ADN polymérase virale qui bloque la réplication de l’ADN VACV25 , mais n’affecte pas la réplication de la VSV.

7. variations de la VSV axée sur la Luminescence des essais dans les cellules LD652 de sauvetage : RNAi et expériences de Transfection de plasmide

  1. Préparation d’ARNdb de précipitation véhiculée par ARNi de virale ou d’accueillir des transcriptions
    1. Amorces de gène-spécifique de conception à queue à l’extrémité 5' avec la séquence du promoteur T7 (TAATACGACTCACTATAGGG) soit cibler le virus coinfecting (par exemple, VACV) ou dispar L. mRNA transcriptions d’intérêt. Ces amorces devraient produire un produit de PCR de 400 – 600 bp pour efficace par l’ARN-knockdown. Voir Gammon et al. 13 pour les séquences d’amorces utilisée ci-dessous à coup de masse VACV ou dispar L. transcriptions de dsRNA véhiculée par ARNi dans les cellules LD652.
      NOTE : Dispar L. mRNA transcriptions peuvent être identifiées à partir publié dispar L. transcriptome bases de données26,27,28.
    2. Générer un ADN modèle par RT-PCR (synthèse de cDNA : 1 cycle de 50 ° C pendant 30 min ; PCR : 40 cycles de 94 ° C pendant 15 s, 50 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 45 s chacun).
    3. Purifier le produit de la PCR à l’aide d’un kit de purification de PCR.
    4. Le produit PCR purifié en utilisant comme modèle, in vitro transcrire et purifier dsRNA utilisant un in vitro kit transcription et la purification.
  2. Transfection de dsRNA ou l’ADN de plasmide dans les cellules de LD652
    1. Semences de 1 x 105 cellules/puits d’une plaque 24 puits et laisser les cellules à se contenter d’au moins 1 h.
    2. Pour chaque puits à transfecter, diluer 4 μl de réactif de transfection dans 100 μl de l’AFD. Incuber pendant jusqu'à 15 min à température ambiante. Cela peut être dimensionnée pour faire un mélange maître pour tous les transfections à accomplir.
    3. Diluer jusqu'à 1 μg de dsRNA ou l’ADN de plasmide total avec 100 μL de GDF pour chaque puits à transfecter. Incuber pendant jusqu'à 15 min à température ambiante.
      NOTE : Nous avons trouvé précédemment qu’une transfection de 1 μg de dsRNA/105 LD652 cellules suffit pour > knockdown 80 % soit virale ou d’accueillir des transcriptions13, mais des doses de dsRNA nécessaires pour modification expérimentale set-ups/conditions devront être déterminés de façon empirique.
    4. Combiner la transfection réactif et dsRNA/plasmide ADN des dilutions avec un ratio 1:1 (par exemple, 100 μL de dsRNA dilué est mélangé avec 100 μl de réactif de transfection dilués) et incuber pendant 20 min à température ambiante.
    5. Pendant ce temps, laver les puits avec 1 mL/puits de GDF et puis ajouter 500 μl de l’AFD dans chaque puits.
    6. Ajouter lentement l’ARNdb de réactif de transfection (ou l’ADN de plasmide) mélange goutte à goutte dans chaque puits.
    7. Incuber le réactif de transfection avec les cellules pendant 5 h.
      1. Pour RNAi expériences impliquant la précipitation des transcriptions codées par un virus coinfecting (par exemple, VACV), remplacer le réactif de transfection après la période d’incubation de transfection de 5 h avec un inoculum de virus contenant VSV-LUC (avec ou sans VACV ou un autre virus coinfecting) (étape 3). Par la suite, remplacer l’inoculum de virus contenant VSV-LUC avec hpi médias 2 croissance complète. Tests de LUC (étape 4) puis peuvent être effectuées que sur des lysats extraites à divers moments pour déterminer si la précipitation de coinfecting transcriptions de virus entraîne une perte de sauvetage VSV-LUC.
      2. Pour les expériences d’Arni impliquant Arni des transcriptions dispar L. , replacer le mélange de transfection avec milieux de croissance complète et laisser knockdown de s’ensuivre pendant 24 h avant l’infection avec VSV-LUC (étape 4). Tests de LUC (étape 4) puis peuvent être effectuées que sur des lysats extraites à divers moments pour déterminer si la précipitation des transcriptions dispar L. favorise le sauvetage de VSV-LUC.
      3. Pour les expériences impliquant des transfections des vecteurs d’expression de plasmide exprimant candidat immunomodulateurs, remplacer le réactif de transfection et permettant l’expression de la protéine pendant 24 h avant l’infection avec VSV-LUC (étape 4). Tests de LUC (étape 4) puis peuvent être effectuées que sur des lysats extraites à divers moments pour déterminer si l’expression de protéines immunomodulatrices candidat favorise le sauvetage de VSV-LUC.
        Remarque : Les transfection conditions décrites ici à l’aide de 1 μg/puits des résultats d’ADN de plasmide dans l’efficacité de transfection de 40 à 60 %13.

Résultats

Par exemple des applications d’imagerie de cellules vivantes pour surveiller le sauvetage VSV sur la co-infection VACV, LD652 cellules ont été plaqués dans un plat de lamelle de 8 puits puis infectés par le simulacre ou infectés par VSV-DsRed (MOI = 1) en présence ou en absence de VACV-FL-GFP (MOI = 25). Parce que VSV-DsRed exprime DsRed comme une protéine libre et n’est pas fusionné à protéines structurales de VSV (Figure 1 a), il est détecté...

Discussion

Ici, nous avons décrit simple base de fluorescence et de luminescence des tests pour dépister les conditions de sauvetage réplication VSV dans des cultures cellulaires de lépidoptères restrictives. L’infection avortée de la VSV dans les cellules lépidoptères crée un excellent rapport signal-bruit lors du dosage pour l’expression des gènes VSV. Par exemple, les signaux de LU détectés dans les lysats de simples infections VSV-LUC étaient ~ 1000 plus élevé que dans les lysats mock-infectés, mais ces sign...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

D.G. a été appuyée par un financement du programme des bourses de l’Université du Texas Southwestern Medical Center doué. Les auteurs remercient Michael Whitt (The University of Tennessee Health Science Center) et Sean Whelan (Harvard Medical School) pour la fourniture de VSV-DsRed et VSV-LUC. Les auteurs remercient également Gary Luker (Faculté de médecine de l’Université du Michigan) pour le gentil cadeau de la souche VACV-FL-GFP.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
6-well tissue culture platesCELLTREAT229106
24-well tissue culture platesCELLTREAT229124
10 cm tissue culture dishesCorningC430167
Grace’s Insect MediumSigmaG8142
EX-CELL 420Sigma14420C
Fetal Bovine Serum - OptimaAtlanta BiologicalsS12450
Growth medium1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1% antibiotic-antimycotic solution and 10% Fetal bovine serum
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×)SigmaA5955
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)SigmaD8662
Serum Free Media (SFM)Thermo Fisher10902096
Cytosine arabinosideSigmaC1768
Transfection reagentThermo Fisher10362100
Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide)Corning25950CQC
Reporter lysis buffer 5xPromegaE3971
Luciferase Assay ReagentPromegaE1483
96-Well MicroplatesCorning3915
Mouse anti-FLAG antibodyWako014-22383
Rabbit anti-firefly luciferase antibodyAbcamab21176
Mouse anti-actin antibodySigmaA2066
Mouse anti-VSV MN/AN/ADr. John Connor (Boston University)
Mouse anti-VACV I3LN/AN/ADr. David Evans (University of Alberta)
8-well Chambered dishLab-Tek II155409
Cell viability dyeThermo FisherC12881
FLUOstar microplate readerBMG LabtechFLUOstar
Confocal microscopeOlympusFV10i-LIV
Image analysis softwareOlympusv1.18cellSens software
Eppendorf 5702 ventilated centrifugeEppendorf22628102
Odyssey Fc Infrared Imaging SystemLi-COR BiosciencesOdyssey Fc
LD652 cellsN/AN/ADr. Basil Arif (Natural Resources Canada)
BSC-40 cellsATCCCRL-2761
BHK cellsATCCCCL-10
HeLa cellsATCCCCL-2
BSC-1 cellsATCCCCL-26
in vitro transcription and purification kitThermo FisherAM1626
PCR purification kitQiagen28104

Références

  1. Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. Viral tropism. Frontiers in Microbiology. 3, 281 (2012).
  2. Werden, S. J., McFadden, G. The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1784 (1), 228-237 (2008).
  3. McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. M., Bartee, E. Cytokine determinants of viral tropism. Nature Reviews: Immunology. 9 (9), 645-655 (2009).
  4. Silva, J. M., et al. Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nature Genetics. 37 (11), 1281-1288 (2005).
  5. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
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