JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לזהות immunomodulators 1) וירוס מקודד המקדמים arbovirus השכפול וגורמים מארח 2) האיקריוטים שמגבילות את שכפול arbovirus. שיטות אלה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות מאפשרים להשיג במהירות את המפרט כמותית של שכפול arbovirus ב מבחני פשטני עם יחס אות לרעש נמוך.

Abstract

התערבות RNA - ו גנום עריכה המבוססת על הקרנת פלטפורמות היה בשימוש נרחב כדי לזהות גורמים התא המארח להגביל את וירוס שכפול. עם זאת, את המסכים הבאים נערכות בדרך כלל בתאים באופן טבעי מתירניות לגורם המחלה ויראלי שנבחנה. לכן, השכפול חזקים של וירוסים בתנאי בקרה עלולה להגביל את הטווח הדינמי של המסכים הבאים. יתר על כן, המסכים הבאים עשויים להיות מסוגל לזהות בקלות מסלולים ההגנה התאית שמגבילות את שכפול הוירוס אם הווירוס הוא סטוש למחשב המארח ובעל יכולת של המאבק הגנות אנטי-ויראלי. במאמר זה, אנו מתארים פרדיגמה חדשה עבור חקר וירוס-פונדקאי אינטראקציות באמצעות מסכי מרכז על זיהומים שנכשל באופן טבעי על ידי arboviruses כגון vesicular stomatitis וירוס (VSV). למרות יכולת VSV לשכפל במגוון רחב של חרקים dipteran ומארח יונקים, VSV עובר זיהום, הכניסה לאחר שנכשל במגוון של שורות תאים שמקורם חרקים lepidopteran, כגון העש צועני (Lymantria dispar). עם זאת, זיהומים VSV שנכשל אלה יכולים להיות "לחלץ" כאשר המארח תא הגנות אנטי ויראליים הם בסכנה. נתאר כמה זנים VSV קידוד גנים כתב נוח ולא מגבילים ל' dispar שורות תאים ניתן לזווג מסכי הגדרת לזהות מארח גורמים מעורבים arbovirus ההגבלה. יתר על כן, אנו גם מראים את התועלת של כלים אלה ההקרנה הזיהוי של גורמים לשווק מקודד להציל VSV שכפול במהלך coinfection, או דרך ביטוי חוץ רחמי, כולל אלה מקודד על ידי וירוסים יונקים. ההגבלה הטבעי של שכפול VSV בתאים dispar ל' מספק יחס אות לרעש גבוה בעת הקרנת עבור התנאים המקדמים הצלה VSV, ובכך מאפשר שימוש פשטני הפריה חוץ גופית - קרינה פלואורסצנטית מבוססי מבחני לפקח השינויים VSV שכפול. מתודולוגיות אלו הם בעלי ערך להבנת יחסי הגומלין בין המארח תגובות אנטי ויראלי התחמקות המערכת החיסונית גורמים.

Introduction

היכולת של וירוס לשכפל באופן פרודוקטיבי שורה מסוימת כפוף באופן חלקי הזמינות של התא המארח גורמים התומכים נגיפי כניסה של שכפול1. הטווח וירוס-המארח יכול גם יכתיב את הקיבולת של וירוס מונה הגנות אנטי ויראליים הסלולר הפוגעים אחרת שכפול ויראלי2,3. זה התוצאה של אינטראקציות אלה מורכבים וירוס-מארח זה בסופו של דבר להחליט אם וירוס יהיה מסוגל להשלים את מחזור חייו מארח מסוים. לאור ההשלכות החולני שעשויות להיות עבור המארח אם שכפול ויראלי מתפתח, זה קריטי לפתח אסטרטגיות ניסיוני כדי לקדם את ההבנה שלנו של אינטראקציות וירוס מפתח-מארח זה יכול להטות את הכף בין שנכשל ופורה זיהומים. שחקרתי את התכונות מולקולרית של וירוס-פונדקאי הגומלין יהיה אינסטרומנטלי הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות אנטי ויראליים חדשה ואלטרנטיבית.

עם כניסתו של RNA הפרעה (RNAi)4,5 , כלים לעריכת הגנום (למשל., CRISPR-Cas9, אבץ אצבע nucleases, TALENs)6,7, זה הפך ריאלי השפעול לשנות הביטוי של גורמים הסלולר על הגנום כולו מאזני ולחקור את ההשפעה של שינויים אלה על שכפול הוירוס. ואכן, רבים RNAi, מסכי הגנום-עריכת מבוססי נערכו סוגי תאים הגעה והמארח חוליות זה יש חשפה היבטים חדשים של וירוס-פונדקאי אינטראקציות8,9,10, 11 , 12. המסכים הבאים בדרך כלל מעסיקים וירוסים קידוד כתבים, כמו גחלילית לוציפראז (לוק) או חלבונים פלורסנט (למשל., ה-GFP, DsRed), אשר מספקים אמצעי נוח באופן כמותי להערכת ביטוי גנים ויראליים כמו הבדיקה שכפול ויראלי9,12. אסטרטגיה זו מאפשרת לחוקרים לזהות גורמים מארח או לקדם או להרגיז שכפול ויראלי, כפי שמעידים עליות או ירידות, בהתאמה, ב כתב ויראלי אותות9,12. עם זאת, ברוב המכריע של המקרים, את המסכים הבאים נערכו באמצעות וירוסים מותאמים היטב סוג התא המארח שבו הם נמצאים נחקר. אסטרטגיה זו יכול להיות חשוב להבנת היחסים coevolutionary בין פתוגנים ויראליים מארחיהם טבעי, זה להוות יסוד חששות לגבי השימוש בהם במסגרת חשיפת מארח גורמים אנטי-ויראלי. במקרים אלה, שיפור בוירוס כתב אות RNAi נוקאאוט הוא להיות חיפש, או איון של הסלולר גורם בדרך כלל פוגעת שכפול ויראלי. ראשית, אם וירוס כבר אפשרות לשכפל robustly בתא המארח נבדק בתנאים שליטה, הטווח הדינמי של המסך (כלומר, את היכולת להבחין בין הרקע לבין אותות משופרת כתב ויראלי) עלולה להיות מוגבלת. שנית, בעיה זו מורכב עוד יותר על ידי המצבים בהם הנגיף הוא סטוש לתא המארח ויעיל -המאבק מארח ההגנה מסלולים המיועדים במסך.

בשל החשש לעיל לגבי האינטראקציה וירוס המסורתי-מארח הקרנות שיטות, פיתחנו פרדיגמה חדשה ללמוד אינטראקציות וירוס-פונדקאי לנצל arbovirus שנכשל באופן טבעי זיהומים בתאי חרקים lepidopteran. אסטרטגיה זו נובעת התבוננות arbovirus למד היטב האדם, VSV, עובר זיהום שנכשל בתאים שמקורם עש הצועני (ל' dispar)13. VSV מועברת באופן טבעי על ידי חרקים dipteran (קרי, זבובי חול) בתרבית של המארחים, הוכח בניסוי כדי להדביק את מגוון רחב של חסרי חוליות, מארחים חוליות ב תא תרבות, אין ויוו14. הגנום RNA חד-גדילי של שלילי-סנס 11-kb של VSV מקודד mRNAs subgenomic חמש אחד המתורגמים לתוך החלבונים המרכיבים את מעטפת virion. עם זאת, מערכות גנטיות הפוכה VSV אפשרו ליצירת זנים שכפול-המוסמכת קידוד לוק או חלבונים פלורסנט, בנוסף חמש טבעי VSV ג'ין מוצרים15,16,17. כי לא משולבים חלבונים אלה כתב virion VSV, הם מספקים readout נוח של ביטוי גנים VSV המתרחשת הפוסט פוסט. באמצעות זנים VSV קידוד GFP או לוק, אנחנו בעבר הראו כי ביטוי גנים VSV היא הוגבלה בצורה קשה על כניסתם של תאים LD652, כי VSV titers לא להגדיל על ידי 72 שעות לאחר הפגיעה (מדד מחירי הבתים. של). לעומת זאת, coinfection של תאים LD652 עם VSV, את בתרבית של poxvirus, וירוס vaccinia (VACV), מוביל לוגריתמי מגביר התבטאות גנים VSV והן titers ובשלב זה הזמן. VACV עובר מוקדם ביטוי גנים, שכפול ה-DNA, ביטוי גנים מאוחר LD652 תא זיהומים, אבל בסופו של דבר שנכשל בשל virion לא שלם מורפוגנזה18מחזור שכפול VACV. הגנום גדולות של DNA ~ 192 kb של VACV מקודד > 200 חלבונים, שרבים מהם להציג מאפייני immunomodulatory לקדם שכפול ויראלי דרך הדיכוי של תגובות חיסוניות מארח19. לכן, שיערנו כי "חילוץ" שכפול VSV בתאים LD652 על ידי VACV coinfection היה ככל הנראה מתווכת על-ידי immunomodulators VACV זה עכבות תגובות ל' dispar בדרך כלל הגבלת VSV שכפול. כדי לתמוך בזה, הטיפול של תאים LD652 עם מארח ה-RNA פולימראז II המדכא ואקטינומיצין D גם מציל שכפול VSV בתאים LD652, המציין כי התגובות תלויי-תמלול מארח לחסום VSV שכפול פוסט-הפוסט13.

התצפיות הנ ל מציע כי הטבע מגבילות באופן טבעי של תאי LD652 לזיהום VSV עשוי לספק רקע נמוך יחסית בעת הקרנת עבור התנאים המשפרים את הכתב מקודד VSV אותות (כלומר, כאלה לעכב את המארח הגנות אנטי-ויראלי). כאן, אנו מספקים שיטות באמצעות קרינה פלואורסצנטית או מבוסס-לוק מבחני המסך עבור תנאי זה להקל על הגבלת VSV בתאים lepidopteran. ראשית, אנו מראים כמה מבחני אלה ניתן להשתמש כדי לזהות גורמים לשווק מקודד immunomodulatory לשבור את ההגבלה VSV במהלך ניסויים או coinfection, או דרך ביטוי חוץ רחמי של גורמים נגיפיים המועמד. כדוגמה, אנחנו מדגימים איך היינו אלה טכניקות ההקרנה כדי לזהות חלבונים A51R מקודד poxvirus כמשפחה חדשה של גורמים immunomodulatory להציל את שכפול VSV בהיעדרו של גורמים אחרים poxvirus13. שנית, אנחנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש RNAi הקרנת מגבילות VSV-LD652 תא זיהומים ישירות לזהות מארח האיקריוטים הגורמים המעורבים הגבלת arbovirus13.

Protocol

1. כללי Lymantria dispar (LD652) תא והתרבות וירוס

  1. תא LD652 culturing יופיצ
    1. לתרבות dispar ל'-נגזר LD652 תאים, לשמור על טפט של תאים במדיום הגידול (טבלה של חומרים) מודגרות ב 27 ° C תחת אווירה רגילה. לשמור על התאים במנות רקמות-תרבות-טיפול 10 ס מ, המעבר את התאים בהגיעם 80% confluency.
    2. צלחת, מכך תאים חסיד LD652 מהצלחת מאת pipetting התקשורת שוב ושוב על גבי חד שכבתי (תאים אלה אינן דורשות trypsinization מכך) של לדלל את הדגימה בתקשורת צמיחה לדחיסות משוער של עונה 1 פרק 105 תאים/מ ל.... פיפטה 1 מ"ל של תרבות/טוב מדוללת של צלחת 24-. טוב. זרע מינימום של שלושה שכפל בארות/טיפול סוג עבור כל נקודת זמן (לכל היותר שמונה טיפולים/צלחת).
    3. מאפשרים לתאים להתפשר על מינימום של 1 h.
  2. הכנת וירוס vaccinia
    1. כדי להכין את המניות של VACV, להגביר את הנגיף הלה תאים20 או הקוף הירוק אפריקאי כליות תאים (BSC-1 או BSC-40 תאים)20,21,22.
      הערה: VACV זן Western Reserve (VACV-WR) עובד גם את מבחני המתוארים כאן.
    2. Titrate VACV זן באמצעות שלט וזמינותו BSC-1 או BSC-40 תאים20,22.
      הערה: כל הצביעו על ריבוי VACV של זיהום (MOI) המתוארים כאן עבור LD652 תא זיהומים מבוססים על titers המתקבל מבחני פלאק BSC-40.
  3. Vesicular stomatitis וירוס הכנה
    1. כדי להכין VSV מניות, להגביר את הוירוס BHK תאים23.
    2. Titrate VSV מאת פלאק assay BSC-40 או BHK תא monolayers13,23.
      הערה: כל VSV MOIs המתוארים כאן עבור LD652 תא זיהומים מבוססים על titers המתקבל מבחני פלאק BSC-40.

2. קרינה פלואורסצנטית מבוססי VSV הצלה Assay באמצעות ושיתוף הידבקות הדמיה לחיות תאים

  1. Seeding, זיהום של תאים LD652
    1. צלחת 40,000 LD652 תאים/טוב של חדר 8-. טוב.
    2. לשימוש מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית הדמיה לחיות תאים, זנים VSV קידוד חלבונים פלורסנט. הניסויים שהוצגו כאן להשתמש VSV-DsRed17, זן VSV רקומביננטי המבטאת חלבון DsRed חינם זה לא דבוקה כל חלבון VSV אחרים.
      הערה: VSV זיהום של תאים LD652 הוא לא cytopathic על ידי מדד מחירי הבתים של 96 ואינו, לפיכך, המוות של תאים גורם מבלבלים בעת הערכת VSV שכפול בתוך פרק הזמן.
    3. הכינו VSV-DsRed ואת VACV-FL-GFP בתקשורת ללא סרום (SFM; טבלה של חומרים) ב MOI 1, 25, בהתאמה.
      הערה: VACV-FL-GFP הוא זן VACV רקומביננטי שיבטא שילוב בין לוק ו- GFP24. שימוש MOI של 25 ומעלה עבור זנים VACV מבטיח כי כל התאים LD652 הם נגועים13. אם משתמש וירוס coinfecting שונים, למשרד הפנים יהיה חייב להיקבע מדעית על ידי המשתמש. כל טיפול דלקת יש להגדיר בבארות כפולים וכוללים הנגועים ואימץ טיפולים אשר מתווסף רק SFM התאים.
    4. דגירה התאים 0.2 מ של inoculum עבור 2 h ב-27 º c
    5. לשטוף את התאים עם 0.5 mL/טוב של צמיחה מדיה.
    6. דגירה התאים 25 μM של התא הכדאיות צבע (טבלה של חומרים) בתקשורת צמיחה למשך 45 דקות ב-27 º c
    7. וארוקן את המדיה ותרחץ הבארות 1 x 0.5 mL/היטב כדי להסיר צבע עודף.
    8. לשמור על התאים ב 0.3 mL/טוב של התקשורת צמיחה.
  2. חיה לכידת התמונה תא
    1. הפעלת מיקרוסקופ קונפוקלי 30 דקות מראש וטען צלחת הקאמרית 8-. טוב.
      הערה: LD652 תאים יכולים לדימות בטמפרטורת החדר הנע בין 20-25 ° C, אך תנאים אופטימליים, הטמפרטורה של החדר צריך להיות מותאם ל 27 מעלות צלזיוס.
    2. כוונן את הגדרות המתאימים עירור/פליטה עבור כל חלבון פלואורסצנטי סמן לדימות, וכן את הגדרות התמונה של ניגודיות שלב.
    3. התאם את עוצמת הלייזר לכל ערוץ.
      הערה: זה עשוי לדרוש הפעלת ניסוי הפיילוט כדי לקבוע את טווח עוצמות האות פלורסנט נצפתה לאורך זמן כדי לשמש הניסוי הסופי.
    4. באמצעות המטרה X 10, ללכוד תמונות חדות, זריחה של שלב של כל h 1 – 5 טוב בכל משך הזיהום עד נקודת הזמן הרצויים (למשל., מדד מחירי הבתים של 48-72).
      הערה: חשוב ללכוד את המבט של שדות מרובים כל היטב כדי לאמוד במדויק את שיעור הזיהום לאורך כל התרבות.
  3. ניתוח תמונות
    1. בתוכנת ניתוח תמונה לניתוח תמונה אוטומטי של הערוצים פלורסנט (למשל., 405 ננומטר, 488 ננומטר, 568 ננומטר).
    2. כדי לחשב את אחוז התאים שהודבקו, מחלקים את המספר הכולל של תאים פלורסצנט המציין זיהום VSV (למשל., תאים DsRed-חיובית עבור זיהומים VSV-DsRed) על ידי המספר הכולל של התאים קיימא המתויגים באמצעות תא הכדאיות צבע עבור כל שדה ראייה על-פני כל הטיפולים.

3. גנרל זיהום ויראלי פרוטוקול מבוסס-הפריה חוץ גופית VSV מבחני הצלה בתאים LD652

  1. הכנת inoculum
    1. 30 דקות לפני הדלקת, להפשיר את המניות VSV-לוק16 (חלבון VSV המתח הזה מבטא חינם גחלילית לוציפראז חלבון לא דבוקה כל חלבון VSV אחרים). אם assaying לחילוץ VSV-לוק במהלך VACV coinfection, גם להפשיר את הוירוס VACV-WR על קרח.
      הערה: וירוסים אחרים (מלבד VACV-WR) עשוי להציל VSV-לוק במהלך coinfection, אבל זה יהיה חייב להיקבע מדעית על ידי כל משתמש.
    2. להכין את inoculum על ידי דילול VSV-לוק ב נוכחות או היעדרות של VACV-WR לתוך SFM כזה MOI של 10 ו- 25, בהתאמה, מושגת בעת הוספת נפח inoculum הכולל של 0.2 מ"ל/טוב.
  2. זיהום של תאים
    1. תשאף מדיה LD652 בוגרת בזהירות כדי שלא להפריע למטופלים את טפט, לחסן 0.2 מ של וירוס/טוב. הפעם מוגדר מדד מחירי הבתים של 0. להוסיף SFM סטרילי בארות נוספות כדי לשמש "נגועה מעושה" טיפולים שליטה שלילי.
    2. דגירה התאים inoculum עבור 2 h ב-27 º c
    3. ב. מדד מחירי הבתים, של 2 להסיר את inoculum על ידי שאיפה להחליף 1 מ"ל/טוב LD652 הצמיחה מדיה.
    4. לאפשר את הזיהום להמשיך מדד מחירי הבתים של 24-72.

4. לוציפראז Assay

  1. הכנת תא lysates
    1. בזהירות וארוקן את תגובת שיקוע, להוסיף 1 מ"ל של תמיסת פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) / טוב.
    2. באמצעות הבוכנה של מזרק 1 מ"ל, לגרד את התאים לתוך DPBS.
    3. להעביר את התאים, צינור microcentrifuge ו צנטריפוגה ב 400 x g למשך 20 דקות ב 4 º C.
    4. . בינתיים, מכינים לדילול 1 x 5 x כתב פירוק מאגר (RLB) ב- H סטרילי2O.
    5. בעקבות צנטריפוגה, וארוקן את DPBS מבלי להפריע בגדר התא.
    6. Resuspend כל גלולה ב 150 µL 1 x RLB.
    7. ההקפאה-להפשיר הדגימות 1 x באמצעות דגירה של 5-מין במקפיא-80 ° C ואחריו הפשרה מהירה בתוך אמבט מים בטמפרטורת החדר. לאחסן את lysates ב-80 מעלות צלזיוס עד מוכן לנתח.
  2. לוציפראז assay
    1. להפשיר את lysates על הקרח.
    2. פיפטה 20 μL של lysate לבאר של microplate 96-ובכן מוצק שחור או לבן.
    3. להוסיף 100 μL של ריאגנט assay לוציפראז מכל קידוח.
    4. מיד למדוד את עוצמת האור באמצעות של luminometer (ההגדרות המתאימות luminometers ספציפי יהיה חייב להיקבע מדעית על ידי המשתמש).
  3. ניתוח assay לוציפראז
    1. לנרמל LU אותות הטיפול כדי קריאות LU המתקבל שליטה טיפולים (נציג תוצאות). אחרי לפחות שלושה ניסיונות עצמאית בוצעו, ניתן לנתח הממוצע ש-LU המתקבל בכל קבוצה טיפול/בקרה על ידי בדיקות סטטיסטיות המתאים.

5. Immunoblot

  1. השתמש lysates שחולצו עבור מבחני לוק עבור מרחביות-דף ו- immunoblotting הבאים, באמצעות ריאגנטים המתאימים ומכשור.

6. כייל של VSV מתרבויות תא LD652

  1. צלחת LD652 תאים על פי שלב 1.1.
  2. ויראלי להדביק את התאים לפי שלב 3.
  3. בנקודות הזמן הרצויים, לאסוף את supernatants לתוך צינורות microcentrifuge סטרילי.
  4. גלולה התאים באמצעות x 1000 g 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את supernatants צינורות חדשים.
  5. לאחסן את supernatants ב-80 מעלות צלזיוס או להמשיך טיטור מאת פלאק assay בתאי BSC-40.
    הערה: אם titrating VSV מתרבויות תא LD652 שהכילו VACV, רצוי להוסיף μg/mL 100 ציטוזין arabinoside (AraC) התקשורת תרבות BSC-40 בתוך מדד מחירי הבתים של 2, כדי למנוע שיורית חלקיקים VACV ויוצרים הפלאק BSC-40 monolayers13. AraC הוא מעכב נגיפי DNA פולימראז חוסם שכפול ה-DNA VACV25 , אך אינה משפיעה על VSV שכפול.

7. וריאציות של VSV מבוסס-הפריה חוץ גופית להציל את מבחני בתאים LD652: RNAi וניסויים תרביות תאים פלסמיד

  1. הכנה של dsRNA מציאה RNAi בתיווך נוקאאוט של נגיפי או מארחים תעתיקים
    1. עיצוב גנים ספציפיים תחל זנב בקצה 5' עם הרצף יזם T7 (TAATACGACTCACTATAGGG) כדי להתמקד גם הווירוס coinfecting (למשל, VACV) או ל' dispar תמלילים mRNA של ריבית. אלה תחל צריך לייצר מוצר ה-PCR של 400 – 600 bp נוקאאוט מציאה RNAi בתיווך יעיל. לראות את מארס. et al. 13 פריימר רצפים המשמש להלן תמונות ציפורים VACV או ל' dispar תעתיקים ידי RNAi בתיווך dsRNA בתאים LD652.
      הערה: ניתן לזהות תעתיקים של mRNA ל' dispar לאור dispar ל' transcriptome מסדי נתונים26,27,28.
    2. ליצור של ה-DNA תבנית ויה RT-PCR (cDNA סינתזה: מחזור 1 של 50 מעלות למשך 30 דקות; PCR: 40 מחזורי 94 ° C 15 s, 50 ° C ל 30 s, ו- 68 מעלות צלזיוס במשך 45 s כל).
    3. לטהר את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR.
    4. שימוש במוצר ה-PCR מטוהרים כתבנית, חוץ גופית בתוך לתמלל ולטהר dsRNA באמצעות במבחנה שעתוק טיהור וניקוי ערכת.
  2. תרביות תאים של dsRNA או פלסמיד DNA לתאים LD652
    1. זרע עונה 1 פרק 105 תאים/טוב של צלחת 24-ובכן ולתת את התאים להתפשר על פחות שעה.
    2. עבור כל טוב להיות transfected, לדלל μL 4 של תרביות תאים ריאגנט לתוך μL 100 של SFM. תקופת דגירה של עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. זה וניתן לשנותם כדי להפוך את תערובת הבסיס עבור כל transfections שיש לבצע.
    3. לדלל עד μg 1 של dsRNA או הכולל פלסמיד DNA עם 100 μL של SFM במשך כל כדי להיות transfected. תקופת דגירה של עד 15 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: בעבר מצאנו כי תרביות תאים של μg 1 של dsRNA/105 LD652 תאים מספיקה עבור > 80% נוקאאוט של או ויראלי או מארחים תעתיקים13, אבל dsRNA במינונים הדרושים עבור ששינה ניסיוני set-ups/תנאים יצטרך . להיות נחוש מדעית.
    4. משלבים תקנים ריאגנט של dsRNA/פלסמיד DNA דילולים עם יחס של 1:1 (למשל100 μL של dsRNA מדולל מעורבב עם 100 μL של ריאגנט תקנים מדולל) דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. בינתיים, לשטוף את הבארות 1 מ"ל/טוב של SFM, ולאחר מכן להוסיף 500 μL של SFM מכל קידוח.
    6. לאט לאט להוסיף תקנים ריאגנט dsRNA (או פלסמיד ה-DNA) תערובת dropwise כל טוב.
    7. דגירה הכימית תרביות תאים עם התאים עבור 5 שעות.
      1. עבור RNAi בניסויים המערבים את נוקאאוט של הפרוטוקולים מקודד על ידי וירוס coinfecting (למשל, VACV), להחליף הכימית תרביות תאים לאחר תקופת הדגירה 5-h תקנים עם וירוס inoculum המכיל VSV-לוק (עם או בלי VACV או וירוס coinfecting אחר) (שלב 3). לאחר מכן, להחליף את inoculum וירוס המכיל VSV-לוק עם צמיחה מלאה מדיה 2 מדד מחירי הבתים. ואז ניתן לבצע מבחני לוק (שלב 4) ב- lysates שחולצו בנקודות זמן שונות כדי לקבוע אם נוקאאוט של coinfecting וירוס תעתיקים מוביל לאובדן של חילוץ VSV-לוק.
      2. לניסויים RNAi מעורבים RNAi של הפרוטוקולים ל' dispar , החלף את התמהיל תרביות תאים צמיחה מלאה מדיה ולאפשר נוקאאוט ל ensue עבור 24 שעןת לפני זיהום עם VSV-לוק (שלב 4). מבחני לוק (שלב 4) ואז ניתן לבצע ב- lysates שחולצו בנקודות זמן שונות כדי לקבוע אם נוקאאוט של הפרוטוקולים ל' dispar מקדם VSV-לוק הצלה.
      3. לניסויים מעורבים transfections של וקטורים ביטוי פלסמיד מביע המועמד immunomodulators, להחליף הכימית תרביות תאים, לאפשר ביטוי חלבון 24 שעןת לפני הזיהום עם VSV-לוק (שלב 4). מבחני לוק (שלב 4) ואז ניתן לבצע ב- lysates שחולצו בנקודות זמן שונות כדי לקבוע אם הביטוי של חלבונים immunomodulatory מועמד מקדמת VSV-לוק הצלה.
        הערה: התנאים תרביות תאים המתוארים כאן שימוש μg/טוב 1 של תוצאות הדנ א פלסמיד תרביות תאים היעילות של 40%-60%13.

תוצאות

כדוגמה של יישומי הדמיה לחיות תאים כדי לפקח VSV הצלה על VACV coinfection, LD652 התאים היו מצופה בצלחת chambered 8-ובכן ואז הנגועים מעושה או נגוע VSV-DsRed (MOI = 1), נוכחות או היעדרות של VACV-FL-GFP (MOI = 25). מאחר VSV-DsRed מבטא DsRed כמו חלבון חינם לא מותך VSV מבניים חלבונים (איור 1 א'), שהוא מתגלה רק ל...

Discussion

כאן תארנו מבחני פשוטה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות על המסך עבור תנאי זה להציל את שכפול VSV בתרבויות תא lepidopteran מגבילים. זיהום שנכשל של VSV בתאים lepidopteran יוצר יחס אות לרעש מעולה כאשר assaying על ביטוי גנים VSV. למשל, האותות LU זוהה lysates מדלקות VSV-לוק יחיד היו ~ 1,000-fold גבוה בהרבה lysates נגועה מעושה, אך א...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

ה2 נתמכה על ידי מימון מתוכנית חוקרים מאוניברסיטת טקסס הדרומית-מערבית למרכז הרפואי של מחונן. המחברים תודה מייקל Whitt (המרכז למדעי הבריאות אוניברסיטת טנסי) שון ווילן (הספר לרפואה של הרווארד) למתן VSV-DsRed ו- VSV-לוק. המחברים מודים גם גארי Luker (בית הספר לרפואה באוניברסיטת מישיגן) על מתנה נחמדה של המתח VACV-FL-GFP.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6-well tissue culture platesCELLTREAT229106
24-well tissue culture platesCELLTREAT229124
10 cm tissue culture dishesCorningC430167
Grace’s Insect MediumSigmaG8142
EX-CELL 420Sigma14420C
Fetal Bovine Serum - OptimaAtlanta BiologicalsS12450
Growth medium1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1% antibiotic-antimycotic solution and 10% Fetal bovine serum
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×)SigmaA5955
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)SigmaD8662
Serum Free Media (SFM)Thermo Fisher10902096
Cytosine arabinosideSigmaC1768
Transfection reagentThermo Fisher10362100
Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide)Corning25950CQC
Reporter lysis buffer 5xPromegaE3971
Luciferase Assay ReagentPromegaE1483
96-Well MicroplatesCorning3915
Mouse anti-FLAG antibodyWako014-22383
Rabbit anti-firefly luciferase antibodyAbcamab21176
Mouse anti-actin antibodySigmaA2066
Mouse anti-VSV MN/AN/ADr. John Connor (Boston University)
Mouse anti-VACV I3LN/AN/ADr. David Evans (University of Alberta)
8-well Chambered dishLab-Tek II155409
Cell viability dyeThermo FisherC12881
FLUOstar microplate readerBMG LabtechFLUOstar
Confocal microscopeOlympusFV10i-LIV
Image analysis softwareOlympusv1.18cellSens software
Eppendorf 5702 ventilated centrifugeEppendorf22628102
Odyssey Fc Infrared Imaging SystemLi-COR BiosciencesOdyssey Fc
LD652 cellsN/AN/ADr. Basil Arif (Natural Resources Canada)
BSC-40 cellsATCCCRL-2761
BHK cellsATCCCCL-10
HeLa cellsATCCCCL-2
BSC-1 cellsATCCCCL-26
in vitro transcription and purification kitThermo FisherAM1626
PCR purification kitQiagen28104

References

  1. Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. Viral tropism. Frontiers in Microbiology. 3, 281 (2012).
  2. Werden, S. J., McFadden, G. The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1784 (1), 228-237 (2008).
  3. McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. M., Bartee, E. Cytokine determinants of viral tropism. Nature Reviews: Immunology. 9 (9), 645-655 (2009).
  4. Silva, J. M., et al. Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nature Genetics. 37 (11), 1281-1288 (2005).
  5. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  6. Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13 (6), 336-344 (2015).
  7. Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nature Reviews: Drug Discovery. 16 (6), 387-399 (2017).
  8. Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454 (7206), 890-893 (2008).
  9. Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Experimental Biology and Medicine. 236 (8), 962-967 (2011).
  10. Marceau, C. D., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
  11. Savidis, G., et al. Identification of Zika Virus and Dengue Virus Dependency Factors using Functional Genomics. Cell Reports. 16 (1), 232-246 (2016).
  12. Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Current Opinion in Virology. 2 (6), 784-792 (2012).
  13. Gammon, D. B., et al. A single vertebrate DNA virus protein disarms invertebrate immunity to RNA virus infection. Elife. 3, (2014).
  14. Letchworth, G. J., Rodriguez, L. L., Del cbarrera, ., J, Vesicular stomatitis. Veterinary Journal. 157 (3), 239-260 (1999).
  15. Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (18), 8388-8392 (1995).
  16. Cureton, D. K., Massol, R. H., Saffarian, S., Kirchhausen, T. L., Whelan, S. P. Vesicular stomatitis virus enters cells through vesicles incompletely coated with clathrin that depend upon actin for internalization. PLoS Pathogens. 5 (4), e1000394 (2009).
  17. Duntsch, C. D., et al. Recombinant vesicular stomatitis virus vectors as oncolytic agents in the treatment of high-grade gliomas in an organotypic brain tissue slice-glioma coculture model. Journal of Neurosurgery. 100 (6), 1049-1059 (2004).
  18. Li, Y., Yuan, S., Moyer, R. W. The non-permissive infection of insect (gypsy moth) LD-652 cells by Vaccinia virus. Virology. 248 (1), 74-82 (1998).
  19. Seet, B. T., et al. Poxviruses and immune evasion. Annual Review of Immunology. 21, 377-423 (2003).
  20. Cotter, C. A., Earl, P. L., Wyatt, L. S., Moss, B. Preparation of Cell Cultures and Vaccinia Virus Stocks. Current Protocols in Microbiology. 39, 11-18 (2015).
  21. Andrei, G., et al. Cidofovir resistance in vaccinia virus is linked to diminished virulence in mice. Journal of Virology. 80 (19), 9391-9401 (2006).
  22. Dascher, C., VanSlyke, J. K., Thomas, L., Balch, W. E., Thomas, G. Preparation of recombinant vaccinia virus for expression of small GTPases. Methods in Enzymology. , 174-188 (1995).
  23. Martin, A., Rex, E. A., Ishidate, T., Lin, R., Gammon, D. B. Infection of Caenorhabditis elegans with Vesicular Stomatitis Virus via Microinjection. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
  24. Luker, K. E., Hutchens, M., Schultz, T., Pekosz, A., Luker, G. D. Bioluminescence imaging of vaccinia virus: effects of interferon on viral replication and spread. Virology. 341 (2), 284-300 (2005).
  25. Rozelle, D. K., Filone, C. M., Dower, K., Connor, J. H. Vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression. Journal of Visualizes Experiments. (87), e51522 (2014).
  26. Cao, C., et al. Characterization of the transcriptome of the Asian gypsy moth Lymantria dispar identifies numerous transcripts associated with insecticide resistance. Pesticide Biochemistry and Physiology. 119, 54-61 (2015).
  27. Sparks, M. E., Blackburn, M. B., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Lymantria dispar (gypsy moth) larval midgut in response to infection by Bacillus thuringiensis. PloS One. 8 (5), e61190 (2013).
  28. Sparks, M. E., Gundersen-Rindal, D. E. The Lymantria dispar IPLB-Ld652Y cell line transcriptome comprises diverse virus-associated transcripts. Viruses. 3 (11), 2339-2350 (2011).
  29. Lin, G., Li, G., Granados, R. R., Blissard, G. W. Stable cell lines expressing baculovirus P35: resistance to apoptosis and nutrient stress, and increased glycoprotein secretion. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 37 (5), 293-302 (2001).
  30. Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
  31. Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
  32. Paixao, E. S., Teixeira, M. G., Rodrigues, L. C. Zika, chikungunya and dengue: the causes and threats of new and re-emerging arboviral diseases. BMJ Global Health. 3, (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

139Arbovirusvesicular stomatitisvacciniapoxviruslepidopteranLymantria dispar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved