JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

إضعاف الببتيدات سيستين الغنية في هياكل ثلاثية الأبعاد مميزة اعتماداً على اتصال ثنائي كبريتيد. مطلوب توليف المستهدفة من ايزومرات ثنائي كبريتيد الفردية عند أكسدة العازلة لا يؤدي إلى اتصال ثنائي كبريتيد المرجوة. ويتناول البروتوكول التوليف انتقائية من الببتيدات 3-ثنائي كبريتيد المستعبدين والتحليل الهيكلي استخدام دراسات الرنين المغناطيسي النووي و MS/MS.

Abstract

عادة ما تتأثر الببتيدات مع عدد كبير من سيستينيس فيما يتعلق بهيكل ثلاثي الأبعاد باتصال ثنائي كبريتيد بهم. أنه هكذا هو بالغ الأهمية لتجنب تشكيل السندات ثنائي كبريتيد غير مرغوب فيها أثناء التوليف الببتيد، لأن ذلك قد يؤدي في بنية ببتيد مختلفة تماما، ونتيجة لذلك تعديل بيواكتيفيتي. غير الصحيح تشكيل السندات ثنائي كبريتيد متعددة في ببتيد يصعب الحصول عليها باستخدام أساليب ذاتية قابلة للطي القياسية مثل بروتوكولات أكسدة العازلة التقليدية، لأنه يمكن أن تشكل عدة ثنائي كبريتيد connectivities. ويمثل هذا البروتوكول استراتيجية متقدمة اللازمة لتركيب الببتيدات سد ثنائي كبريتيد المتعددة التي لا يمكن تجميعها عن طريق الأكسدة العازلة عالية الجودة والكمية المستهدفة. الدراسة يوضح تطبيق استراتيجية مجموعة حماية متميزة لتوليف جميع ايزومرات الببتيد ممكن 3-ثنائي كبريتيد المستعبدين بييا μ-كونوتوكسين بطريقة هادفة. الببتيدات يعدها توليف الببتيد المرحلة الصلبة المستندة إلى معتدلاً باستخدام استراتيجية مجموعة حماية لتشكيل ثنائي كبريتيد تعريف السندات. محمية أزواج كل منها من سيستينيس مع تريتيل (حزب تاي راك تاي)، أسيتاميدوميثيل (الأسبستوس) و ثالثي-بوتيل (تيبو) حماية المجموعات للتأكد من أن ديبروتيكتيد ومرتبطة فقط حاجة سيستينيس خلال كل خطوة الأكسدة. بالإضافة إلى توليف المستهدفة، يستخدم مزيجاً من عدة أساليب تحليلية لتوضيح الصحيح للطي وإنشاء هياكل الببتيد المرجوة. المقارنة بين الايزومرات المستعبدين من ثنائي كبريتيد 3 مختلفة تشير إلى أهمية تحديد دقيق والمعرفة باتصال ثنائي كبريتيد لحساب هيكل ثلاثي الأبعاد وتفسير البيولوجية النشاط ايزومرات الببتيد. ويشمل وصف تحليلي استجلاء هذه السندات ثنائي كبريتيد الدقيق عن طريق تحليل الطيف الكتلي (MS/MS) جنبا إلى جنب التي تتم مع مشتقات جزئيا انخفاض ويؤلكل أيسومر الببتيد سليمة تنتجها بروتوكولا تكييف. وعلاوة على ذلك، يتم تحديد هياكل الببتيد استخدام 2D الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) التجارب والمعارف التي تم الحصول عليها من تحليل MS/MS.

Introduction

استخدام الببتيدات النشطة بيولوجيا في البحوث الصيدلانية والتنمية هو تقديراً كبيرا، لأنها تمثل مركبات قوية وانتقائية للغاية لأهداف بيولوجية محددة1. لما بيواكتيفيتي، هيكل ثلاثي الأبعاد غير ذات أهمية كبيرة من أجل تنفيذ الهيكل والنشاط العلاقة دراسات2،،من34. وبصرف النظر عن تسلسل الأحماض الأمينية الأساسية التي تؤثر على تكيف عموما، استقرار السندات ثنائي كبريتيد إلى حد كبير هيكل الببتيدات الغنية سيستين5. وتشمل متعددة الببتيدات سد ثنائي كبريتيد والكونوتوكسين استيفاء مثل μ-بييا من أرجواني كونوس الذي يحتوي على ستة سيستينيس التسلسل. ويسمح هذا المحتوى سيستين عالية نظرياً تشكيل 15 ثنائي كبريتيد الايزومرات. اتصال ثنائي كبريتيد الصحيحة مهم جداً لأن النشاط البيولوجي6،7. بيد أن السؤال الذي يطرح نفسه ما إذا كان هناك أكثر من تكيف النشطة بيولوجيا الببتيدات التي تحدث بشكل طبيعي، وإذا كان ذلك، الذي هذه الايزومرات يمتلك النشاط البيولوجي أعلى؟ وفي حالة μ-والكونوتوكسين استيفاء، الأهداف البيولوجية بقنوات أيون الصوديوم عن طريق بوابة الجهد، و μ-بييا على وجه الخصوص أقوى للأنواع الفرعية ناV1.2، ناV1.4 و NaV1.73.

يمكن تركيب الببتيدات سد ثنائي كبريتيد باستخدام أساليب مختلفة. الأسلوب الأكثر ملاءمة لتشكيل ثنائي كبريتيد السندات داخل ببتيد هو ما يسمى بالنهج الذاتي للطي الأكسدة. هنا، يتم تصنيعه السلائف الخطي من الببتيد دوري المطلوب أولاً باستخدام الببتيد الصلبة-مرحلة التوليف، بعد انشقاق من دعم البوليمرية يتعرض للأكسدة في نظام المخزن مؤقت. غالباً ما يتم إضافة عوامل الأكسدة النشطة مثل انخفاض والمؤكسدة الجلوتاثيون (المدفع جريازيف/جسج) تشجيع تشكيل روابط ثنائي كبريتيد. والعيب الرئيسي في دعم المخزن المؤقت الذاتي قابلة للطي أن السندات ثنائي كبريتيد تتشكل ليس انتقائيا بشكل تدريجي. الببتيد الأصلية، التي غالباً ما يوصف ايزومير ثنائي كبريتيد محدد واحد فقط، بالمقارنة مع الممكن الحصول على العديد من الايزومرات الأخرى مع هذا النهج8. وقد أثبت بالفعل μ-بييا أن يؤدي على الأقل ثلاثة ايزومرات مطوية بشكل مختلف عند طي ذاتيا في دراسة سابقة3. بدلاً من ذلك صعباً نتيجة مماثلة مرات الاحتفاظ بفصل هذه أن خليط ايزومير إذا استخدام أساليب تنقية الكروماتوغرافي9. ولذلك توليف ايزومير محددة مستهدفة مفيد. لإنتاج على وجه التحديد أيسومر مع اتصال ثنائي كبريتيد محددة، استراتيجية خاصة مطلوب في فيها سندات ثنائي كبريتيد تباعا مغلقة. ولذلك، يتم تصنيعه السلائف خطية تحمل مجموعات حماية متميزة في أزواج سيستين الفردية في دعم البوليمر. بعد القضاء على، أزواج سيستين فردياً وتباعا ديبروتيكتيد وترتبط بفعل أكسدة لإنتاج ثنائي كبريتيد المطلوب سندات10،11،،من1213، 14 , 15 , 16-بعد التوليف وتنقية المنتج رد فعل، أنه مطلوب لتأكيد الهوية والاتصال ثنائي كبريتيد بالطرق التحليلية المناسبة. وتتوفر العديد من الأساليب التحليلية لتوضيح تسلسل الأحماض الأمينية الأساسية، على سبيل المثال-، MS/MS، حين تحديد اتصال ثنائي كبريتيد لا يزال أقل بكثير من التحقيق. وبصرف النظر عن الطابع المعقد لهذه الببتيدات المستعبدين من ثنائي كبريتيد متعددة، الشوائب المتعلقة بالمنتج (على سبيل المثال.، من ثنائي كبريتيد الهرولة)، نظراً لنموذج إعداد ومتابعة أعمال يمكن أن تزيد من تعقيد التحليل. في هذه الورقة، ونحن تبين أن استخدام مزيج من التقنيات التحليلية المختلفة اللازمة لتوضيح هوية السندات ثنائي كبريتيد في ايزومرات μ-بييا لا لبس فيه. لدينا طرق الكروماتوغرافي جنبا إلى جنب مع الطيف الكتلي وقدمت نفس العينات للتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي. وفي desorption/ionization(MALDI) الليزر ساعد مصفوفة تحليل MS/MS، حددنا السندات ثنائي كبريتيد باستخدام الحد الجزئي و derivatization إيودواسيتاميدي لأنه ليس من الممكن لهذا الببتيد التحليل من أعلى إلى أسفل. 2D الرنين المغناطيسي النووي تجارب أجريت من أجل الحصول على هيكل ثلاثي الأبعاد لكل أيزومر. وهكذا، عن طريق الجمع بين أساليب تحليلية متطورة متميزة، فمن الممكن توضيح بشكل صحيح اتصال ثنائي كبريتيد وبنية ثلاثية الأبعاد معقدة متعددة الببتيدات المستعبدين من ثنائي كبريتيد7.

Protocol

ملاحظة: جميع الأحماض الأمينية المستخدمة هنا كانت في لالتكوين. استخدمت المختصرات من الأحماض الأمينية ومشتقات الأحماض الأمينية طبقاً لتوصيات اللجنة التسميات من أيوب واللجنة المشتركة البحتة-أيوب في "مصطلحات الكيمياء الحيوية".

1-المرحلة الصلبة الببتيد التوليف (الكائنة)

ملاحظة: إجراء التوليف مع المزج ببتيد المرحلة الصلبة. إجراء توليف السلائف الببتيد الخطي في التسلسل العام زرلككجفوكسكرسرقكوهركك-NH2 باستخدام بروتوكول قياسي للكيمياء 9-فلورينيلميثيلوكسيكاربونيل (معتدلاً). تطبيق الأحماض الأمينية المحمية التالية: Pyr (بنك الصين (ثالثي-بوتيلوكسيكاربونيل))، الأرجنتين (Pbf (2,2,4,6,7-بينتاميثيلديهيدروبينزوفوران-5-السلفونيل))، Asn(Trt)، Asp(tBu)، Hyp(tBu)، Lys(Boc)، Ser(tBu)، Gln(Trt)، Glu(tBu)، Trp(Boc)، Tyr(tBu)، Thr(tBu)، وله (حزب تاي راك تاي). حماية أزواج سيستين مع حزب تاي راك تاي-Acm-أو تيبو-مجموعات وفقا لاتصال ثنائي كبريتيد المقصود.

  1. إعداد
    1. جاف الراتنج معتدلاً حلبة-أميد (تحميل: 0.28 mmol/ز) استخدام ليوفيليزير بين عشية وضحاها.
    2. أدخل التسلسل المطلوب الببتيد (1-رسالة التعليمات البرمجية) إلى برنامج المزج. البرنامج يقوم بحساب المبلغ المطلوب لكل كاشف الفردية وتشير إلى كميات المذيبات.
    3. وزن الكواشف الفردية (الأحماض الأمينية، هبتو (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium سداسي فلوروفوسفات)) وفقا للبروتوكول ويحل لهم في dimethylformamide (DMF) إلى نهائي تركز 2.4 م (الأحماض الأمينية) و (0.6 م هبتو)، على التوالي.
    4. نقل الكواشف المختلفة (الأحماض الأمينية، هبتو، ميثيلمورفوليني ن (نم، 50% في DMF)، بيبيريديني (20% في DMF)، DMF، الميثان (DCM)) بسفن المقابلة ووضعها في مضارب المناسبة من المزج الببتيد المرحلة الصلبة.
    5. إضافة 100 مغ راتنج الجافة إلى أعمدة رد الفعل ووضعها في مضرب المزج. بدء تركيب الببتيد المرحلة الصلبة.
  2. الكائنة--البروتوكول (التي قدمها المزج)
    ملاحظة: ينطبق البروتوكول على 100 مغ راتنج (تحميل: 0.28 mmol/g) إضافة إلى عمود واحد رد فعل لمقياس µmol 28.
    1. إعداد الراتنج
      1. شطف الراتنج مع 2500 ميليلتر DMF وميليلتر 1400 من DCM 1400 ميليلتر من DMF.
      2. مسح الراتنج مع الهواء حتى تتم إزالة المذيب وشطف الراتنج مع 2500 ميليلتر من DMF.
    2. انشقاق معتدلاً حماية المجموعة
      1. إضافة 20% بيبيريديني في DMF (1000 ميليلتر) إلى الراتنج وانتظر دقيقة 6 إزالة الحل من الراتنج. كرر الخطوة 1.2.2.1.
      2. شطف مرتين مع DMF (1st 4000 ميليلتر، 2nd1400 ميليلتر) ومسح الراتنج مع الهواء حتى تتم إزالة المذيب وشطف مرتين مع 2000 ميليلتر من DMF.
    3. رد فعل اقتران
      1. مزيج الكواشف التالية في قنينة منفصلة: هبتو (450 ميليلتر؛ M 0.6 في DMF؛ µmol 270؛ 9.6 مكافئ.)، نم (125 ميليلتر؛ 50% في DMF؛ µmol 568؛ 20 مكافئ.)، الأحماض الأمينية معتدلاً (420 ميليلتر؛ 2.4 متر في DMF؛ ملمول 1.01؛ 36 مكافئ.). إضافة الخليط إلى الراتنج وانتظر 13 دقيقة إزالة الحل من الراتنج. كرر الخطوة 1.2.3.1.
      2. يغسل مع 3000 ميليلتر من DMF. تغسل مرتين مع 1400 ميليلتر من DMF. تغسل مرتين مع 2000 ميليلتر من DMF.
      3. كرر الخطوتين 1.2.2 و 1.2.3 وفقا لعدد الأحماض الأمينية في تسلسل الببتيد.
    4. أغسل الانقسام وراتنج معتدلاً النهائي
      1. إضافة 20% بيبيريديني في DMF (1000 ميليلتر) إلى الراتنج وانتظر دقيقة 6 إزالة الحل من الراتنج. كرر الخطوة 1.2.4.1.
      2. شطف مرتين مع DMF (1st 4000 ميليلتر، 2nd 1400 ميليلتر) وتدفق الراتنج مع الهواء. شطف مرتين مع 2000 ميليلتر من DMF، 4 مرات مع ميليلتر 1400 من DCM، ومطاردة مرتين مع الهواء.
  3. متابعة العمل
    1. ليوفيليزي الراتنج من رد فعل الأعمدة بين عشية وضحاها بعد إتمام التوليف.

2-الببتيد الانقسام من الراتنج (الشكل 1أ)

ملاحظة: أثناء عملية الانقسام، وسوف ديبروتيكتيد جميع سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية باستثناء Cys(Acm) و Cys (تيبو). ينطبق البروتوكول على 100 مغ راتنج.

  1. الجمع بين الراتنج المعصوفه في أنبوب 12 مل وبارد إلى 0 درجة مئوية على الجليد.
  2. إضافة 150 ميليلتر من خليط الكاسح (أعد من الفينول ز 0.75، ثيوانيسولي مل 0.5، 0.25 مل اثانيديثيول) و 1 مل من حامض trifluoroacetic (تفا، 95% في الماء (H2O)) على الجليد إلى الراتنج. ترك تهتز برفق ح 3 في درجة حرارة الغرفة.
  3. تصفية هذا الخليط عن طريق أطل زجاج وجمع فيلتراتي في أنابيب مليئة فردياً المثلج إثيل الاثير (1 مل مزيج الانقسام في 8-10 مل أثير ثنائي إثيل). الببتيد رواسب صلبة بيضاء.
  4. شطف الكعكة تصفية مع تفا إضافية (95% في ح2س، حوالي 1-3 مل).
  5. إغلاق الأنابيب التي تحتوي على ترسبات الطرد المركزي (3400 س ز) أن الإيقاف لمدة 1 دقيقة، صب المادة طافية وتغسل الكريات مع 8-10 مل من المثلج إثيل الاثير. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
  6. اترك الكريات الدائمة دون سداده لمدة 5 دقائق لإزالة بقايا إثيل الاثير. حل الكريات النفط الخام المنتج في 1 مل من ثالثي-butanol (80% في ح2س). فريزيدري الببتيدات (-80 درجة مئوية).

3-تنقية "السلائف الخطي" مع شبه محضرة عالية الأداء اللوني السائل ([هبلك])

ملاحظة: تنقية الببتيدات الخام خلال المرحلة التحضيرية شبه المعكوسة (RP) [هبلك] مزودة بعمود C18 (5 ميكرون حجم الجسيمات، 100 حجم المسام، 250 × 32 مم) وحلقة حقن 3.6 مل. استخدام نظام شطف تدرج من 0.1% تفا ح2س (الوينت A) و 0.1% تفا في الاسيتو الانيتريل (ميكن)/H2س (الوينت 9:1، ب). الكشف عن قمم 220 نانومتر.

  1. إضافة ما يقارب 70 ملغ الببتيد الخام إلى أنبوب 15 مل وحل الببتيد الصلبة في حجم الحلقة عينة [هبلك] (على سبيل المثال-، 3.6 مل). استخدام خليط من 0.1% تفا ميكن/ح2س (1:1). دوامة حتى إتمام انحلال وأجهزة الطرد المركزي (3400 س ز) الحل لمدة 1 دقيقة.
  2. وضع العينة (3.6 مل) في حقنه 5 مل وحقن العينة دون أي فقاعات الهواء في حلقة الحقن. حقن النظام [هبلك]. فصل الخليط الببتيد استخدام تدرج من 0-50% الوينت ب ما يزيد على 120 دقيقة بمعدل تدفق من 10 مل/دقيقة.
  3. جمع الكسور في أنابيب الفردية كما تظهر. بعد اكتمال التشغيل إعداد الكسور المحدد الكتلي (مللي ثانية) وتحليل [هبلك] (الخطوة 6، 1-6، 2). فريزيدري الكسور وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  4. بعد تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد و [هبلك]، الجمع بين الكسور نقية من الببتيد الخطي وإعداد العينات لأكسدة الأولى.

4-انتقائية تشكيل روابط ثنائي كبريتيد

  1. 1 شارع أكسدة (1 الشكلب)
    ملاحظة: خلال الانقسام الببتيد من الراتنج، Cys(Trt) هي ديبروتيكتيد، مما أدى إلى اثنين من بقايا Cys غير المحمية التي تتعرض فيما بعد للأكسدة لتشكيل أول سند ثنائي كبريتيد. يسري البروتوكول التالي بملغ 15 من الببتيد المنقي الخطي (2864.5 g/mol؛ 5.2 µmol؛ 1 مكافئ.).
    1. حل الببتيد الخطي (15 مجم) في 105 مل من الايزوبروبانول/ح2س-خليط (1:2؛ 0.05 مم؛ الرقم الهيدروجيني 8.5 تعديلها مع هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)) وترك تهتز برفق في الجو بالشروط الأساسية ح 12-48.
    2. رصد رد فعل الأكسدة عن طريق [هبلك] والسيدة تأكيد تشكيل أول جسر من إيودواسيتاميدي (IAA) derivatization (الخطوة 6).
    3. فريزيدري الببتيد واستخدامه دون مزيد من تنقية لأكسدة 2nd .
  2. 2nd أكسدة (رقم 1ج)
    ملاحظة: أثناء أكسدة الثاني، deprotection سيستينيس محمية بمواد تحتوي على الأسبستوس، وتشكيل الجسر الثاني هي تحفزها اليود. ويسري البروتوكول بملغ 15 من الببتيد بعد أكسدةش 1 (2862.5 g/mol؛ 5.2 µmol؛ 1 مكافئ.)
    1. حل الببتيد (15 ملغ؛ النهائي تركيز 0.05 مم) في 105 مل من الايزوبروبانول/ح2م O/1 خليط حمض الهيدروكلوريك (HCl) (80:12.5:7.5).
    2. إضافة ميليلتر 158 حلاً اليود 0.1 متر في الميثانول (ميوه) (15.7 µmol؛ 3 مكافئ.) للحل. إثارة رد فعل في درجة حرارة الغرفة ح 3-52، أي.، حتى يتم إكمال الأكسدة.
    3. مراقبة رد فعل الأكسدة عن طريق [هبلك] والسيدة تأكيد تشكيل ثنائي كبريتيد السند الثاني عن طريق إيودواسيتاميدي (IAA) derivatization (الخطوة 6).
    4. وقف رد الفعل بإضافة ميليلتر 79 حل حمض الأسكوربيك 1 م في ح2س (78.8 µmol؛ 15 مكافئ.). فريزيدري الخليط رد فعل واستخدام المسحوق لأكسدة 3rd .
  3. 3rd أكسدة (1 الرقمد)
    ملاحظة: أكسدة آخر يؤدي إلى deprotection سيستينيس محمية بو تيوإلى تشكيل ثنائي كبريتيد الجسر الثالث. ويسري البروتوكول بملغ 15 من الببتيد بعد أكسدة 2nd (2718.3 g/mol؛ 5.5 µmol؛ 1 مكافئ.).
    1. حل الببتيد (15 ملغ، التركيز النهائي من 1 مم) في 5.5 مل تفا. أنه يحتوي على خليط الكاسح يتكون من 11.2 ملغ ديفينيلسولفوكسيدي (55 µmol؛ 10 مكافئ.)، 60.2 ميليلتر انيسول (0.6 ميللي مول؛ 100 مكافئ.) و 97.2 ميليلتر من تريتشلوروميثيلسيلاني (0.8 mmol؛ 150 مكافئ.). يقلب الخليط ح 3-5 في درجة حرارة الغرفة.
    2. مراقبة رد فعل الأكسدة عن طريق [هبلك] والسيدة تأكيد تشكيل السندات ثنائي كبريتيد الثالثة عن طريق إيودواسيتاميدي (IAA) derivatization (الخطوة 6).
    3. يعجل الببتيد في الأنابيب التي تحتوي على البارد إثيل الاثير (0 درجة مئوية، 1 مل من محلول رد فعل كل 8-10 مل أثير ثنائي إثيل).
    4. الطرد المركزي من التعليق (3400 س ز، 1 دقيقة)، وصب المادة طافية، وتغسل الكريات مرارا وتكرارا (4 مرات) مع 8-10 مل أثير ثنائي إثيل الباردة (0 درجة مئوية). واسمحوا الكريات الجافة على الهواء (3 دقائق).
    5. حل الكريات في 1 مل من 80% ثالثي-فريزيدري الببتيد وبيوتانول (في ح2س)، وتخزينها في-20 درجة مئوية.

5-الببتيد تنقية

ملاحظة: تنقية الببتيدات المؤكسدة التي اتخذته شبه [هبلك] RP مزودة بعمود C18 (10 ميكرون حجم الجسيمات، 300 حجم المسام، 250 x 22 مم) وحلقة حقن 3.6 مل. استخدام نظام شطف تدرج من 0.1% تفا ح2س (الوينت A) و 0.1% تفا ميكن/H2O (الوينت 9:1، ب). الكشف عن قمم 220 نانومتر.

  1. إضافة 15 ملغ المعصوفه النفط الخام المنتج من الخطوة 4.3.5 إلى أنبوب 15 مل. حل النفط الخام المنتج في حجم الحلقة عينة [هبلك] (على سبيل المثال-، 3.6 مل). استخدام خليط من 0.1% تفا ميكن/ح2س (1:1). دوامة حتى إتمام انحلال وأجهزة الطرد المركزي (3400 س ز) الحل لمدة 1 دقيقة.
  2. وضع الخليط 3.6 مل في حقنه 5 مل وحقن العينة دون أي فقاعات الهواء في حلقة الحقن. بدء ضخ في نظام [هبلك]. تنقية خليط الببتيد استخدام تدرج من 0-50% الوينت ب ما يزيد على 120 دقيقة بمعدل تدفق من 10 مل/دقيقة.
  3. جمع الكسور في أنابيب الفردية كما تظهر. بعد اكتمال التشغيل إعداد الكسور المحدد لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد و [هبلك] (الخطوة 6، 1-6، 2). فريزيدري كافة الكسور وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  4. بعد اكتمال التشغيل إعداد الكسور المحدد لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد و [هبلك] (الخطوة 6، 1-6، 2). فريزيدري كافة الكسور وتخزينها في-20 درجة مئوية.

6-الببتيد تحليلات

  1. [هبلك] تحليلية
    ملاحظة: تأكيد نقاء الببتيد واسطة تحليلية [هبلك] RP مزودة بعمود C18 (5 ميكرون حجم الجسيمات، 300 حجم المسام، مم 250 × 4.6) وحلقة حقن 500 ميليلتر. استخدام نظام شطف تدرج من 0.1% تفا ح2س (الوينت A) و 0.1% تفا في ميكن (الوينت ب). الكشف عن قمم 220 نانومتر.
    1. نقل عينة من الكسور الببتيد أو رد فعل عناصر التحكم إلى [هبلك] فيال وحله في خليط من 0.1% تفا في ميكن/H2O (1:1، 300-500 ميليلتر). ضع القنينة [هبلك] إلى أوتوسامبلير من [هبلك] RP التحليلية.
    2. ضخ 250 ميليلتر لكل عينة. استخدام نظام شطف تدرج من 0.1% تفا ح2س (الوينت A) و 0.1% تفا في ميكن (الوينت ب). تنقية الببتيد استخدام تدرج من 10-40% الوينت ب أكثر من 30 دقيقة بمعدل تدفق 1.0 مل/دقيقة.
  2. TOF استخدام الطيف الكتلي
    ملاحظة: تأكيد هوية الببتيد باستخدام TOF (وقت الرحلة) الطيف الكتلي باستخدام حمض α-سيانو-4-هيدروكسيسيناميك كمصفوفة.
    1. نقل كمية مرئية من الببتيد في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل وتذوب في 10 ميليلتر 37 ملم α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك حمض الحل في خليط من 0.1% تفا ح2س/ميكن (1:1).
    2. دوامة الحل بالنسبة 10 s، تنطبق 2 ميليلتر من العينة مستهدفة أرض الصلب، وأيردري العينة.
    3. استخدام وضع عاكس للقياسات ومعايرة ببتيد قياسية للجماهير المولى أدناه 6000 غ/مول.
  3. Derivatization إيودواسيتاميدي
    ملاحظة: كما يتفاعل إيودواسيتاميدي مع جماعات ثيول، يشير إلى derivatization إيودواسيتاميدي من الببتيدات جماعات ثيول مجاناً. ومن ثم عدم وجود جماعات ثيول الحرة بمثابة عنصر تحكم رد فعل عن طريق مرض التصلب العصبي المتعدد خلال أكسدةش 1.
    1. حل الببتيد في العازلة الفوسفات 10 ملم (100 ميليلتر؛ الرقم الهيدروجيني 7.8 0.05 مم) في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. إضافة 100 ميليلتر من إيودواسيتاميدي في المخزن المؤقت للفوسفات 10 ملم (4 مم) إلى الحل الببتيد وهزه بلطف رد فعل ح 2 في درجة حرارة الغرفة في الظلام. فريزيدري الخليط رد فعل وتخزينها في-20 درجة مئوية.
    2. استخدام تلميح ماصة C18-تركيز عامل تصفية وشرط التلميح مع 10 ميليلتر من 80% (3 مرات)، 50% (3 مرات)، 30% (3 مرات) و 0% ميكن (3 مرات) في ح2س (+ 0.1% تفا).
    3. حل العينة من الخطوة 6.3.1 في 1 ميليلتر من 0.1% تفا ح2س وإضافة الحل إلى الفلتر ماصة. "الماصة؛" بعناية صعودا وهبوطاً حتى أن الببتيد بربط حبة. إزالة ح2س من طرف الماصة وشطف الفلتر ماصة مع 10 ميليلتر من 0.1% تفا ح2o.
    4. إضافة 2 ميليلتر من 0.1% تفا ح2س/ميكن (1:1) مع آخر نصيحة ماصة (بدون تصفية) على رأس حبة الذي يحتوي على الببتيد. تطبيق فيلتراتي إلى الهدف الأرضي الصلب وأيردري العينة.
    5. تطبيق 1 ميليلتر من حل حمض α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك 37 ملم في خليط من 0.1% تفا ح2س/ميكن (1:1) إلى أرض الواقع الصلب المستهدفة مع العينة وأيردري العينة.
    6. استخدام وضع عاكس للقياسات ومعايرة ببتيد قياسية للجماهير المولى أدناه 6000 غ/مول.
  4. تحليل الأحماض الأمينية
    ملاحظة: تحليل تركيز الببتيد الدقيق، فضلا عن تكوين الببتيد استخدام محلل الأحماض الأمينية الأحماض الأمينية.
    1. نقل 100 ميكروغرام من الببتيد النقي (2604 g/mol؛ 0.04 µmol) إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل ويحل المسحوق في 200 ميليلتر من 6 M HCl.
    2. نقل 200 ميليلتر من الحل في امبول زجاج وشطف الأنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل مرتين مع 200 ميليلتر من 6 M HCl. نقل الحل الشطف في امبول زجاج كذلك.
    3. أغلق امبول بتدفئة رقبة امبول مع لهب موقد بنسن. وضع امبول أنبوب زجاج. ضعه في كتلة تدفئة عن 24 ساعة عند 110 درجة مئوية للتحلل المائي.
    4. فتح في امبول ونقل الحل في أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل. أغسل امبول (3 × 200 ميليلتر) والحد الأقصى (3 × 100 ميليلتر) مع المقطر مزدوجة ح2س وتحويلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي.
    5. الطرد المركزي هي الحل ح 6 في 60 درجة مئوية و 210 x g في مركز فراغ تناوب. حل المنتج طحين في 192 ميليلتر من المخزن المؤقت تمييع عينة (200 ميكرومتر) ونقل الحل إلى عامل تصفية الصغير-الطرد مركزي.
    6. الطرد المركزي العينة لمدة 1 دقيقة على 2300 × ميليلتر 100 ز ونقل فيلتراتي إلى أنبوب عينة تحليل الأحماض الأمينية. ضع الأنبوب إلى محلل الأحماض الأمينية والبدء في التحليل. يتم استخدام معيار الأحماض الأمينية للمعايرة.

7-MS/MS تحليل اتصال ثنائي كبريتيد

  1. الحد والالكله جزئية17
    1. حل 600 مكغ من الببتيد النقي (2604 g/mol؛ 0.23 µmol) في 1.2 مل من المخزن المؤقت لسترات 0.05 متر مكعب (درجة الحموضة 3.0؛ تركيز الببتيد 0.14 ملم) الذي يحتوي على 7.5 ملغ من tris(2-carboxyethyl) الفوسفين (تسيب؛ م 0.02 0.03 مليمول).
    2. احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة واتخاذ رد فعل عدة عينات ضبط (100 ميليلتر) تتراوح من 0 دقيقة إلى 30 دقيقة.
    3. خلط العينات في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل مع 300 ميليلتر من المخزن المؤقت الألكلة (0.5 M تريس-خلات؛ ودرجة الحموضة 8.0؛ 2 مم الإيثيلين حمض (يدتا)؛ إيودواسيتاميدي م 1.1) التوقف عن رد فعل وأداء كارباميدوميثيليشن جماعات ثيول مجاناً.
    4. وقف رد الفعل بعد 5 دقائق عن طريق إضافة 100 ميليلتر من 10% تفا (في ح2س) وتخزين العينات في الثلج الجاف. إعداد عينات [هبلك] كما هو موضح في الخطوة 6.1.2 وحقن 400 ميليلتر. (الشكل 2أ)
    5. استخدام نظام شطف تدرج من 0.1% تفا ح2س (الوينت A) و 0.1% تفا في ميكن (الوينت ب). تحليل الببتيدات استخدام المزيج من فصل isocratic (10% الوينت ب لمدة 15 دقيقة) وثم تدرج بعد ذلك من 10-35% الوينت ب أكثر من 25 دقيقة بمعدل تدفق من 10 مل/دقيقة كشف قمم 220 نانومتر.
    6. جمع الكسور في أنابيب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي وفريزيدري الببتيدات. (الشكل 2ب)
    7. نقل كمية صغيرة من كل جزء في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل لتحليل MS/MS من أشكال المؤكسدة (الاستمرار في الخطوة 7.1.12).
    8. حل الببتيد المتبقية (10-100 ميكروغرام) في 0.1% تفا ح2س (10-50 ميليلتر) وإضافة وحدة تخزين مناسبة لحل تسيب 100 ملم (في ح2س) للحصول على تركيز تسيب نهائي من 10 ملم.
    9. تبني رد فعل ح 1 في 37 درجة مئوية (الشكل 2-ج). فريزيدري الخليط رد فعل وتخزينها في-20 درجة مئوية.
    10. إعداد عينات MS/MS كما هو موضح في الخطوة 6.3.2-6.3.5.
    11. إجراء القياسات MS/MS على مطياف كتلة استخدام TOF/TOF. استخدام "غطاء" MS/MS (تسوس المستحثة بالليزر) لتجزئة الببتيد وتحديد الجماهير السلائف من 2-4 مرات والأنواع كارباميدوميثيلاتيد. معالجة وتقييم البيانات استخدام لتأكيد اتصال ثنائي كبريتيد المرجوة.

8-الرنين المغناطيسي النووي تجارب وتحليل هيكل

  1. حل حوالي 0.3-2 مغ من المنتج الببتيد نقية في 500 ميليلتر من ح2الباب2س (90:10) ونقل الخليط إلى microtube الرنين المغناطيسي.
  2. تحضير العينة للقياسات في مطياف الرنين المغناطيسي النووي
  3. سجل ثنائي الأبعاد [1ح،1ح]-دقف-مريح (ضعف الكم تصفية ارتباط مطيافية)، [1ح،1ح]-توكسي (مطيافية يرتبط مجموع)، [1ح،1ح]-نويسي (تعزيز أوفرهوزر النووية مطيافية)، و [1ح،13ج]-أطياف هسقك (هيتيرونوكلير تماسك الكم واحد) باستخدام قمع المياه.
  4. تعيين الأصداء بروتون من أطياف مسجل وإنشاء التعيين ذرة من الأطياف نويسي. مقارنة الكثافة في أطياف نويسي لتعيين قيود الحد الأعلى المسافة بين الذرات المختلفة في الببتيد. استخدام كثافة البروتونات جيرمنال لمعايرة كثافة الذروة.
  5. أداء حساب الهيكل وصقل مع برنامج كمبيوتر لتصور الجزيئية واستخدام connectivities ثنائي كبريتيد التي تم تحديدها في الخطوة 7 كقيود إضافية (الشكل 3).
  6. حدد الهياكل مع أدنى الطاقات واستخدامها لمحاكاة ديناميات الجزيئية (MD).

النتائج

15 مختلفة سد ثنائي كبريتيد ايزومرات بييا μ-كونوتوكسين توليفها وتتميز بالتفصيل (الشكل 1). يتم تعريف السندات ثنائي كبريتيد بالحد الجزئي والتحليل اللاحق MS/MS (الشكل 2). يتم إجراء تحليل الرنين المغناطيسي ايزومرات مختلفة (الشكل 3) ل...

Discussion

الطريقة الموضحة هنا لتركيب الببتيدات سيستين الغنية مثل بيييا μ يمثل إمكانية لإنتاج ايزومرات ثنائي كبريتيد المستعبدين من نفس تسلسل الأحماض الأمينية بشكل انتقائي. ولذلك، أنشأت أساليب مثل الصلبة المستندة إلى معتدلاً المرحلة الببتيد التوليف18 واستراتيجية مجموعة حماية محددة لت...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونود أن نشكر ريسمان ألف وواو ياء ماير سوكو دال من بروكر دالتونيكس GmbH بريمن؛ دال تيتزي، تيتزي ألف ألف، شميدتس ف وتييلي جيم من جامعة دارمشتات للتكنولوجيا؛ Ohlenschläger سين من يينا FLI، م. انجيسير من جامعة بون؛ كرامر ك. وألف هارزين H. ناكاجامي من معهد ماكس بلانك لبحوث تربية النبات، كولونيا؛ سوزان نوبيرت من معهد علم الحيوان، كولونيا؛ ومرافق التحليل الطيفي الرنين المغناطيسي الجزيئية البيولوجية من جامعة فرانكفورت للتقنية الدعم والتدريب الوحدات النمطية، والوصول إلى الأدوات. هو العرفان بالدعم المالي المقدم من جامعة بون إلى D.I..

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PS PEG2000 Fmoc Rink-amide ResinVarian, Inc.PL3867-3764AmphiSpheres 40 RAM
Pyr(Boc)BachemA-3850
Arg(Pbf)Iris BiotechFSC1010
Asn(Trt)BachemB-1785
Asp(tBu)Iris BiotechFSP1020
Hyp(tBu)Iris BiotechFAA1627
Lys(Boc)BachemB-1080
Ser(tBu)Iris BiotechFSC1190
Gln(Trt)Iris BiotechFSC1043
Glu(tBu)Iris BiotechFSP1045
Trp(Boc)Iris BiotechFSC1225
Tyr(tBu)Sigma Aldrich47623
Thr(tBu)Iris BiotechFSP1210
His(Trt)Iris BiotechFDP1200
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphatSigma Aldrich8510060Flammable
DMFFisher ScientificD119Flammable, Toxic
DCMFisher ScientificD37Carcinogenic
PiperidineAlfa AesarA12442Flammable, Toxic, Corrosive
N-Methyl-MorpholinSigma Aldrich224286
Cys(Acm)Iris BiotechFAA1506
Cys(Trt)BachemE-2495
Cys(tBu)BachemB-1220
trifluoruacetic acidSigma Aldrich74564Toxic, Corrosive
phenolMerck1002060Toxic
thioanisolAlfa AesarA14846
ethanedithiolFluka Analytical2390
diethyl etherVWR100,921Flammable
tert-butanolAlfa AesarL12338Flammable
acetonitrileFisher ScientificA998Flammable
waterFisher ScientificW5
isopropanolVWRACRO42383Flammable
sodium hydroxideAppliChemA6579,1000Corrosive
iodoacetamideSigma AldrichI6125
iodineSigma AldrichI0385
Hydrochloric acidMerck110165Corrosive
ascorbic acidSigma AldrichA4403
diphenylsulfoxideSigma AldrichP35405
anisolSigma Aldrich96109Flammable
trichloromethylsilaneSigma AldrichM85301Flammable
sample dilution bufferLaborservice Onken
sodium dihydrogen phosphateSigma Aldrich106370
disodium hydrogen phosphateSigma Aldrich795410
(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorideSigma AldrichC4706
citric acidSigma Aldrich251275
sodium citrate dihydrateSigma AldrichW302600
tris-acetateCarl Roth, 7125
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma AldrichE26282 
peptide calibration standard IIBruker Daltonics GmbH8222570
Name of EquipmentCompany
solid-phase peptide synthesizerIntavis Bioanalytical Instruments AGEPS 221
lyophilizer Martin Christ GmbH Alpha 1-2 Ldplus
semipreparative HPLCJascosystem PV-987
Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm)Knauer25QE181E2Jpurification of the linear peptide
Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm)Hichrom-VWRHICH218TP1022purification of the oxidized peptide
analytical HPLC Shimadzusystem LC-20AD
Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm) Hichrom-VWRHICH218TP54analytical column
ground steel target (MTP 384)Bruker Daltonics GmbHNC0910436MALDI preparation 
C18-concentration filter (ZipTip)Merck KGaAZTC18S096MALDI preparation 
MALDI mass spectrometerBruker Daltonics GmbHultraflex III TOF/TOF
amino acid analyzerEppendorf-Biotronik GmbHLC 3000 system
NMR spectrometer Bruker Avance IIIBruker Daltonics GmbHBruker Avance III 600 MHz
computer program for molecular visualisingYASARA Biosciences GmbHYasara structuresNMR structure calculation
computer program for MALDI data evaluation Bruker Daltonics GmbHflexAnalysis, BioToolsMS/MS fragmentation
analog vortex mixerVWRVM 3000
MicrocentrifugeEppendorf5410
CentrifugeHettichEBA 20
Rotational vacuum concentratorChrist2-18 Cdplus
Analytical BalanceA&D InstrumentsGR-202-EC

References

  1. Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
  2. Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  3. Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
  4. Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
  5. Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
  6. Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
  7. Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
  8. Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).
  9. Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
  10. Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
  11. Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
  12. Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
  13. Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
  14. Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
  15. Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
  16. Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
  17. Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
  18. Kates, S. A., Albericio, F. . Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , (2000).
  19. Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities
Posted by JoVE Editors on 11/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. The Protocol and Materials sections were updated.

Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

to:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

Step 1.2 in the Protocol section was updated from:

NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 μmol scale.

to:

NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 μmol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 µmol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.

Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:

HBTU (450 µL; 0.6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).

to:

HBTU (415 µL; 0.6 M in DMF; 249 µmol; 9 eq.), NMM (112 µL; 50% in DMF; 510 µmol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 0.6 M in DMF; 252 µmol; 9 eq.).

The first item in the Materials table was updated from:

Fmoc Rink amide resinNovabiochem855001

to:

PS PEG2000 Fmoc Rink-amide ResinVarian, Inc.PL3867-3764AmphiSpheres 40 RAM

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140 2D MS MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved