Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle, um 1) Virus-codierte Immunmodulatoren zu identifizieren, die Förderung von Arboviren Replikation und (2) Eukaryotische Host Faktoren, die Arboviren Replikation zu beschränken. Diese Fluoreszenz und Lumineszenz-basierten Methoden können Forscher schnell quantitative Ablesung von Arboviren Replikation in einfachen Tests mit geringen Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.

Zusammenfassung

RNA - Interferenz und Genom Bearbeitung-basierten screening-Plattformen haben weit verbreitet, Host Zelle Faktoren identifizieren, die Replikation des Virus zu beschränken. Jedoch sind diese Bildschirme in der Regel in Zellen durchgeführt, die natürlich permissive auf die virale Erreger untersucht werden. Daher kann die robuste Replikation von Viren bei Kontrolle den Dynamikbereich der beiden Bildschirme beschränken. Darüber hinaus können diese Bildschirme möglicherweise nicht zelluläre Abwehr Wege leicht zu identifizieren, die Replikation des Virus zu beschränken, wenn das Virus gut angepasst, um den Host und in der Lage, die Bekämpfung der antiviralen Abwehr ist. In diesem Artikel beschreiben wir ein neues Paradigma für die Erkundung von Virus-Wirt Interaktionen durch den Einsatz von Bildschirmen, die Mitte auf natürlich abortive Infektionen durch Arboviren z. B. vesikuläre Stomatitis Virus (VSV). Trotz der Möglichkeit des VSV, in einer Vielzahl von Dipteren Insekten und Säugetieren Hosts zu replizieren erfährt VSV eine Post-Eintrag, abortive Infektion in einer Vielzahl von Zelllinien aus Lepidoptera Insekten, wie z. B. der Schwammspinner (Lymantria dispar). Jedoch können diese abortiven VSV-Infektionen "gerettet werden" beim Wirt Zelle antiviralen Abwehr beeinträchtigt werden. Wir beschreiben, wie VSV Codierung bequem Reporter-Gene und restriktive L. Dispar Stämme Zelllinien können kombiniert werden, um Setup-Bildschirme, Host Faktoren beteiligt Arboviren Einschränkung zu identifizieren. Darüber hinaus zeigen wir auch die Nützlichkeit dieser Screening-Tools bei der Identifizierung von Viral codierten Faktoren, die VSV-Replikation während Coinfection oder durch ektopische Expression, einschließlich derer von Säugetieren Viren kodiert zu retten. Die natürliche Einschränkung der VSV-Replikation in L. Dispar Zellen bietet ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis beim screening für die Bedingungen, die Förderung der VSV Rettung, so dass die Verwendung von simpel Lumineszenz und Fluoreszenz-basierende Assays zu überwachen die Änderungen in der VSV-Replikation. Diese Methoden sind wertvoll für das Zusammenspiel zwischen Host antivirale Reaktionen und viral immune Evasion Faktoren zu verstehen.

Einleitung

Die Fähigkeit eines Virus, produktiv in einem bestimmten Host replizieren wird teilweise durch die Verfügbarkeit von Host Cell Faktoren geregelt, die virale Eintrag und Replikation¹unterstützen. Virus-Wirtsspektrums kann auch durch die Kapazität eines Virus zu zellulären antiviralen Abwehr Zähler diktiert werden, die virale Replikation^2,3sonst behindern würde. Es ist das Ergebnis dieser komplexen Virus-Wirt Interaktionen, die letztlich entscheiden, ob ein Virus in der Lage, seinen Lebenszyklus in einem bestimmten Host zu vervollständigen. Angesichts der potenziell pathogenen Folgen für den Host, wenn virale Replikation erfolgt, ist es wichtig, um unser Verständnis der wichtigsten Virus-Wirt Interaktionen zu fördern, das Zünglein an der Waage zwischen erfolglosen und produktive können experimentelle Strategien zu entwickeln Infektionen. Aufklärung der molekularen Merkmale der Virus-Wirt Zusammenspiel werden maßgeblich an der Entwicklung neuer und alternativer antivirale therapeutischer Strategien.

Mit dem Aufkommen der RNA-Interferenz (RNAi)^4,5 und Genom-editing-Tools (zB., CRISPR-Cas9, Zink-finger-Nukleasen, TALENs)^6,7, geworden es experimentell möglich, Ändern der Ausdruck der zellulären Faktoren auf genomweite skaliert und erkunden Sie die Auswirkungen dieser Veränderungen auf die Virusreplikation. In der Tat, wurden zahlreiche RNAi und Genom-Bearbeitung-basierte Bildschirme in Wirbellosen und Wirbeltieren Host Zelltypen durchgeführt, die neue Facetten von Virus-Wirt Interaktionen^8,9,10, enthüllt haben ^{11 , 12}. diese Bildschirme beschäftigen in der Regel Viren Reporter, wie Glühwürmchen Luciferase (LUC) oder fluoreszierende Proteine kodieren (zB., GLP, DsRed), vorsehen, dass bequeme Mittel zur Bewertung der quantitativ virale Genexpression als einer Anzeige für die Virusreplikation^9,12. Diese Strategie erlaubt Forschern, Host Faktoren zu identifizieren, die entweder zu fördern oder Virusreplikation antagonisieren ausweislich erhöht oder verringert, bzw., in virale Reporter^{9,12 Signale}. Allerdings wurden in der überwiegenden Mehrheit der Fälle diese Bildschirme durchgeführt mit Viren, die gut angepasst, um den Host-Zelle-Typ sind, in denen sie untersucht werden. Während diese Strategie wichtig für das Verständnis der coevolutionary Beziehungen zwischen viraler Krankheitserreger und ihre natürlichen Wirte sein kann, stellt es grundsätzliche Bedenken in Bezug auf ihre Verwendung in Aufdeckung Host antiviralen Faktoren dar. In diesen Fällen eine Erweiterung in Virus Reporter signal auf RNAi Zuschlag gesucht wird oder die Inaktivierung eines zellulären Faktors, die normalerweise Virusreplikation behindert. Zuerst, wenn ein Virus bereits kräftig in der Wirtszelle untersucht unter Kontrolle Bedingungen zu replizieren, möglicherweise der dynamische Bereich des Bildschirms (d.h., die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen Hintergrund und verbesserte virale Reporter Signale) beschränkt. Zweitens ist dieses Problem noch durch die Situationen verschärft, in denen das Virus ist gut angepasst an die Wirtszelle und effektiv bei der Bekämpfung von Host Verteidigung Bahnen, die auf dem Bildschirm abgezielt werden.

Aufgrund der oben genannten Bedenken hinsichtlich traditioneller Virus-Wirt-Interaktion screening-Verfahren entwickelten wir ein neues Paradigma für das Studium von Virus-Wirt Interaktionen, die natürlich abortiven Arboviren Infektionen in Lepidoptera Insektenzellen ausnutzen. Diese Strategie ergibt sich aus einer Beobachtung, dass die gut untersuchten menschlichen Arboviren, VSV, eine abortive Infektion in Zellen aus der Schwammspinner (L. dispar)^{13 erfährt}. VSV ist natürlich durch Dipteren Insekten (z.B. Sandfliegen) an Säugetieren Hosts übertragen und wurde experimentell gezeigt, dass eine Vielzahl von Wirbellosen zu infizieren und Wirbeltiere Gastgeber in Zell-Kultur und in-Vivo-¹⁴. 11-kb negativen Sinn einsträngige RNA-Genom der VSV kodiert fünf Subgenomic mRNAs, die jeweils in Proteine übersetzt werden, aus denen das behüllte Virion besteht. Allerdings haben VSV reverse genetische Systeme für die Erstellung von Replikation zuständigen Stämme LUC oder fluoreszierende Proteine, zusätzlich zu den fünf natürlichen VSV gen Produkte^15,16,17-Codierung erlaubt. Weil diese Reporter Proteine der VSV Virion nicht integriert sind, bieten sie eine bequeme Auslesen für VSV-gen-Expression, die Post-Eintrag auftritt. VSV-Stämme, die GFP oder LUC-Codierung verwenden, haben wir zuvor gezeigt, dass VSV Genexpression bei der Einreise von LD652 Zellen stark eingeschränkt ist, VSV-Titer nicht von 72 Stunden nach der Infektion (Hpi) erhöhen. Im Gegensatz dazu führt Coinfection LD652 Zellen mit VSV und der Säugetier-Poxvirus, Vaccinia Virus (VACV), zu logarithmischen VSV Genexpression und Titer von diesem Zeitpunkt. VACV erfährt frühen Genexpression, DNA-Replikation und späten Genexpression in LD652 Zelle Infektionen, aber der VACV Replikationszyklus ist letztlich gescheiterten aufgrund unvollständiger Virion Morphogenese¹⁸. Der große ~ 192-kb-DNA-Genom des VACV kodiert > 200 Proteine, von die viele immunmodulatorische Eigenschaften anzuzeigen, die virale Replikation durch die Unterdrückung der Host Immunantworten¹⁹zu fördern. Daher wir die Hypothese aufgestellt, die die "Rettung" der VSV-Replikation in LD652 Zellen durch VACV Coinfection wahrscheinlich durch VACV Immunmodulatoren vermittelt wurde, die L. Dispar Antworten normalerweise einschränken VSV Replikation gehemmt. Zur Unterstützung rettet die Behandlung von LD652 Zellen mit dem Host RNA Polymerase II Inhibitor Actinomycin D auch VSV Replikation in LD652 Zellen, die darauf hinweist, dass die Transkription-abhängigen Host Antworten VSV Replikation nach dem Eintrag^{13 Block}.

Die obigen Beobachtungen legen nahe, dass die natürlich restriktive Charakter der LD652 Zellen, VSV-Infektion einen relativ niedrigen Hintergrund vorsehen, beim screening für die Bedingungen, die Reporter VSV-codierte Signale (d.h.diejenigen, die Host hemmen zu verstärken antiviralen Abwehr). Hier vermitteln wir die Methoden für die Verwendung von Fluoreszenz oder LUC basierende Assays zum Bildschirm für die Bedingungen, die VSV Einschränkung in Lepidoptera Zellen zu entlasten. Zunächst zeigen wir, wie diese Tests verwendet werden können, um Viral codierten immunmodulatorische Faktoren identifizieren, die VSV Einschränkung während der beiden Coinfection Experimente oder durch ektopische Expression von Kandidaten virale Faktoren zu brechen. Als Beispiel zeigen wir, wie wir diese Screening-Techniken verwendet, um Poxvirus-codierte A51R Proteine als eine neue Familie von immunmodulatorische Faktoren zu identifizieren, die VSV-Replikation in Abwesenheit von anderen Poxvirus Faktoren¹³zu retten. Zweitens zeigen wir, wie RNAi screening in restriktiven VSV-LD652 Zelle Infektionen verwendet werden kann, direkt Arboviren Einschränkung¹³eukaryotischen Host Faktoren identifizieren.

Protokoll

1. allgemeine Lymantria Dispar (LD652) Zelle und Virus-Kultur

1. LD652 Zelle kultiviert und Beschichtung
   1. Zur Kultur L. Dispar-abgeleitete LD652 Zellen, pflegen eine Monolage von Zellen in einem Wachstumsmedium (Table of Materials) bei 27 ° C unter normaler Atmosphäre inkubiert. Zellen in 10 cm Gewebe-Kultur-behandelten Gerichte zu erhalten und die Zellen beim erreichen von 80 % Konfluenz passage.
   2. Platte, adhärente Zellen der LD652 von der Platte zu vertreiben, durch die Medien immer wieder auf die Monolayer (diese Zellen benötigen keine Trypsinization, verdrängen) pipettieren und die Probe im Wachstumsmedium zu einer ungefähren Dichte von 1 x 10⁵ Zellen/mL verdünnen. Pipette 1 mL verdünnte Kultur/Brunnen von einer 24-Well-Platte. Säen Sie ein Minimum von drei replizieren Brunnen/Behandlungsart für jeden Zeitpunkt (maximal acht Behandlungen/Platte).
   3. Lassen Sie die Zellen für ein Minimum von 1 h zu begleichen.
2. Vaccinia Virus Vorbereitung
   1. Die Bestände des VACV vorzubereiten, verstärken das Virus in HeLa Zellen²⁰ oder African Green Monkey Niere Zellen (BSC-1 oder BSC-40 Zellen)^20,21,22.
      Hinweis: Dehnung VACV Western Reserve (VACV-WR) funktioniert gut in die hier beschriebenen Assays.
   2. Titrieren Sie VACV Belastung über Plaque-Assay auf BSC-1 oder BSC-40 Zellen^20,22.
      Hinweis: Alle angegebenen VACV Multiplizität der Infektion (MOI) hier für LD652 beschrieben, die Zelle Infektionen auf Titer von BSC-40 Plaque Tests erhalten basieren.
3. Vesikuläre Stomatitis Virus Vorbereitung
   1. Zur Vorbereitung der VSV Bestände verstärken Sie das Virus in BHK-Zellen-²³.
   2. Titrieren Sie VSV durch Plaque-Assay auf BSC-40 oder BHK Cell Monolayer^13,23.
      Hinweis: Alle VSV MOIs beschrieben hier für LD652 Zelle Infektionen auf Titer von BSC-40 Plaque Tests erhalten basieren.

(2) Fluoreszenz basierende VSV Rettung Assay-Co-Infektion mit Live Cell Imaging

1. Aussaat und Infektion von LD652 Zellen
   1. Platte 40.000 LD652 Zellen/nun ein 8-Well-Kammer.
   2. Verwenden Sie für Fluoreszenz basierende live Cell Imaging, VSV Stämme fluoreszierende Proteine codieren. Die hier vorgestellten Experimente verwenden VSV-DsRed¹⁷, eine rekombinante VSV-Sorte, die kostenlose DsRed Protein bringt zum Ausdruck, die nicht an andere VSV-Protein fusioniert ist.
      Hinweis: VSV-Infektion von LD652 Zellen ist nicht zytopathischen von 96 Hpi und so der Zelltod ist keine verwirrende Faktor bei der Bewertung der VSV Replikation innerhalb dieses Zeitrahmens.
   3. Bereiten Sie VSV-DsRed und VACV-FL-GFP vor, in einem serumfreien Medium (SFM; Tabelle der Materialien) bei einer MOI von 1 und 25 beziehungsweise.
      Hinweis: VACV-FL-GFP ist eine rekombinante VACV Sorte, die eine Fusion zwischen LUC und GFP²⁴ausdrückt. Mit Hilfe einer MOI von 25 oder höher für VACV Stämme sorgt dafür, dass alle LD652 Zellen infizierten¹³sind. Wenn einen anderen coinfecting Virus zu verwenden, müssen die MOI empirisch vom Benutzer bestimmt werden. Jede Infektion Behandlung sollte in doppelte Brunnen eingerichtet und beinhalten Mock-infizierten Behandlungen, in denen die Zellen nur SFM hinzugefügt wird.
   4. Inkubieren Sie die Zellen in 0,2 mL Inokulum für 2 h bei 27 ° c
   5. Waschen Sie die Zellen mit 0,5 mL/auch von Wachstumsmedium.
   6. Inkubieren Sie die Zellen in der Zelle Lebensfähigkeit Farbstoff (Table of Materials) 25 μM im Wachstumsmedium für 45 min bei 27 ° c
   7. Aspirieren Sie die Medien und waschen Sie die Vertiefungen 1 X mit 0,5 mL/gut, überschüssige Farbe zu entfernen.
   8. Pflegen Sie die Zellen in 0,3 mL/auch der Wachstumsmedien.
2. Leben Zelle Bildaufnahme
   1. Schalten Sie ein confocal Mikroskop 30 min im voraus und laden Sie eine 8-Well-Kammer-Gericht zu.
      Hinweis: LD652 Zellen bei Raumtemperaturen von 20 – 25 ° C abgebildet werden können, aber für optimale Bedingungen sollte die Temperatur des Raumes auf 27 ° c eingestellt werden
   2. Richten Sie die entsprechende Anregung/Emission Einstellungen für jedes fluoreszierenden Marker Protein abgebildet werden, sowie die Phase Kontrast Bildeinstellungen.
   3. Die Laser-Intensität für jeden Kanal.
      Hinweis: Dies kann erfordern, läuft einen Pilotversuch um festzustellen, das Spektrum der fluoreszierenden Signalintensitäten beobachtet in den zeitlichen Verlauf im letzten Versuch verwendet werden.
   4. Mit der 10 X-Objektiv erfassen die Phasenbilder Kontrast und Fluoreszenz von jedem auch jeden 1 – 5 h für die Dauer der Infektion bis zu einem gewünschten Zeitpunkt (zB., 48 – 72 Hpi).
      Hinweis: Es ist wichtig, mehrere Gesichtsfelder in jedes gut, genau zu schätzen, die Infektionsraten in der Kultur zu erfassen.
3. Bildanalyse
   1. Bildanalyse-Software für die automatisierte Bildanalyse von entsprechenden fluoreszierende Kanäle verwenden (zB., 405 nm, 488 nm, 568 nm).
   2. Um den Prozentsatz der Zellen berechnen, die infiziert sind, teilen Sie die Gesamtzahl der fluoreszierenden Zellen VSV-Infektion anzeigt (z. B.., DsRed-positiven Zellen für VSV-DsRed Infektionen) durch die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen gekennzeichnet durch Zelle Lebensfähigkeit Farbstoff für jedes Sichtfeld über alle Behandlungen.

3. allgemeine Virusinfektion Protokoll für Lumineszenz-basierte VSV-Rescue-Assays in LD652 Zellen

1. Vorbereitung des Inokulums
   1. 30 min vor der Infektion, tauen die Bestände der VSV-LUC¹⁶ (eine rekombinante VSV belasten, dass bringt kostenlose Firefly Luciferase Protein nicht an andere VSV-Protein fusioniert). Wenn für VSV-LUC Rettung während VACV Coinfection prüfen, tauen Sie auch VACV-WR-Virus auf Eis.
      Hinweis: Andere Viren (neben VACV-WR) können während der Coinfection VSV-LUC retten, aber dies muss jeder Benutzer empirisch bestimmt werden.
   2. Bereiten Sie das Inokulum VSV-LUC in das Vorhandensein oder Fehlen des VACV-WR in SFM verdünnen, sodass eine MOI von 10 und 25, bzw. erreicht wird, wenn Sie ein total Inokulum Volumen von 0,2 mL hinzufügen/gut.
2. Infektion der Zellen
   1. Aspirieren Reife LD652 Medien sorgfältig, um nicht zu stören der Monolage und impfen mit 0,2 mL Virus/gut. Diesmal ist definiert als 0 Hpi. Fügen Sie sterile SFM zusätzliche Brunnen als "Mock-infizierten" Negativkontrolle Behandlungen dienen hinzu.
   2. Inkubieren Sie die Zellen im Inokulum für 2 h bei 27 ° c
   3. 2 HPI Inokulum durch Aspiration entfernen und ersetzen mit 1 mL/sowie LD652 Wachstumsmedien.
   4. Lassen Sie die Infektion 24 / 72 Hpi vorzugehen.

4. Luciferase Assay

1. Vorbereitung der Zelle lysates
   1. Vorsichtig Aspirieren überstand und fügen Sie 1 mL Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) / gut.
   2. Verwenden den Kolben der eine 1 mL Spritze, kratzen Sie die Zellen in DPBS.
   3. Transfer der Zellen zu einem Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge bei 400 X g für 20 min bei 4 ° C.
   4. Unterdessen bereiten Sie 1 X Verdünnung 5 x Reporter Lyse Puffer (RLB) in sterilen H₂O.
   5. Nach der Zentrifugation Aspirieren des DPBS ohne zu stören die Zelle Pellet.
   6. Aufschwemmen jedes Pellet in 150 µL 1 X RLB.
   7. Frost-Tausalz-die Proben 1 x mit einer 5-min Inkubation in einem-80 ° C Gefrierschrank gefolgt von schnellen Tauwetter im Wasserbad Raumtemperatur. Speichern Sie die Lysates bei-80 ° C bis zu analysieren.
2. Luciferase assay
   1. Die Lysates auf Eis Auftauen.
   2. Pipette 20 μL der in einen Brunnen eine solide schwarz oder weiß 96-Well Mikrotestplatte lysate.
   3. Fügen Sie 100 μL der Luciferase Assay Reagenz in jede Vertiefung.
   4. Messen Sie sofort die Lichtintensität mit einem Luminometer (geeignete Einstellungen für bestimmte Luminometer müssen vom Benutzer empirisch bestimmt werden).
3. Luciferase Assay Analyse
   1. Normalisieren Sie LU Signale für jede Behandlung, LU Lesungen von Behandlungen (Vertreter Ergebnisse) erhalten. Nach mindestens drei unabhängige Experimente durchgeführt wurden, kann das bedeuten, dass, das jede Behandlung/Kontrollgruppe LU eingeholt, durch entsprechende statistische Tests analysiert werden.

5. Immunoblot

1. Verwenden Sie Lysates für LUC-Assays für die SDS-PAGE und anschließende Immunoblotting, mit entsprechenden Reagenzien und Instrumentierung extrahiert.

(6) Titer von VSV aus Zellkulturen LD652

1. Platte LD652 Zellen gemäß Schritt 1.1.
2. Viral infizieren die Zellen nach Schritt 3.
3. Zu gewünschten Zeitpunkten sammeln Sie die Überstände in sterilen Mikrozentrifugenröhrchen.
4. Pellet-die Zellen mit 1.000 X g für 10 min bei 4 ° C und die Überstände auf neue Rohre übertragen.
5. Die Überstände bei-80 ° C zu speichern oder mit Titration von Plaque-Assay auf BSC-40 Zellen fortfahren.
   Hinweis: Wenn VSV aus LD652 Zellkulturen titrieren, die VACV enthalten, ist es ratsam die BSC-40 Nährmedien innerhalb 2 Hpi zu verhindern, dass VACV restpartikel bilden Plaques auf der BSC-40 Monolagen¹³100 μg/mL Cytosin Arabinoside (AraC) hinzu. AraC ist ein viraler DNA-Polymerase-Hemmer, der Blöcke VACV DNA-Replikation²⁵ aber hat keinen Einfluss auf die VSV-Replikation.

7. Variationen der Lumineszenz-basierte VSV retten Assays in LD652 Zellen: RNAi und Plasmid Transfection Experimente

1. Vorbereitung der DsRNA für RNAi-vermittelten Knockdown von viralen oder host-Protokolle
   1. Design-gen-spezifische Primer tailed am 5'-Ende mit T7 promotorsequenz (TAATACGACTCACTATAGGG), entweder Ziel das coinfecting Virus (z.B.VACV) oder L. Dispar mRNA Transkripte von Interesse. Diese Primer sollte ein PCR-Produkt von 400 – 600 bp für effektive RNAi-vermittelten Knockdown produzieren. Siehe Gammon Et al. ¹³ für Grundierung Sequenzen verwendet unten Knockdown VACV oder L. Dispar Transkripte von DsRNA-vermittelten RNAi in LD652 Zellen.
      Hinweis: L. Dispar mRNA Transkripte von identifiziert werden können veröffentlicht L. Dispar Transkriptom Datenbanken^26,27,28.
   2. Erzeugen ein DNA-Vorlage über RT-PCR (cDNA Synthese: 1 Zyklus von 50 ° C für 30 min; PCR: 40 Zyklen von 94 ° C für 15 s, 50 ° C für 30 s und 68 ° C für 45 s).
   3. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem PCR-Reinigung-Kit.
   4. Die gereinigte PCR-Produkt als Vorlage verwenden, in Vitro transkribieren und reinigen mit einem in-vitro- Transkription und Reinigung Kit DsRNA.
2. Transfektion von DsRNA oder Plasmid DNA in Zellen LD652
   1. Samen 1 x 10⁵ Zellen/Brunnen von einer 24-Well-Platte und lassen Sie die Zellen, die für mindestens 1 h zu begleichen.
   2. Verdünnen Sie für jedes gut zu transfiziert werden 4 μL Transfection Reagens in 100 μL der SFM. Bis zu 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Dies kann skaliert werden, um ein master-Mix für alle Transfektionen durchgeführt werden zu machen.
   3. Verdünnen Sie bis 1 μg DsRNA oder total Plasmid DNA mit 100 μL der SFM für jedes gut zu transfiziert werden. Bis zu 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      Hinweis: Wir haben bereits festgestellt, dass eine Transfektion von 1 μg DsRNA/10⁵ LD652 Zellen ausreichend für > 80 % Zuschlag entweder viralen oder host Transkripte¹³, aber DsRNA Dosen benötigt für experimentelle geändert set-ups/Bedingungen müssen werden Sie empirisch bestimmt.
   4. Transfection Reagens und DsRNA/Plasmid-DNA-Verdünnungen mit einem Verhältnis von 1:1 zu kombinieren (z. B.100 μL der verdünnten DsRNA ist gemischt mit 100 μl verdünnter Transfection Reagens) und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   5. Währenddessen waschen Sie die Brunnen mit 1 mL/auch von SFM, und fügen Sie 500 μL der SFM in jede Vertiefung.
   6. Fügen Sie langsam die Transfection Reagens DsRNA (oder Plasmid DNA) Mischung tropfenweise in jede Vertiefung.
   7. Inkubieren Sie die Transfektion Reagenz mit den Zellen für 5 h.
      1. Für RNAi Experimente mit dem Zuschlag von Transkripten kodiert, indem ein coinfecting Virus (z.B.VACV), ersetzen Transfection Reagens nach der Inkubationszeit 5-h Transfektion mit Virus Inokulum mit VSV-LUC (mit oder ohne VACV oder ein weiterer coinfecting Virus) (Schritt 3). Anschließend ersetzen Sie das komplette Wachstum Medien 2 Hpi VSV-LUC mit Virus-Inokulum. LUC-Assays (Schritt 4) können dann auf extrahierten Lysates zu verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen, ob die Knockdown von coinfecting Virus Transkripte zu einem Verlust der VSV-LUC Rettung führt ausgeführt werden.
      2. Ersetzen Sie bei RNAi Experimente mit RNAi L. Dispar Transkripte die Transfektion Mischung mit kompletten Wachstumsmedien und Zuschlag für 24 h vor der Infektion mit VSV-LUC (Schritt 4) ergeben. LUC-Assays (Schritt 4) können dann auf extrahierten Lysates zu verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen, ob die Knockdown von L. Dispar Transkripte VSV-LUC Rettung fördert ausgeführt werden.
      3. Ersetzen Sie für Experimente mit Transfektionen Plasmid Expressionsvektoren auszudrücken Kandidat Immunmodulatoren die Transfection Reagens und Protein-Expression für 24 h vor der Infektion mit VSV-LUC (Schritt 4) ermöglichen. LUC-Assays (Schritt 4) können dann auf extrahierten Lysates zu verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen, ob die Expression von Kandidaten immunmodulatorische Proteinen fördert die VSV-LUC Rettung ausgeführt werden.
         Hinweis: Die Transfektion beschriebenen Bedingungen hier Transfektion Wirkungsgrade von 40 – 60 %¹³1 μg/Brunnen von Plasmid DNA-Ergebnis bei.

Ergebnisse

Als ein Beispiel für live Cell imaging-Anwendungen VSV Rettung auf VACV Coinfection überwachen, LD652 Zellen waren überzogen in einem 8-Brunnen gekammerten und dann Mock-infizierten oder infizierte VSV-DsRed (MOI = 1) in das Vorhandensein oder Fehlen der VACV-FL-GLP (MOI = 25). Da VSV-DsRed DsRed als freie Protein drückt und nicht, VSV Strukturproteinen (Abbildung 1A fixiert wird), ist es nur erkannt, nachdem VSV-Eintrag und Gen-Ausdruck initiiert. Alle Z...

Diskussion

Hier haben wir beschrieben, einfache Fluoreszenz und Lumineszenz-basierende Assays für die Bedingungen auf den Bildschirm, das VSV-Replikation in restriktiven Lepidoptera Zellkulturen zu retten. Die abortive Infektion des VSV in Lepidoptera Zellen erstellt ein ausgezeichnetes Signal-Rausch-Verhältnis beim VSV Genexpression zu prüfen. Zum Beispiel die LU-Signale in Lysaten aus einzelnen VSV-LUC Infektionen erkannt wurden ~ 1,000-fold höher als im Mock-infizierten Lysates, doch diese Signale nur etwa zweifach über ein...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture plates	CELLTREAT	229106
24-well tissue culture plates	CELLTREAT	229124
10 cm tissue culture dishes	Corning	C430167
Grace’s Insect Medium	Sigma	G8142
EX-CELL 420	Sigma	14420C
Fetal Bovine Serum - Optima	Atlanta Biologicals	S12450
Growth medium			1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1% antibiotic-antimycotic solution and 10% Fetal bovine serum
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×)	Sigma	A5955
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma	D8662
Serum Free Media (SFM)	Thermo Fisher	10902096
Cytosine arabinoside	Sigma	C1768
Transfection reagent	Thermo Fisher	10362100
Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Corning	25950CQC
Reporter lysis buffer 5x	Promega	E3971
Luciferase Assay Reagent	Promega	E1483
96-Well Microplates	Corning	3915
Mouse anti-FLAG antibody	Wako	014-22383
Rabbit anti-firefly luciferase antibody	Abcam	ab21176
Mouse anti-actin antibody	Sigma	A2066
Mouse anti-VSV M	N/A	N/A	Dr. John Connor (Boston University)
Mouse anti-VACV I3L	N/A	N/A	Dr. David Evans (University of Alberta)
8-well Chambered dish	Lab-Tek II	155409
Cell viability dye	Thermo Fisher	C12881
FLUOstar microplate reader	BMG Labtech	FLUOstar
Confocal microscope	Olympus	FV10i-LIV
Image analysis software	Olympus	v1.18	cellSens software
Eppendorf 5702 ventilated centrifuge	Eppendorf	22628102
Odyssey Fc Infrared Imaging System	Li-COR Biosciences	Odyssey Fc
LD652 cells	N/A	N/A	Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada)
BSC-40 cells	ATCC	CRL-2761
BHK cells	ATCC	CCL-10
HeLa cells	ATCC	CCL-2
BSC-1 cells	ATCC	CCL-26
in vitro transcription and purification kit	Thermo Fisher	AM1626
PCR purification kit	Qiagen	28104