Синтез и определение структуры изомеров PIIIA µ-Conotoxin с различными дисульфида связность

Резюме

Цистеин богатые пептиды сложить в собственный трехмерной структуры в зависимости от их соединения дисульфида. При буфера окисления не приведет к желаемой дисульфида подключения требуется целевой синтез отдельных дисульфида изомеров. Протокол касается селективный синтез пептидов, 3-дисульфид стружечные и их структурного анализа с помощью исследования ЯМР и МС/МС.

Аннотация

Пептиды с высокое количество которым находятся обычно под влиянием относительно трехмерной структуры их соединения дисульфида. Он таким образом очень важно, чтобы избежать нежелательных дисульфидными облигаций формирования во время синтеза пептида, потому что это может привести к совершенно разных пептидных структуры и соответственно изменены биологическую. Однако правильное формирование нескольких дисульфидными облигаций в пептид трудно получить с помощью стандартных методов самостоятельной складной как обычного буфера окисления протоколы, потому что могут быть сформированы несколько дисульфида связность. Этот протокол представляет передовые стратегии, необходимые для целенаправленного синтеза нескольких мост дисульфидных пептиды, которые не могут быть синтезированы через буфер окисления в высокое качество и количество. Исследование демонстрирует применение различных защиты группы стратегии для синтеза всех изомеров возможно 3-дисульфид стружечные пептид µ-conotoxin PIIIA в целевой путь. Пептиды подготовленный на основе Fmoc твердой фазы пептидного синтеза с использованием стратегию защиты группы для формирования определенных дисульфидными облигаций. Соответствующих пар которым защищены с trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) и трет-бутила (tбу) защита группы чтобы убедиться, что во время каждого шага окисления только необходимые которым deprotected и связаны. Помимо целенаправленного синтеза сочетание нескольких аналитических методов используется для уточнить правильный складные и поколения желаемого пептид структур. Сравнение различных изомеров 3-дисульфид стружечные указывает на важность точного определения и знание дисульфида подключения для расчета трехмерной структуры и интерпретации биологических деятельность пептида изомеров. Аналитическая характеристика включает точное дисульфида Бонд разяснения через тандем масс-спектрометрия (МС/МС) анализ, который проводится с частично сокращенной и алкилированные производные нетронутыми пептид изомера, подготовлен адаптированный протокол. Кроме того пептид структуры определяются с помощью 2D ядерного магнитного резонанса (ЯМР) эксперименты и знания, полученные от анализа МС/МС.

Введение

Использование биоактивные пептиды в фармацевтических исследований и разработок является признанным, потому что они представляют собой мощный и высокоселективных соединений для конкретных биологических цели¹. Для их биологическую однако, трехмерная структура имеет большое значение для того, чтобы выполнять структура активность отношения исследования^2,3,4. Помимо первичного аминокислотной последовательности, которая влияет на общую конформации дисульфидными облигаций значительно стабилизации структуры хвоща богатые пептиды⁵. Несколько мост дисульфидных пептиды включают конотоксины например µ-PIIIA от конус скворец , который содержит шесть которым в своей последовательности. Это высокий хвоща содержимое теоретически позволяет формирование 15 дисульфида изомеров. Правильные дисульфида подключения является очень важным для биологической активности^6,7. Однако возникает вопрос есть ли более чем одной биоактивные конформации естественных пептидов и если да, какие из этих изомеров обладает высокой биологической активностью? В случае µ конотоксины, биологической цели являются воротами напряжения натрия ионных каналов, и µ-PIIIA, в частности, является самым мощным для подтипов_V1.2, Na Na Na_V1.7 и_V1.4³.

Синтез пептидов, дисульфид мост может быть достигнуто с помощью различных методов. Наиболее удобный способ для образования дисульфидных связей внутри пептид является так называемого оксидативного самостоятельно складной подход. Здесь линейная прекурсора желаемый циклические пептиды синтезируется, сначала с помощью твердофазный пептидного синтеза, который после расщепления от полимерных поддержки подвергается окислению в буферную систему. Редокс активных агентов, таких как восстановленного и окисленного глутатиона (GSH/GSSG) часто добавляются для поощрения образования дисульфидных связей. Основным недостатком буфер поддерживается собственной складывания является, что дисульфидными облигаций формируются в ступенчатой моды не выборочно. По сравнению с родной пептид, для которого часто описывается только один конкретный дисульфида изомер, это можно получить многочисленные другие изомеры с этот подход⁸. Уже было показано, что мкг-PIIIA привести к по крайней мере три по-разному сложенном изомеров после индивидуальной складывающиеся в предыдущем исследовании³. Разделение такой смеси изомером является довольно трудно из-за аналогичные удержания раз, если с помощью хроматографических очистки методы⁹. Поэтому выгодно целевых синтез определенных изомеров. Производить специально требуемого изомер с определенными дисульфида связи, специальной стратегии в котором дисульфидными облигаций последовательно закрываются. Таким образом линейной прекурсоров, перевозящих отдельные группы защиты в отдельных хвоща пар синтезируется на поддержку полимера. После ликвидации хвоща пары являются индивидуально и последовательно deprotected и связаны в реакции окисления приносить желаемых дисульфидными облигаций^{10,11,12,13, 14 , 15 , 16}. после синтеза и очистки продукта реакции, он требуется для подтверждения личности и соединения дисульфида подходящих методов анализа. Многочисленные аналитические методы доступны для выяснения основной аминокислотной последовательности, например., МС/МС, в то время как определение дисульфида подключения по-прежнему остается гораздо менее исследованы. Помимо сложности таких несколько дисульфида стружечные пептиды, связанные с продуктом примеси (например., от дисульфида скремблирования), из-за образец подготовки и работы могут еще более усложнить анализ. В этом документе мы покажем, что использование сочетания различных аналитических методов необходимо недвусмысленно разъяснить удостоверение дисульфидных связей в изомеров µ-PIIIA. Мы есть комбинированные методы хроматографии с масс-спектрометрии и же образцы для ЯМР спектроскопии. В desorption/ionization(MALDI) при содействии матрицы лазерный анализ МС/МС мы определили дисульфидными облигаций с помощью частичного сокращения и iodoacetamide деривации, потому что сверху вниз анализ не является возможным для этого пептида. Для того чтобы получить трехмерную структуру каждого изомера были эксперименты 2D ЯМР. Таким образом путем объединения различных сложных аналитических методов, это возможно для выяснения должным образом дисульфида подключения и трехмерной структуры комплекса несколько дисульфида стружечные пептиды⁷.

протокол

Примечание: Все аминокислоты, используемые в настоящем документе были в L-конфигурации. Согласно рекомендации Комитета IUB номенклатуры и совместной комиссии по биохимической номенклатуры IUPAC-IUB были использованы сокращения аминокислот, и аминокислоты производные.

1. твердофазный пептидного синтеза (ППУ)

Примечание: Осуществляют синтез пептида твердофазный синтезатор. Выполните синтеза линейных пептид прекурсоров общей последовательности ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH₂ , используя стандартный протокол для химии 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc). Применить следующие защищенные аминокислоты: Pyr (БПЦ (трет butyloxycarbonyl)), Arg (Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-сульфонил)), Asn(Trt), Asp(tBu), Hyp(tBu), Lys(Boc), Ser(tBu), Gln(Trt), Glu(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), Thr(tBu) и его (ТРТ). Защищайте хвоща пар с Trt-, Acm- или tБу групп согласно предполагаемого дисульфида подключения.

1. Подготовка
   1. Сухие смолы Fmoc каток Амид (Загрузка: 0,28 ммоль/г) с использованием лиофилизатор на ночь.
   2. Введите желаемый пептид последовательности (код 1-письмо) в программу синтезатор. Программа вычисляет необходимую сумму для каждого индивидуального реагента и указывает количество растворителя.
   3. Весят отдельные реагенты (аминокислоты, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium Гексафторофосфат)) согласно протоколу и развести их в диметилформамиде (DMF) до конечной концентрации 2,4 М (аминокислоты) и 0,6 М ( HBTU), соответственно.
   4. Перевод различных реагентов (аминокислоты, HBTU, N-methylmorpholine (НММ, 50% в DMF), пиперидина (20% в DMF), ДМФ, дихлорметана (DCM)) соответствующих судов и поместите их в соответствующие ракетки твердофазный пептид синтезатор.
   5. Добавить 100 мг сухой смолы в реакции столбцы и положил их в рэкет синтезатор. Запустите твердофазный пептидного синтеза.
2. ППУ-протокол (предоставляемые синтезатор)
   Примечание: Протокол применяется к 100 мг смолы (Загрузка: 0,28 ммоль/г) добавляется к столбцу одной реакции для 28 мкмоль масштаба.
   1. Подготовка смолы
      1. Промойте смолы с 2500 мкл ДМФ, 1400 мкл DCM и 1400 мкл ДМФ.
      2. Флеш смолы с воздухом до тех пор, пока удаляется растворителя и промойте смолы с 2500 мкл ДМФ.
   2. Расщепление Fmoc, защищая группы
      1. Добавить 20% пиперидина в DMF (1000 мкл) смолы и ждать 6 минут удалите решение из смолы. Повторите шаг 1.2.2.1.
      2. Дважды промыть DMF (1^st 4000 мкл, 2^nd1400 мкл), потолочные смолы с воздухом до тех пор, пока удаляется растворителя и дважды промыть 2000 мкл ДМФ.
   3. Реакции соединения
      1. Смешайте следующие реагентов в отдельном флаконе: HBTU (450 мкл; 0,6 М в DMF; 270 мкмоль; 9,6 eq.), NMM (125 мкл; 50% ДМФ 568 мкмоль; 20 eq.), Fmoc амино кислоты (420 мкл; 2,4 М в DMF 1.01 ммоль; 36 эквалайзера). Добавить смесь смолы и ждать 13 мин удалить решение из смолы. Повторите шаг 1.2.3.1.
      2. Вымойте с 3000 мкл ДМФ. Мыть дважды с 1400 мкл ДМФ. Мыть дважды с 2000 мкл ДМФ.
      3. Повторите шаги 1.2.2 и 1.2.3 согласно количество аминокислот пептидной последовательности.
   4. Окончательный Fmoc расщепления и смолы мытье
      1. Добавить 20% пиперидина в DMF (1000 мкл) смолы и ждать 6 минут удалите решение из смолы. Повторите шаг 1.2.4.1.
      2. Дважды промыть DMF (1^st 4000 мкл, 2^nd 1400 мкл) и промойте смолы с воздухом. Дважды промыть 2000 мкл ДМФ, 4 раза с 1400 мкл DCM и очистить дважды с воздухом.
3. Работа вверх
   1. Lyophilize смолы от реакции, которую столбцы на ночь после завершения синтеза.

2. пептидные расщепления от смолы (рис. 1A)

Примечание: Во время процедуры расщепления, будут deprotected все аминокислоты боковые цепи за исключением Cys(Acm) и Cys (tбу). Протокол применяется к 100 мг смолы.

1. Объединить лиофилизированной смолы в 12 мл трубку и охладить его до 0 ° C на льду.
2. Добавьте 150 мкл мусорщик смеси (подготовлен от 0,75 г фенола, 0,5 мл thioanisole, ethanedithiol 0,25 мл) и 1 мл trifluoroacetic кислоты (ТФК, 95% в воде (H2O)) на льду смолы. Оставьте, слегка покачивая за 3 ч при комнатной температуре.
3. Фильтр смесь через стекло фритты и сбора фильтрата в трубах, индивидуально заполнены с ледяной диэтиловым эфиром (1 мл смеси расщепление на 8-10 мл диэтиловый эфир). Пептида осаждается в виде белого твердого.
4. Промойте фильтр торт с дополнительной TFA (95% H₂O, примерно 1-3 мл).
5. Закройте пробирки, содержащие осадок и центрифуги (3400 x g) суспензии на 1 мин, сцеживаться супернатант и мыть окатышей с 8-10 мл ледяной диэтиловом эфире. Повторите этот шаг 3 раза.
6. Оставьте постоять 5 мин удалить оставшиеся следы диэтиловом эфире без пробки гранул. Растворяют гранулы сырой продукт в 1 мл трет-бутанола (80% в H₂O). Freeze-Dry пептиды (-80 ° C).

3. Очистка линейной прекурсоров с полу препаративные высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Примечание: Очистить сырой пептиды, полу препаративные обратной фазы (RP) ВЭЖХ, оснащены C18 столбца (размер частиц 5 мкм, 100 Å размер поры, 250 x 32 мм) и 3,6 мл впрыска цикла. Используйте систему градиента элюции 0,1% TFA H₂O (элюента A) и 0,1% TFA в ацетонитриле (MeCN) / h₂O (9:1, элюента B). Обнаружение пиков на 220 Нм.

1. Добавить около 70 мг сырой пептида в 15 мл трубку и растворяют твердые пептида в объеме образца цикла ВЭЖХ (например., 3,6 мл). Используйте смесь 0,1% TFA MeCN/H₂O (1:1). Вихревой до полное растворение и центрифуги (3400 x g) решение за 1 мин.
2. Разработать образец (3,6 мл) в 5 мл шприц и вставляют образца без каких-либо воздушных пузырей впрыска цикла. Внедрить в системе ВЭЖХ. Разделите смесь пептид, с использованием градиента 0-50% элюента B свыше 120 мин со скоростью потока 10 мл/мин.
3. Сбор фракций в отдельных труб, как они появляются. После завершения выполнения подготовки отдельных фракций для ВЭЖХ анализ (шаг 6.1-6.2) и масс-спектрометрия (МС). Freeze-Dry фракций и хранить их при-20 ° C.
4. После анализа MS и ВЭЖХ объединить чистой доли линейной пептида и подготовить образцы для первого окисления.

4. избирательное образование дисульфидных связей

1. 1 ^st окисления (Рисунок 1B)
   Примечание: В ходе расщепления пептидов из смолы, Cys(Trt) deprotected, ведущих к два незащищенных остатки Cys, которые впоследствии подвергаются окислению сформировать первый дисульфидными облигаций. Следующий протокол применяется к 15 мг очищенного линейного пептида (2864.5 г/моль; 5,2 мкмоль; 1 экв.).
   1. Распустить линейной пептида (15 мг) в 105 мл изопропанол/H₂O-смесь (1:2; 0,05 мм; рН 8,5 скорректирована с гидроокиси натрия (NaOH)) и оставить нежно тряска в воздухе в основных условиях для 12-48 ч.
   2. Контролировать реакции окисления через ВЭЖХ и г-жа подтверждение формирования первого моста iodoacetamide (IAA) деривации (шаг 6).
   3. Freeze-Dry пептида и использовать его без дальнейшей очистки для 2^nd окисления.
2. 2-^й окисления (Рисунок 1C)
   Примечание: Во втором окисление, deprotection которым Acm защитой и формирование второго моста катализируемые йода. Протокол применяется к 15 мг пептида после 1^st окисления (2862.5 г/моль; 5,2 мкмоль; 1 экв.)
   1. Растворите пептида (15 мг; конечной концентрации 0,05 мм) в 105 мл изопропанол/Ч₂М O/1 смесь соляной кислоты (HCl) (80:12.5:7.5).
   2. 158 мкл раствора йода 0,1 М в метаноле (метанола) (15,7 мкмоль; 3 экв) в решение. Перемешать реакции при комнатной температуре 3-52 h, т.е., пока не завершится процесс окисления.
   3. Контролировать реакции окисления через ВЭЖХ и г-жа подтверждение формирования второй дисульфидными облигаций iodoacetamide (IAA) деривации (шаг 6).
   4. Остановить реакции, добавив 79 мкл раствора аскорбиновой кислоты 1 M в H₂O (мкмоль 78.8; 15 экв.). Freeze-Dry реакционной смеси и использовать порошок для 3^rd окисления.
3. 3^rd окисления (Рисунок 1D)
   Примечание: Последний окисление приводит к deprotection Бу защищенные которым tи формирование третьего дисульфидных мостика. Протокол применяется к 15 мг пептида после окисления 2^nd (2718.3 г/моль; 5,5 мкмоль; 1 экв.).
   1. Растворяют в 5,5 мл TFA пептида (15 мг, конечная концентрация 1 мм). Он содержит мусорщик смесь, состоящую из 11,2 мг diphenylsulfoxide (55 мкмоль; 10 eq.), 60,2 мкл Анизол (0,6 ммоль; 100 экв) и 97,2 мкл trichloromethylsilane (0,8 ммоль; 150 эквалайзера). Перемешайте смесь для 3-5 ч при комнатной температуре.
   2. Контролировать реакции окисления через ВЭЖХ и г-жа подтверждение формирования третьего дисульфидными облигаций iodoacetamide (IAA) деривации (шаг 6).
   3. Осадок пептида в пробирки, содержащие холодной диэтиловым эфиром (0 ° C, 1 мл раствора реакции на 8-10 мл диэтиловый эфир).
   4. Центрифуга для суспензий (3400 x g, 1 мин), сцеживаться супернатанта и мыть гранулы неоднократно (4 раза) с 8-10 мл холодного диэтиловым эфиром (0 ° C). Пусть гранулы сушат на воздухе (3 мин).
   5. Растворяют гранулы в 1 мл 80% трет-бутанола (в H₂O), freeze-dry пептида и хранить его при-20 ° C.

5. пептидные очистки

Примечание: Очистить окисленных пептиды, полу подготовке RP HPLC оснащены C18 столбец (частиц размером 10 мкм, 300 Å размер поры, 250 x 22 мм) и 3,6 мл инъекционного цикла. Используйте систему градиента элюции 0,1% TFA H₂O (элюента A) и 0,1% TFA MeCN/H₂O (9:1, элюента B). Обнаружение пиков на 220 Нм.

1. Добавьте 15 мг лиофилизированных сырой продукт из шага 4.3.5 в 15 мл. Распустить сырой продукт в объеме образца цикла ВЭЖХ (например., 3,6 мл). Используйте смесь 0,1% TFA MeCN/H₂O (1:1). Вихревой до полное растворение и центрифуги (3400 x g) решение за 1 мин.
2. Составить 3,6 мл смеси в шприц 5 мл и вставляют образца без каких-либо воздушных пузырей впрыска цикла. Начало впрыска в систему ВЭЖХ. Очищения пептида смесь, с использованием градиента 0-50% элюента B свыше 120 мин со скоростью потока 10 мл/мин.
3. Сбор фракций в отдельных труб, как они появляются. После завершения выполнения подготовки отдельных фракций для анализа MS и ВЭЖХ (шаг 6.1 и 6.2). Freeze-Dry всех фракций и хранить их при-20 ° C.
4. После завершения выполнения подготовки отдельных фракций для анализа MS и ВЭЖХ (шаг 6.1 и 6.2). Freeze-Dry всех фракций и хранить их при-20 ° C.

6. пептидные аналитика

1. Аналитический ВЭЖХ
   Примечание: Подтвердить чистоту пептид, аналитической RP ВЭЖХ, оборудованы со столбцом C18 (размер частиц 5 мкм, 300 Å размер поры, 250 x 4,6 мм) и петли инъекции 500 мкл. Используйте систему градиента элюции 0,1% TFA в H₂O (элюента A) и 0,1% TFA в MeCN (элюента B). Обнаружение пиков на 220 Нм.
   1. Передать образец пептидных фракций или реакции управления в ВЭЖХ флакон и растворить его в смесь 0,1% TFA в MeCN/H2O (1:1, 300-500 мкл). Поместите ВЭЖХ флакона в автоматический пробоотборник аналитической RP HPLC.
   2. Придать 250 мкл каждого образца. Используйте систему градиента элюции 0,1% TFA в H₂O (элюента A) и 0,1% TFA в MeCN (элюента B). Очищения пептида, с использованием градиента 10-40% элюента B более 30 минут со скоростью потока 1.0 мл/мин.
2. Масс-спектрометрия MALDI TOF
   Примечание: Подтвердите личность пептид, масс-спектрометрия MALDI TOF (время полета) с помощью α- циано-4-Гидроксикоричная кислота как матрица.
   1. Передача видимых количество пептида в пробки microcentrifuge 1,5 мл и растворить его в 10 мкл раствора 37 мм α- циано-4-Гидроксикоричная кислоты в смеси 0,1% TFA H₂O/MeCN (1:1).
   2. Вихревой решение для 10 s, применяются 2 мкл пример ректифицированной стали мишенью и просушите образца.
   3. Используйте режим отражатель для измерения и пептида эталоном для молярной массы ниже 6000 г/моль.
3. Iodoacetamide деривации
   Примечание: Как iodoacetamide реагирует с тиоловых групп, iodoacetamide деривации пептидов указывает бесплатные тиоловых групп. Следовательно отсутствие свободного тиоловых групп служит реакции управления через МС при окислении 1^st .
   1. Растворите пептида в 10 мм фосфатного буфера (100 мкл; 0,05 мм; рН 7,8) в пробки microcentrifuge 1,5 мл. 100 мкл iodoacetamide в 10 мм фосфатного буфера (4 мм) в решение пептида и осторожно встряхивайте реакции втечение 2 ч при комнатной температуре в темноте. Freeze-Dry реакционной смеси и хранить его при-20 ° C.
   2. Использовать наконечник пипетки C18-концентрация фильтр и условие кончик с 10 мкл 80% (3 раза), 50% (3 раза), 30% (3 раза) и 0% (3 раза) MeCN в H₂O (+ 0,1% TFA).
   3. Распустить образца с шагом 0.1% 6.3.1 в 1 мкл TFA H₂O и добавить решение в наконечник пипетки фильтра. Пипетка тщательно вверх и вниз так, что пептид связывается с борта. Удаление H₂O из кончика пипетки и промойте наконечник пипетки фильтр с 10 мкл 0,1% TFA H₂O.
   4. 2 мкл 0,1% TFA в H₂O/MeCN (1:1) с другой кончиком пипетки (без фильтра) на вершине шарик, который содержит пептида. Применить фильтрата в Целевой земли стали и просушите образца.
   5. Примените 1 мкл раствора 37 мм α-циано-4-Гидроксикоричная кислоты в смеси 0,1% TFA в H₂O/MeCN (1:1)-шлифованная сталь целевой с образцом и просушите образца.
   6. Используйте режим отражатель для измерения и пептида эталоном для молярной массы ниже 6000 г/моль.
4. Амино кислоты анализ
   Примечание: Анализ точный пептид концентрации, а также аминокислотный состав с помощью анализатора аминокислоты пептида.
   1. Передать пробки microcentrifuge 1,5 мл 100 мкг чистого пептида (2604 г/моль; 0,04 мкмоль) и растворить порошок в 200 мкл 6 М HCl.
   2. Перевести 200 мкл раствора в стеклянных ампул и промыть пробки microcentrifuge 1,5 мл два раза с 200 мкл 6 М HCl. передачи промывной раствор в стеклянные ампулы также.
   3. Закройте ампулы, Отопление шейку ампулы с пламенем горелки Бунзена. Поместите ампулу в стеклянной трубки. Поместите его в блоке Отопление за 24 ч при 110 ° C для гидролиза.
   4. Откройте ампулы и передача решения в 2-мл пробирку microcentrifuge. Вымойте ампулы (3 x 200 мкл) и крышку (3 x 100 мкл) с двойной дистиллированной H₂O и перевести его в пробки microcentrifuge.
   5. Центрифуга решение для 6 ч, при 60 ° C и 210 g x в ротационные вакуумные концентратор. Распустить гидролизованный продукт в 192 мкл буфера для разведения образцов (200 мкм) и перенесите решения в микро центробежного фильтра.
   6. Центрифуга образца за 1 мин на 2300 x g и передачи 100 мкл фильтрата в трубу аминокислот анализа образца. Положите трубку в Аминокислотный анализатор и начинайте анализ. Амино кислоты стандарт используется для калибровки.

7. МС/МС анализ дисульфида подключения

1. Частичное уменьшение и алкилирования¹⁷
   1. Распустить 600 мкг чистого пептида (2604 г/моль; 0.23 мкмоль) в 1,2 мл буфера цитрата 0,05 М (рН 3.0; концентрация пептида 0,14 мм) содержит 7,5 мг tris(2-carboxyethyl) фосфин (TCEP; 0,02 М; 0,03 ммоль).
   2. Инкубировать смесь при комнатной температуре и занять несколько реакции контрольные образцы (100 мкл) от 0 мин до 30 мин.
   3. Смешать с 300 мкл буфера алкилирования образцы в пробки microcentrifuge 1,5 мл (0,5 М трис ацетат; рН 8,0; 2 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА); iodoacetamide 1,1 М) остановить реакции и выполнять carbamidomethylation бесплатно тиоловых групп.
   4. Остановить реакции через 5 мин, добавив 100 мкл 10% TFA (H₂O) и хранить образцы на сухой лед. Подготовить образцы ВЭЖХ, как описано в шаге 6.1.2 и залить 400 мкл. (рисA)
   5. Используйте систему градиента элюции 0,1% TFA в H₂O (элюента A) и 0,1% TFA в MeCN (элюента B). Анализировать пептиды, используя комбинацию Изократические разделения (элюента B 10% за 15 мин) и затем последующие градиент 10-35% элюента B свыше 25 мин потока со скоростью 10 мл/мин обнаруживать пиков на 220 Нм.
   6. Сбор фракций в 1,5 мл microcentrifuge трубы и freeze-dry пептидов. (Рис. 2B)
   7. Небольшое количество каждой фракции передать трубку microcentrifuge 1,5 мл для анализа МС/МС окисленных форм (перейдите к шагу 7.1.12).
   8. Распустить оставшиеся пептида (10-100 мкг) в 0,1% TFA H₂O (10-50 мкл) и добавить соответствующий объем 100 мм TCEP раствора (H₂O) для получения конечной концентрации TCEP 10 мм.
   9. Инкубируйте реакции на 1 ч при 37 ° C (рис. 2C). Freeze-Dry реакционной смеси и хранить его при-20 ° C.
   10. Подготовка образцов МС/МС, как описано в шаге 6.3.2-6.3.5.
   11. Выполнения измерений МС/МС на MALDI TOF/TOF масс-спектрометр. МС/МС крышкой (лазерно индуцированным распада) для фрагментации пептида и выберите прекурсоров массы 2 - и 4-раз carbamidomethylated видов. Обрабатывать и оценивать MALDI данные для подтверждения подключения нужного дисульфида.

8. ЯМР экспериментов и анализ структуры

1. Растворение приблизительно 0,3-2 мг чистый пептид продукта в 500 мкл₂наружного H₂O (цвету) и передача смеси в NMR Микропробирка.
2. Подготовка образца для измерений на ЯМР-спектрометр
3. Запись 2-мерных [¹H,¹H] - DQF - уютный (двойной квантовой фильтруют спектроскопии корреляции), [¹H,¹H] - TOCSY (всего коррелированных спектроскопия), [¹H,¹H] - NOESY (ядерных Оверхаузера повышение спектроскопия) и [¹H,¹³C]-спектры HSQC (гетероядерных одного такта согласованности), с использованием воды подавление.
4. Назначьте Протон резонансы записанные спектров и Создайте назначение атом из спектров NOESY. Сравнение интенсивностей в спектрах NOESY чтобы задать верхний предел расстояния ограничений между различными атомами в пептида. Используйте интенсивность зародышевых протонов для калибровки пика интенсивности.
5. Выполните вычисление структуры и уточнение с помощью компьютерной программы для молекулярной визуализации и выявленных дисульфида связность шаг 7 как дополнительные удерживающие устройства (рис. 3).
6. Выберите структур с низкой энергией и использовать его для моделирования молекулярной динамики (MD).

Результаты

15 различных мост дисульфидных изомеров PIIIA µ-conotoxin синтезированы и характеризуется в деталях (рис. 1). Дисульфидными облигаций определяются путем частичного сокращения и последующего анализа МС/МС (рис. 2). (Рис. 3) выявить о...

Обсуждение

Метод, описанный здесь для синтеза пептидов хвоща богатые, такие как µ-PIIIA представляет возможность производить избирательно дисульфида стружечные изомеров от такую же последовательность аминокислот. Таким образом созданы такие методы, как на основе Fmoc твердых этапа пептидного синте?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fmoc Rink amide resin	Novabiochem	855001
Pyr(Boc)	Bachem	A-3850
Arg(Pbf)	Iris Biotech	FSC1010
Asn(Trt)	Bachem	B-1785
Asp(tBu)	Iris Biotech	FSP1020
Hyp(tBu)	Iris Biotech	FAA1627
Lys(Boc)	Bachem	B-1080
Ser(tBu)	Iris Biotech	FSC1190
Gln(Trt)	Iris Biotech	FSC1043
Glu(tBu)	Iris Biotech	FSP1045
Trp(Boc)	Iris Biotech	FSC1225
Tyr(tBu)	Sigma Aldrich	47623
Thr(tBu)	Iris Biotech	FSP1210
His(Trt)	Iris Biotech	FDP1200
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat	Sigma Aldrich	8510060	Flammable
DMF	Fisher Scientific	D119	Flammable, Toxic
DCM	Fisher Scientific	D37	Carcinogenic
Piperidine	Alfa Aesar	A12442	Flammable, Toxic, Corrosive
N-Methyl-Morpholin	Sigma Aldrich	224286
Cys(Acm)	Iris Biotech	FAA1506
Cys(Trt)	Bachem	E-2495
Cys(tBu)	Bachem	B-1220
trifluoruacetic acid	Sigma Aldrich	74564	Toxic, Corrosive
phenol	Merck	1002060	Toxic
thioanisol	Alfa Aesar	A14846
ethanedithiol	Fluka Analytical	2390
diethyl ether	VWR	100,921	Flammable
tert-butanol	Alfa Aesar	L12338	Flammable
acetonitrile	Fisher Scientific	A998	Flammable
water	Fisher Scientific	W5
isopropanol	VWR	ACRO42383	Flammable
sodium hydroxide	AppliChem	A6579,1000	Corrosive
iodoacetamide	Sigma Aldrich	I6125
iodine	Sigma Aldrich	I0385
Hydrochloric acid	Merck	110165	Corrosive
ascorbic acid	Sigma Aldrich	A4403
diphenylsulfoxide	Sigma Aldrich	P35405
anisol	Sigma Aldrich	96109	Flammable
trichloromethylsilane	Sigma Aldrich	M85301	Flammable
sample dilution buffer	Laborservice Onken
sodium dihydrogen phosphate	Sigma Aldrich	106370
disodium hydrogen phosphate	Sigma Aldrich	795410
(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma Aldrich	C4706
citric acid	Sigma Aldrich	251275
sodium citrate dihydrate	Sigma Aldrich	W302600
tris-acetate	Carl Roth,	7125
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma Aldrich	E26282
peptide calibration standard II	Bruker Daltonics GmbH	8222570
Name of Equipment	Company
solid-phase peptide synthesizer	Intavis Bioanalytical Instruments AG	EPS 221
lyophilizer	Martin Christ GmbH	Alpha 1-2 Ldplus
semipreparative HPLC	Jasco	system PV-987
Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm)	Knauer	25QE181E2J	purification of the linear peptide
Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm)	Hichrom-VWR	HICH218TP1022	purification of the oxidized peptide
analytical HPLC	Shimadzu	system LC-20AD
Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm)	Hichrom-VWR	HICH218TP54	analytical column
ground steel target (MTP 384)	Bruker Daltonics GmbH	NC0910436	MALDI preparation
C18-concentration filter (ZipTip)	Merck KGaA	ZTC18S096	MALDI preparation
MALDI mass spectrometer	Bruker Daltonics GmbH	ultraflex III TOF/TOF
amino acid analyzer	Eppendorf-Biotronik GmbH	LC 3000 system
NMR spectrometer Bruker Avance III	Bruker Daltonics GmbH	Bruker Avance III 600 MHz
computer program for molecular visualising	YASARA Biosciences GmbH	Yasara structures	NMR structure calculation
computer program for MALDI data evaluation	Bruker Daltonics GmbH	flexAnalysis, BioTools	MS/MS fragmentation
analog vortex mixer	VWR	VM 3000
Microcentrifuge	Eppendorf	5410
Centrifuge	Hettich	EBA 20
Rotational vacuum concentrator	Christ	2-18 Cdplus
Analytical Balance	A&D Instruments	GR-202-EC