합성 및 다른 아 황산 연결 된 μ-Conotoxin PIIIA이 성체의 구조 결정

요약

시스테인 부유한 펩 티 드 그들의 이황화 연결에 따라 고유한 3 차원 구조로 접어. 개별 이황화가 성체의 타겟된 합성 필요한 때 버퍼 산화 원하는 이황화 연결 리드 하지 않습니다. 프로토콜 선택 합성 펩 티 드 3 이황화 결합 그리고 NMR 및 MS/MS를 사용 하 여 그들의 구조 분석을 다루고 있다.

초록

펩 티 드 시스테인의 높은 숫자는 일반적으로 영향을 3 차원 구조에 관한 그들의 이황화 연결. 따라서 펩 티 드 종합, 동안 원치 않는 이황화 유대 형성을 피하기 위해 매우 중요 한 완전히 다른 펩 티 드 구조 될 수 있기 때문에 고 따라서 bioactivity를 변경. 그러나, 여러 개의 이황화 결합 펩 티 드의 올바른 형성 여러 이황화 연결 형성 될 수 있기 때문에 기존의 버퍼 산화 프로토콜 등 표준 자체 접는 방법을 사용 하 여 얻을 수 어렵습니다. 이 프로토콜은 여러 개의 이황화 다리 펩 티 드의 높은 품질과 수량에 버퍼 산화를 통해 종합 될 수 없는 어떤 대상된 합성에 필요한 고급 전략을 나타냅니다. 연구 타겟 방식에서 µ-conotoxin PIIIA의 모든 가능한 3 이황화 결합 펩 티 드가 성체의 합성에 대 한 뚜렷한 보호 그룹 전략의 응용 프로그램을 보여 줍니다. 펩 티 드 Fmoc 기반 단단한 단계 펩 티 드 종합 보호 그룹 전략을 사용 하 여 정의 된 이황화 결합 형성에 대 한에 의해 준비가 되어 있습니다. 시스테인의 각각 쌍 trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm)와 tert보호-있는지 확인 하는 모든 산화 단계 동안 필요한 시스테인은 deprotected 연결 그룹 부 틸 (t부) 보호. 대상된 종합 뿐만 아니라 여러 분석 방법의 조합이 올바른 병풍을 원하는 펩 티 드 구조의 세대를 명확 하 게 사용 됩니다. 다른 3 이황화 결합이 성체의 비교가 나타냅니다 이황화 연결의 3 차원 구조 계산 및 생물학의 해석에 대 한 지식과 정확한 결정의 중요성 펩 티 드가 성체의 활동입니다. 분석 특성 포함 적응된 프로토콜을 제작한 그대로 펩 티 드가 성체의 부분적으로 감소 하 고 alkylated 파생 상품으로 수행 되는 탠덤 질량 분석 (MS/MS) 분석을 통해 정확한 이황화 본드 설명 합니다. 또한, 펩 티 드 구조는 2 차원 핵 자기 공명 (NMR) 실험 및 MS/MS 분석에서 얻은 지식을 사용 하 여 결정 됩니다.

서문

제약 연구 및 개발에 생리 활성 펩 티 드를 사용 하 여 매우 그들은 특정 생물 학적 목표¹에 대 한 강력 하 고 매우 선택적인 화합물을 대표 하기 때문에, 인식 된다. 그러나 그들의 bioactivity에 대 한, 3 차원 구조는 중요성의 구조 활동 관계 연구^2,,34를 수행 하려면. 전체 구조에 영향을 미치는 기본 아미노산 시퀀스, 떨어져 이황화 결합 크게 시스테인 부유한 펩 티 드⁵의 구조를 안정화 합니다. 여러 개의 이황화 다리 펩 티 드 conotoxins µ-PIIIA의 순서로 6 시스테인 포함 Conus purpurascens 에서 같은 포함 됩니다. 이 높은 시스테인 콘텐츠는 이론적으로 15 이황화가 성체의 대형을 허용 한다. 올바른 이황화 연결 생물 학적 활동^6,7에 대 한 매우 중요 하다. 그러나, 발생 하는 문제는 자연스럽 게 발생 펩 티 드의 경우, 그이 성체 중 가장 높은 생물 학적 활동을가지고 더 이상의 생리 구조 인지? Μ-conotoxins의 경우 생물 학적 목표 전압 개폐 나트륨 이온 채널, 그리고 μ-PIIIA 특히 하위 나_V1.2, 나에 대 한 가장 강력한_V1.4와 Na_V1.7³.

다양 한 방법을 사용 하 여 이황화 다리 펩 티 드의 종합을 얻을 수 있습니다. 펩 티 드 내의 이황화 결합의 대형을 위한 가장 편리한 방법은 소위 산화 자체 접는 방법입니다. 여기, 원하는 주기적인 펩 티 드의 선형 전조 먼저 고분자 지원에서 분열 산화 버퍼 시스템에 들어서는 후 단단한 단계 펩 티 드 종합을 사용 하 여 합성 됩니다. 감소와 산화 glutathione (GSH/GSSG) 같은 산화 활성 에이전트는 종종 이황화 결합의 형성을 촉진에 추가 됩니다. 폴딩 자체 버퍼 지원의 주요 단점은 이황화 결합 stepwise 방식에서 선택적으로 형성 하지는. 종종 하나의 특정 이황화 이성질체 설명, 네이티브 펩 티 드에 비해이 방법은⁸수많은 다른이 성체를 가능 하다. Μ-PIIIA 이미 적어도 3 개의 다르게 접힌된이 성체 자체는 이전 연구³폴딩 시에 결과를 보였다. 이러한 이성질체 혼합물의 분리는 컬럼에 정화 방법⁹을 사용 하는 경우 비슷한 보존 시간으로 인해 오히려 어렵습니다. 특정 이성질체의 타겟된 합성은 따라서 유리 하다. 정의 된 이황화 연결, 특별 한 전략으로 이성질체는 이황화는 채권에 필요한 구체적으로 생산 하는 연속적으로 닫힌다. 따라서, 개별 시스테인 쌍에 개별 보호 그룹을 들고 선형 전조 폴리머 지원에 합성 됩니다. 후 제거, 시스테인 쌍 개별적으로 연속적으로 deprotected 고 원하는 이황화 채권^10,,1112,13, 를 생성 하는 산화 반응에 연결 ^{14 , 15 , 16}. 합성 반응 제품의 정화 후에, id 및 이황화 연결 확인에 필요한 적합 한 분석 방법. 수많은 분석 방법 기본 아미노산 순서, 예의 설명에 사용할 수 있습니다., MS/MS, 아 황산 연결의 결정 아직도 훨씬 적은 조사 남아 있는 동안. 이러한 여러 개의 이황화 결합 펩 티 드, 제품 관련 불순물의 복잡성은 그렇다 하 고 (예., 이황화 출 격에서), 때문에 샘플 준비 및 작업 업 수 더 복잡 하 게 분석. 이 논문에서는, 우리는 다른 분석 기술 조합의 사용은 명백 하 게 μ-PIIIA이 성체의 이황화 결합의 정체성을 명확히 하는 데 필요한 표시 됩니다. 우리 크로마 방법 질량 분석으로 결합 하 고 NMR 분광학에 동일한 샘플 제공. 매트릭스 보조 레이저 desorption/ionization(MALDI) MS/MS 분석, 우리는 불가능 하기 때문에 하향식 분석이 펩 티이 드에 대 한 부분적인 감소 및 iodoacetamide derivatization를 사용 하 여 이황화 채권 확인. 2 차원 NMR 실험은 각이 성체의 3 차원 구조를 얻기 위하여 수행 했다. 따라서, 결합 하 여 독특한 정교한 분석 방법, 그것은 명료 하 게 제대로 이황화 연결 및 복잡 한 3 차원 구조의 여러 이황화 결합 펩 티 드⁷수 있습니다.

프로토콜

참고: 여기서 사용 하는 모든 아미노산 L-구성에 있었다. 아미노산 및 아미노산 유도체의 약어 IUB의 전문 어 위원회 및 생 화 확 적인 전문 어에 IUPAC IUB 합동 위원회의 권장 사항에 따라 사용 되었다.

1. 단단한 단계 펩 티 드 합성 (SPPS)

참고: 단단한 단계 펩 티 드 합성기와 합성을 수행. ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH₂ 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) 화학에 대 한 표준 프로토콜을 사용 하 여 일반적인 시퀀스의 선형 펩 티 드 유도체의 합성을 수행 합니다. 다음 보호 된 아미노산을 적용: Pyr (Boc (tert-butyloxycarbonyl)), Arg (Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl)), Asn(Trt), Asp(tBu), Hyp(tBu), Lys(Boc), Ser(tBu), Gln(Trt), Glu(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), Thr(tBu), 및 그의 (Trt)입니다. Trt, Acm 또는 t부 그룹 시스테인 쌍 의도 이황화 연결에 따라 보호 합니다.

1. 준비
   1. Fmoc 링크-아 미드 수 지를 건조 (로드: 0.28 m m o l/g)는 lyophilizer를 사용 하 여 하룻밤.
   2. 합성기의 프로그램으로 원하는 펩 티 드 순서 (1 문자 코드)를 입력 합니다. 프로그램은 모든 개별 시 필요한 금액을 계산 하 고 용 매 수량을 나타냅니다.
   3. 프로토콜에 따라 개별 시 약 (아미노산, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) 무게 하 고 2.4 M (아미노산)와 0.6 M (의 최종 농도에 그들을 dimethylformamide (DMF)에 용 해 HBTU), 각각.
   4. 다른 시 약을 전송 (아미노산, HBTU, N-methylmorpholine (NMM, DMF에 50%), piperidine DMF에 (20%), DMF, dichloromethane (DCM)) 해당 선박에 단단한 단계 펩 티 드 합성기의 적절 한 라켓에 그들을 배치.
   5. 반응 열에 건조 수 지의 100 mg을 추가 하 고 합성기의 라켓에 넣어. 단단한 단계 펩 티 드 합성을 시작 합니다.
2. SPPS 프로토콜 (합성기에 의해 제공)
   참고: 프로토콜 적용 수 지의 100 밀리 그램 (로드: 0.28 m m o l/g) 28 µmol 규모에 대 한 하나의 반응 열에 추가.
   1. 수 지의 준비
      1. DMF, 1400 µ L의 DCM와 DMF의 µ L 1400의 2500 µ L로 수 지를 헹 구 십시오.
      2. 용 매 제거 될 때까지 공기를 가진 수 지를 플러시 고 DMF의 2500 µ L로 수 지를 헹 굴.
   2. Fmoc 그룹 보호의 분열
      1. DMF에 20 %piperidine 추가 (1000 µ L) 수 지와 6 분에 대 한 대기에 수 지에서 솔루션을 제거. 1.2.2.1 단계를 반복 합니다.
      2. DMF (1^세인트 4000 µ L, 2^nd1400 µ L)으로 두 번 린스, 용 매 제거 될 때까지 공기를 가진 수 지를 플러시를 DMF의 2000 µ L로 두 번 씻어.
   3. 커플링 반응
      1. 별도 유리병에 다음과 같은 시 약을 혼합: HBTU (450 µ L, DMF에 0.6 M, 270 µmol; 9.6 식), NMM (125 µ L, DMF에 50%, 568 µmol; 20 식), Fmoc 아미노 산 (420 µ L, DMF에 2.4 M, 1.01 mmol; 36 식). 수 지에 혼합을 추가 하 고 13 분 제거 수 지에서 솔루션에 대 한 기다립니다. 1.2.3.1 단계를 반복 합니다.
      2. DMF의 3000 µ L 씻어. DMF의 1400 µ L로 두 번 세척. DMF의 2000 µ L로 두 번 세척.
      3. 1.2.2, 1.2.3 펩 티 드 순서에서 아미노산의 수에 따라 단계를 반복 합니다.
   4. 최종 Fmoc 절단, 수 지 세척
      1. DMF에 20 %piperidine 추가 (1000 µ L) 수 지와 6 분에 대 한 대기에 수 지에서 솔루션을 제거. 1.2.4.1 단계를 반복 합니다.
      2. DMF (1^세인트 4000 µ L, 2^nd 1400 µ L)으로 두 번 헹 구 고 어와 수 지를 플러시. DCM의 1400 µ L와 4 번의 DMF, 2000 µ L로 두 번 헹 구 고 어로 두 번 플러시.
3. 일 업
   1. 열 하룻밤 완료 되 면 합성 반응에서 수 지 lyophilize

2. 펩 티 드 분열 (그림 1A) 수 지에서

참고: 절단 절차 동안 Cys(Acm) 및 Cys (t부)를 제외한 모든 아미노산 사이드 체인 deprotected 것입니다. 프로토콜은 수 지의 100 밀리 그램에 적용 됩니다.

1. 12 ml 튜브에 동결된 수 지를 결합 하 고 얼음에 0 ° C에 냉각.
2. 수 지에 얼음에 150 µ L (0.75 g 페 놀, 0.5 mL thioanisole, 0.25 mL ethanedithiol에서 준비) 폐품 혼합물의 및 trifluoroacetic 산 (TFA, 물 (H2O)에서 95%)의 1 mL를 추가 합니다. 실 온에서 3 h 동안 부드럽게 흔들어 둡니다.
3. 유리 frit 통해 혼합물을 필터링 하 고 개별적으로 가득 차가운 diethyl 에테르 (diethyl 에테르의 8-10 mL 당 분열 혼합물의 1 mL) 튜브에 filtrate 수집. 펩 티 드 흰색 고체로 침전.
4. 필터 케이크 추가 TFA (95% H₂O, 약 1-3 mL)와 린스.
5. 튜브 침전을 포함 하 고 원심 (3400 x g) 1 분 동안 정지, 가만히 따르다는 상쾌한 닫고 차가운 diethyl 에테르의 8-10 mL와 펠 릿을 세척 합니다. 3 번이이 단계를 반복 합니다.
6. 펠 릿 diethyl 에테르의 남아 있는 흔적을 제거 하 5 분에 대 한 스 토퍼 없이 서 둡니다. Tert의 1 mL에 원유 제품 펠 릿을 분해-butanol (80% H₂O). 펩 티 드 (-80 ° C) freeze-dry

3. 반 대리점 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)와 선형 전조의 정화

참고: 반 대리점 반전된 위상 (RP) HPLC C18 열을 장착 하 여 원유 펩 티 드를 정화 (5 µ m 입자 크기, 100 Å의 기 공 크기, 250 x 32 m m)와 3.6 mL 주입 루프. 0.1% TFA H₂O (eluent A) 및 0.1%의 그라데이션 차입 시스템을 사용 하 여 TFA 이기 (MeCN) /H₂O (9:1, eluent B). 220에서 봉우리를 감지 nm.

1. 15 mL 튜브에 원유 펩 티 드의 약 70 mg을 추가 하 고 HPLC 샘플 루프의 볼륨 있는 단단한 펩 티 드를 분해 (예., 3.6 mL). 0.1%의 혼합물을 사용 하 여 TFA MeCN/H₂O (1:1). 까지 소용돌이 해산 및 분리기 (3400 x g) 1 분 솔루션 작성.
2. 5 mL 주사기에 샘플 (3.6 mL)를 인출 하 고 어떤 기포 없이 샘플을 주입 루프 주입. HPLC 시스템에 삽입할. 펩 티 드 혼합물을 10 mL/min의 유량에서의 0-50% eluent B 120 분 이상 그라디언트를 사용 하 여 구분 합니다.
3. 표시 되는 대로 개별 튜브에서 분수를 수집 합니다. 실행 완료 되 면, 질량 분석 (MS)와 HPLC 분석 (6.1-6.2 단계) 선택한 분수를 준비 합니다. Freeze-dry 분수와-20 ° c.에서 그들을 저장합니다
4. MS와 HPLC 분석 후 선형 펩 티 드의 순수 분수를 결합 하 고 첫 번째 산화에 대 한 샘플을 준비 합니다.

4. 선택적 형성 이황화 결합의

1. 1 ^세인트 산화 (그림 1B)
   참고: 수 지에서 펩 티 드 분열 동안에 Cys(Trt)는 deprotected, 이후 첫 번째 이황화 결합을 형성 하기 위하여 산화 대상이 두 보호 Cys 잔류물을 선도. 다음 프로토콜 선형 순화 된 펩 티 드의 15 mg에 적용 (2864.5 g/mol; 5.2 µmol; 1 식).
   1. 선형 펩 티 드 (15 mg) (1:2; 0.05 m m 수산화 나트륨 (NaOH)으로 조정 되는 pH 8.5)는 소 프로 파 놀/H₂O-혼합물의 105 mL에 녹이 고 부드럽게 12-48 h에 대 한 기본적인 조건 하에서 공기에 떨고 떠나.
   2. HPLC와 양 확인 첫 번째 다리의 형성을 통해 산화 반응 iodoacetamide (IAA) derivatization (6 단계)에 의해 모니터링 합니다.
   3. 펩 티 드 freeze-dry 고 2^nd 산화 더 정화 없이 그것을 사용 합니다.
2. 2^{노스다코타} 산화 (그림 1C)
   참고: 두 번째 산화 동안 Acm 보호 시스테인의 deprotection와 두 번째 다리의 형성은 촉매 요오드에 의해. 1^세인트 산화 후 펩 티 드의 15 mg에 적용 하는 프로토콜 (2862.5 g/mol; 5.2 µmol; 1 식)
   1. 소 프로 파 놀/H₂O/1 M 염 산 (HCl) 혼합물 (80:12.5:7.5)의 105 ml (15 mg, 0.05 m m의 최종 농도) 펩 티 드를 분해.
   2. 메탄올 (MeOH)에서 0.1 M 요오드 솔루션의 158 µ L를 추가 (15.7 µmol; 3 식) 솔루션에. 3-52 h, 즉상 온에서 반응 저. 산화 완료 될 때까지.
   3. HPLC와 양 확인 두 번째 이황화 결합의 대형을 통해 산화 반응 iodoacetamide (IAA) derivatization (6 단계)에 의해 모니터링 합니다.
   4. H₂O 1 M ascorbic 산 솔루션의 79 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 (78.8 µmol; 15 식). 반응 혼합물을 freeze-dry 고 3^rd 산화 분말을 사용 합니다.
3. 3^rd 산화 (그림 1D)
   참고: 마지막 산화 t부 보호 시스테인의 deprotection 하 고 세 번째 이황화 다리의 형성으로 이끌어 낸다. 2^{노스다코타} 산화 후 펩 티 드의 15 mg에 적용 하는 프로토콜 (2718.3 g/mol; 5.5 µmol; 1 식).
   1. TFA의 5.5 ml에서 (15 mg, 1 mM의 최종 농도) 펩 티 드를 분해. 그것은 diphenylsulfoxide의 11.2 mg의 구성 된 폐품 혼합물 포함 (55 µmol; 10 식), 60.2 anisole의 µ L (0.6 m m o l; 100 식) 및 trichloromethylsilane의 97.2 µ L (0.8 m m o l; 150 식). 실 온에서 3-5 h의 혼합물을 저 어.
   2. HPLC와 양 확인 3 이황화 결합의 대형을 통해 산화 반응 iodoacetamide (IAA) derivatization (6 단계)에 의해 모니터링 합니다.
   3. 차가운 diethyl 에테르 (0 ° C, 반응 솔루션 diethyl 에테르의 8-10 mL 당 1 mL)을 포함 하는 튜브에 펩 티 드를 침전.
   4. 원심 (3400 x g, 1 분) 정지, 상쾌한, 가만히 따르다 고 씻어 펠 릿 반복 (4 회) 찬 diethyl 에테르 (0 ° C)의 8-10 mL와 함께. 펠 릿 건조 한 공기 (3 분)에 게.
   5. 80% tert의 1 mL에 펠 릿을 분해-(H₂O), butanol 펩 티 드 freeze-dry 및-20 ° c.에 그것을 저장

5. 펩타이드 정화

참고: 세미 preparative RP HPLC 장비 C18 열에 의해 산화 펩 티 드를 정화 (10 µ m 입자 크기 300 Å의 기 공 크기, 250 x 22 m m)와 3.6 mL 주입 루프. 0.1% TFA H₂O (eluent A) 및 0.1%의 그라데이션 차입 시스템을 사용 하 여 TFA MeCN/H₂O (9:1, eluent B). 220에서 봉우리를 감지 nm.

1. 15 mL 튜브를 단계 4.3.5에서에서 동결된 원유 제품의 15 mg을 추가 합니다. HPLC 샘플 루프의 원유 제품 분해 (예., 3.6 mL). 0.1%의 혼합물을 사용 하 여 TFA MeCN/H₂O (1:1). 까지 소용돌이 해산 및 분리기 (3400 x g) 1 분 솔루션 작성.
2. 5 mL 주사기에 3.6 mL 혼합물을 인출 하 고 어떤 기포 없이 샘플을 주입 루프 주입. HPLC 시스템으로 주사를 시작 합니다. 10 mL/min의 유량에서의 0-50% eluent B 120 분 이상 그라디언트를 사용 하 여 펩 티 드 혼합물을 정화.
3. 표시 되는 대로 개별 튜브에서 분수를 수집 합니다. 실행 완료 된 후 MS와 HPLC 분석 (6.1-6.2 단계) 선택한 분수를 준비 합니다. -20 ° c.에서 그들을 저장 하 고 모든 분수 freeze-dry
4. 실행 완료 된 후 MS와 HPLC 분석 (6.1-6.2 단계) 선택한 분수를 준비 합니다. -20 ° c.에서 그들을 저장 하 고 모든 분수 freeze-dry

6. 펩 티 드 분석

1. 분석 HPLC
   참고: C18 열을 갖추고 분석 RP HPLC에 의해 펩 티 드의 순도 확인 (5 µ m 입자 크기 300 Å의 기 공 크기, 250 x 4.6 m m)와 500 µ L 주입 루프. 0.1% TFA H₂O (eluent A) 및 0.1%의 그라데이션 차입 시스템을 사용 하 여 TFA MeCN (eluent B)에서. 220에서 봉우리를 감지 nm.
   1. 펩 티 드 분수의 샘플을 전송 또는 반응 제어를 HPLC로 유리병 및 0.1%의 혼합물에 그것을 녹 TFA MeCN/H2O (1:1, 300-500 µ L)에서. 분석 RP HPLC의 autosampler로 HPLC 유리병을 놓습니다.
   2. 각 샘플의 250 µ L을 주입. 0.1% TFA H₂O (eluent A) 및 0.1%의 그라데이션 차입 시스템을 사용 하 여 TFA MeCN (eluent B)에서. 1.0 mL/min의 유량에서 10 ~ 40% eluent B 30 분 이상의 그라디언트를 사용 하 여 펩 티 드를 정화.
2. MALDI TOF 질량 분석
   참고: MALDI TOF (시간의 비행) 질량 분석 매트릭스로 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산을 사용 하 여 펩 티 드의 id를 확인 합니다.
   1. 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 펩 티 드의 표시 금액을 전송 하 고 37 m m α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 성 솔루션 0.1%의 혼합물에서 10 µ L에 녹 TFA H₂O/MeCN (1:1).
   2. 소용돌이 10 솔루션 s, 지상 강철 대상, 샘플의 2 µ L을 적용 하 고 샘플을 건조.
   3. 반사 기 모드를 사용 하 여 측정 및 펩 티 드 교정 6000 g/mol 아래 어 금 니 질량에 대 한 표준에 대 한.
3. Iodoacetamide derivatization
   참고: iodoacetamide thiol 그룹 반응,으로 펩 티 드의 iodoacetamide derivatization 무료 thiol 그룹을 나타냅니다. 따라서, 무료 thiol 그룹의 부재 1^세인트 산화 동안 MS 통해 반응 제어로 제공합니다.
   1. 10 m m 인산 버퍼 (100 µ L, 0.05 m m, pH 7.8) 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 있는 펩 티 드를 분해. 펩 티 드 솔루션 10 m m 인산 버퍼 (4mm)에 iodoacetamide의 100 µ L을 추가 하 고 부드럽게 어둠 속에서 실 온에서 2 h에 대 한 반응을 흔들. 반응 혼합물을 freeze-dry 하 고-20 ° c.에 그것을 저장합니다
   2. C18-농도 필터 피 펫 팁을 사용 하 고 조건 10 µ L 0%, 30% (3 회), 50% (3 회), 80% (3 회)의 끝에 H₂O (3 회) MeCN (+ 0.1 %TFA).
   3. 0.1%의 단계 6.3.1에서 1 µ L에서 샘플을 분해 H₂O TFA 필터 피 펫 팁에 솔루션을 추가 하 고. 펩 티 드 비드에 바인딩 있도록 위아래로 신중 하 게 플라스틱. H₂O 피 펫 팁을 제거 하 고 필터 피 펫 팁 10 µ L의 0.1%와 린스 TFA H₂o.
   4. 추가 2 µ l의 0.1% TFA H₂O/MeCN (1:1)는 펩 티 드를 포함 하는 구슬 위에 (필터) 없이 다른 피 펫 팁. 지상 강 대상에는 여과 액을 적용 하 고 샘플을 건조.
   5. 0.1% TFA H₂O/MeCN (1:1) 지상 강철 샘플 대상 샘플을 건조의 혼합물에서 37 m m α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 성 솔루션의 1 µ L를 적용 합니다.
   6. 반사 기 모드를 사용 하 여 측정 및 펩 티 드 교정 6000 g/mol 아래 어 금 니 질량에 대 한 표준에 대 한.
4. 아미노산 분석
   참고: 아미노산 분석기를 사용 하 여 펩 티 드의 아미노산 구성으로 정확한 펩 티 드 농도 분석 합니다.
   1. 1.5 mL microcentrifuge 튜브 100 µ g (2604 g/mol; 0.04 µmol) 순수 펩 티 드의 전송 하 고 6 M HCl의 200 µ L에 분말.
   2. 유리 앰 풀으로 솔루션의 200 µ L를 전송 및 린스 1.5 mL microcentrifuge 튜브 두 번 6 M HCl. 200 µ L로 헹 구는 솔루션에 전송 뿐만 아니라 유리 앰 풀.
   3. 분 젠 버너 화 염 앰 풀의 목을가 열 하는 앰 풀을 닫습니다. 유리 튜브에는 앰 풀을 넣어. 가수분해에 대 한 110 ° C에서 24 h에 대 한가 열 블록에 배치.
   4. 앰 풀 열고 솔루션 2 mL microcentrifuge 튜브로 전송 합니다. 앰 풀 (3 x 200 µ L) 및 이중 증 류 H₂O와 모자 (3 x 100 µ L)를 세척 하 고 microcentrifuge 관에 그것을 전송.
   5. 60 ° C 및 회전 진공 집중 장치에서 210 x g 6 h에 대 한 솔루션 원심 샘플 희석 버퍼 (200 µ M)의 192 µ L에서 분해 제품을 녹이 고 마이크로 원심 필터에 솔루션을 전송.
   6. 아미노 산 분석 샘플 튜브에는 filtrate의 g와 전송 100 µ L x 2300에서 1 분에 대 한 샘플을 원심. 아미노산 분석기에 튜브를 놓고 분석을 시작 합니다. 아미노산 표준 보정에 사용 됩니다.

7. MS/MS 분석 아 황산 연결의

1. 부분 감소와 알¹⁷
   1. 600 µ g 0.05 M 구 연산 염 버퍼 (pH 3.0, 0.14 m m 펩 티 드 농도)의 1.2 ml 순수 펩타이드 (2604 g/mol; 0.23 µmol)의 분해의 7.5 mg를 포함 tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP; 0.02 M 0.03 m m o l).
   2. 실내 온도에 혼합물을 품 어 고 여러 반응 제어 샘플 (100 µ L) 0 분에서 30 분까지.
   3. 알 버퍼의 300 µ L 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 샘플 혼합 (0.5 M 트리 아세테이트, pH 8.0; 2 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA); 1.1 M iodoacetamide) 반응을 중지 및 무료 thiol 그룹의 carbamidomethylation 수행.
   4. 10 %TFA (H₂O), 저장의 100 µ L을 추가 하 여 5 분 후 반응을 중지 드라이 아이스에 샘플. 6.1.2 단계에서 설명한 대로 HPLC 샘플을 준비 하 고 주사 400 µ L. (그림 2A)
   5. 0.1% TFA H₂O (eluent A) 및 0.1%의 그라데이션 차입 시스템을 사용 하 여 TFA MeCN (eluent B)에서. 펩 티 드 isocratic 분리 (10% eluent B 15 분)의 조합을 사용 하 여 분석 하 고 10-35% eluent B 10 mL/분의 유량에 25 분 이상의 후속 그라데이션 220에서 봉우리를 감지 하는 다음 nm.
   6. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 분수를 수집 하 고 freeze-dry는 펩 티 드. (그림 2B)
   7. (단계 7.1.12에서 계속) 산화 형태의 MS/MS 분석에 대 한 1.5 mL microcentrifuge 관에 각 분수의 작은 금액을 전송 합니다.
   8. 분해 나머지 펩 티 드 (10-100 µ g) 0.1%에서 TFA H₂O (10-50 µ L) 10 mM의 TCEP 최종 농도를 (H₂O)에서 100 mM의 TCEP 솔루션의 적절 한 볼륨을 추가 하 고.
   9. 37 ° C (그림 2C)에서 1 시간에 대 한 반응을 품 어. 반응 혼합물을 freeze-dry 하 고-20 ° c.에 그것을 저장합니다
   10. MS/MS 샘플 단계 6.3.2-6.3.5에 설명 된 대로 준비 합니다.
   11. MALDI TOF/TOF 질량 분석기에 MS/MS 측정을 수행 합니다. 펩 티 드의 조각화에 대 한 MS/MS 뚜껑 (레이저 유도 붕괴)를 사용 하 고 2-4 번 carbamidomethylated 종의 선구자 대 중 선택. 처리 하 고 원하는 이황화 연결 확인 MALDI 데이터를 평가 합니다.

8. NMR 실험 및 구조 분석

1. 디졸브 약 0.3-2 밀리 그램 순수한 펩 티 드 제품 500 µ L H₂O₂O/D (90: 10)에 NMR microtube에 전송 혼합물의.
2. NMR 분 광 계에서 측정에 대 한 샘플을 준비
3. 레코드 2 차원 [¹H,¹H]-DQF-아늑한 (더블 필터링 양자 상호 관계 분광학), [¹H,¹H]-TOCSY (총 상관된 분광학), [¹H,¹H]-NOESY (핵 Overhauser 향상 분광학), 그리고 [¹H,¹³C]-HSQC (heteronuclear 단일 양자 일관성) 스펙트럼 물 억제를 사용 하 여.
4. 기록 된 스펙트럼의 양자 공명 고 NOESY 스펙트럼에서 원자 할당을 만듭니다. 펩 티 드에 있는 다른 원자 사이 상한 거리 제약 조건을 설정 하려면 NOESY 스펙트럼에 농도 비교 합니다. 새싹 양성자의 강도 사용 하 여 피크 강도 보정에 대 한.
5. 분자 시각화에 대 한 구조 계산 및 컴퓨터 프로그램으로 구체화를 수행 하 고 단계 7의 확인 된 이황화 연결을 사용 하 여 추가 지지대 (그림 3)로.
6. 낮은 에너지 구조를 선택 하 고 그것을 사용 하 여 분자 역동성 (MD) 시뮬레이션.

결과

다른이 15 µ-conotoxin PIIIA 이황화 다리 성체는 종합 하 고 자세히 (그림 1) 특징. 이황화 결합은 부분적인 감소 및 이후 MS/MS 분석 (그림 2)에 의해 식별 됩니다. 다른이 성체의 NMR 분석 (그림 3) 개별 펩 티 드 구조를 나타내기 위해 수행 됩니다. 특히, 라인란트 HPLC, MS/MS 조각화 및 NMR 분석의 결합은 아 황산 연결...

토론

방법 여기에 설명 된 시스테인 부유한 펩 티 드의 합성에 대 한 같은 µ-PIIIA 동일한 아미노산 시퀀스에서 이황화 결합이 성체를 선택적으로 생산 하는 가능성을 나타냅니다. 그러므로, Fmoc 기반 솔리드 같은 펩 티 드 합성¹⁸ 단계 고 이황화 결합의 regioselective 형성에 대 한 정의 된 보호 그룹 전략 사용된¹⁶설립. 단단한 단계 펩 티 드 합성 자동된 합성을 통해 폴리?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fmoc Rink amide resin	Novabiochem	855001
Pyr(Boc)	Bachem	A-3850
Arg(Pbf)	Iris Biotech	FSC1010
Asn(Trt)	Bachem	B-1785
Asp(tBu)	Iris Biotech	FSP1020
Hyp(tBu)	Iris Biotech	FAA1627
Lys(Boc)	Bachem	B-1080
Ser(tBu)	Iris Biotech	FSC1190
Gln(Trt)	Iris Biotech	FSC1043
Glu(tBu)	Iris Biotech	FSP1045
Trp(Boc)	Iris Biotech	FSC1225
Tyr(tBu)	Sigma Aldrich	47623
Thr(tBu)	Iris Biotech	FSP1210
His(Trt)	Iris Biotech	FDP1200
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat	Sigma Aldrich	8510060	Flammable
DMF	Fisher Scientific	D119	Flammable, Toxic
DCM	Fisher Scientific	D37	Carcinogenic
Piperidine	Alfa Aesar	A12442	Flammable, Toxic, Corrosive
N-Methyl-Morpholin	Sigma Aldrich	224286
Cys(Acm)	Iris Biotech	FAA1506
Cys(Trt)	Bachem	E-2495
Cys(tBu)	Bachem	B-1220
trifluoruacetic acid	Sigma Aldrich	74564	Toxic, Corrosive
phenol	Merck	1002060	Toxic
thioanisol	Alfa Aesar	A14846
ethanedithiol	Fluka Analytical	2390
diethyl ether	VWR	100,921	Flammable
tert-butanol	Alfa Aesar	L12338	Flammable
acetonitrile	Fisher Scientific	A998	Flammable
water	Fisher Scientific	W5
isopropanol	VWR	ACRO42383	Flammable
sodium hydroxide	AppliChem	A6579,1000	Corrosive
iodoacetamide	Sigma Aldrich	I6125
iodine	Sigma Aldrich	I0385
Hydrochloric acid	Merck	110165	Corrosive
ascorbic acid	Sigma Aldrich	A4403
diphenylsulfoxide	Sigma Aldrich	P35405
anisol	Sigma Aldrich	96109	Flammable
trichloromethylsilane	Sigma Aldrich	M85301	Flammable
sample dilution buffer	Laborservice Onken
sodium dihydrogen phosphate	Sigma Aldrich	106370
disodium hydrogen phosphate	Sigma Aldrich	795410
(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma Aldrich	C4706
citric acid	Sigma Aldrich	251275
sodium citrate dihydrate	Sigma Aldrich	W302600
tris-acetate	Carl Roth,	7125
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma Aldrich	E26282
peptide calibration standard II	Bruker Daltonics GmbH	8222570
Name of Equipment	Company
solid-phase peptide synthesizer	Intavis Bioanalytical Instruments AG	EPS 221
lyophilizer	Martin Christ GmbH	Alpha 1-2 Ldplus
semipreparative HPLC	Jasco	system PV-987
Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm)	Knauer	25QE181E2J	purification of the linear peptide
Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm)	Hichrom-VWR	HICH218TP1022	purification of the oxidized peptide
analytical HPLC	Shimadzu	system LC-20AD
Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm)	Hichrom-VWR	HICH218TP54	analytical column
ground steel target (MTP 384)	Bruker Daltonics GmbH	NC0910436	MALDI preparation
C18-concentration filter (ZipTip)	Merck KGaA	ZTC18S096	MALDI preparation
MALDI mass spectrometer	Bruker Daltonics GmbH	ultraflex III TOF/TOF
amino acid analyzer	Eppendorf-Biotronik GmbH	LC 3000 system
NMR spectrometer Bruker Avance III	Bruker Daltonics GmbH	Bruker Avance III 600 MHz
computer program for molecular visualising	YASARA Biosciences GmbH	Yasara structures	NMR structure calculation
computer program for MALDI data evaluation	Bruker Daltonics GmbH	flexAnalysis, BioTools	MS/MS fragmentation
analog vortex mixer	VWR	VM 3000
Microcentrifuge	Eppendorf	5410
Centrifuge	Hettich	EBA 20
Rotational vacuum concentrator	Christ	2-18 Cdplus
Analytical Balance	A&D Instruments	GR-202-EC