JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويصف هذا البروتوكول أسلوب المفاضلة بطانية لخلايا القلب السلف. لا سيما وهو يركز على كيف تؤثر على إمكانيات التمايز غشائي تركيز المصل وكثافة البذر الخلية.

Abstract

قد تكون الخلايا السلف القلب (Cpc) الإمكانات العلاجية لتجديد القلب بعد الإصابة. في قلب الثدييات الكبار، Cpc الجوهرية شحيحة للغاية، ولكن تكلفة النقرة موسعة يمكن أن تكون مفيدة للعلاج بالخلايا. شرطا مسبقاً لاستخدامها هو قدرتها على التفريق بطريقة الخاضعة للرقابة في الأنساب القلب المختلفة باستخدام بروتوكولات محددة وتتسم بالكفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، عند التوسع في المختبر ، Cpc المعزولة من المرضى أو نماذج المرض الإكلينيكية قد توفر أدوات البحث المثمر لتحقيق آليات المرض.

الدراسات الحالية استخدام علامات مختلفة لتحديد تكلفة النقرة. ومع ذلك، ليس كل منهم يعبر عن البشر، مما يحد من تأثير متعدية الجنسيات من بعض الدراسات الإكلينيكية. سوف تسمح البروتوكولات التمايز قابلة للتطبيق بغض النظر عن التعبير عزلة تقنية وعلامة لتوسيع موحدة وفتيلة Cpc لغرض العلاج خلية. هنا يصف لنا أن فتيلة من تكلفة النقرة تحت تركيز مصل بقرى الجنين منخفضة (FBS) وخلية منخفض الكثافة ظروف تسهل غشائي التفريق بين استخدام اثنين من الفئات السكانية الفرعية المختلفة من الماوس وفار Cpc-Cpc، نظهر أن laminin أكثر الركيزة مناسبة من فيبرونيكتين لهذا الغرض بموجب البروتوكول التالي: بعد استزراع عن 2-3 أيام في المتوسط بما في ذلك المكملات الغذائية أن الحفاظ على مولتيبوتينسي ومع 3.5% FBS، Cpc هي تبذر في لامينين في < التقاء 60% ومثقف في المتوسط خالية من الملحق بتركيزات منخفضة من FBS (0.1 ٪) لمدة 20-24 ساعة قبل التمايز في متوسطة التمايز بطانية. نظراً لتكلفة النقرة عدد سكان غير متجانسة، تركيزات مصل الدم ومرات الحضانة قد تحتاج إلى تعديلها تبعاً لخصائص يتدنى التصنيف الخاصة بكل منها. ونظرا لهذا، يمكن تطبيقها على أنواع أخرى من تكلفة النقرة، فضلا عن التقنية ويوفر وسيلة مفيدة للتحقيق في إمكانية وآليات للتمايز وكيف أنها تتأثر بالمرض عند استخدام Cpc معزولة عن نماذج المرض كل منهما.

Introduction

دعم الدراسات التي أجريت مؤخرا وجود خلايا السلف القلب المقيم (Cpc) في قلب الثدييات الكبار1،2،3، وتكلفة النقرة يمكن أن يكون مصدرا مفيداً لعلاج الخلايا بعد إصابة القلب4، 5-وباﻹضافة إلى ذلك، Cpc الموسعة قد تقدم نموذجا مثمرا لفحص المخدرات والتحقيق في آليات المرض عند معزولة من مرضى القلب نادرة، أو من المرض كل نماذج6،7.

Cpc معزولة عن قلب الكبار تمتلك الجذعية/السلف خلية الخصائص1،2،،من38 كما مولتيبوتينت، كلونوجينيك، ولديها القدرة على التجدد الذاتي. ومع ذلك، هناك العديد من السكان مختلفة (الفرعية) لتكلفة النقرة نستعرض الملامح ماركر السطحية المختلفة، بما في ذلك، على سبيل المثال، ج-كيت، 1 هيئة الأوراق المالية، وغيرها، أو استردادها بواسطة تقنيات العزل المختلفة (الجدول 1). وكانت عدة بروتوكولات الثقافة والتمايز المنشأة1،2،،من89،10،،من1112، 13،،من1415،16،،من1718. وتختلف هذه البروتوكولات معظمها يتعلق بعامل النمو ومحتوى مصل الدم، التي يتم تعديلها وفقا للغرض من استزراع والتي يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في النتائج والنتائج، بما في ذلك كفاءة التمايز.

تقنيات العزل القائم على علامة:

Cpc يمكن عزل استناداً إلى علامة سطحية محددة تعبير1،2،،من89،10،11،12،13 ،14،،من1516،،من1718. تشير الدراسات السابقة إلى أن ج-كيت والهيئة-1 قد تكون علامات أفضل لعزل المقيم Cpc1،،من1114،،من1920. نظراً لأن أيا من هذه العلامات محددة حقاً لتكلفة النقرة، عادة ما يتم تطبيق تركيبات من علامات مختلفة. على سبيل المثال، حين Cpc التعبير عن مستويات منخفضة من مجموعة ج21، ج-كيت أيضا أعرب عن سائر أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا ماست22،23من خلايا بطانية، و الخلايا الجذعية المكونة للدم/السلف24. وهناك مشكلة إضافية هي حقيقة أن ليس كل علامات يتم التعبير عنها عبر جميع الأنواع. وهذا هو الحال بالنسبة للهيئة-1، الذي يعرب بالماوس ولكن ليس في الإنسان25. ولذلك، استخدام البروتوكولات التي تكون مستقلة عن علامات العزلة قد يكون من المفيد النظر إلى التجارب السريرية والدراسات باستخدام عينات بشرية.

تقنيات عزل علامة مستقلة:

وهناك العديد من التقنيات الرئيسية لعزل الحزب الشيوعي الصيني، التي هي أساسا مستقلة للتعبير علامة السطحية، ولكن التي يمكن صقلها بالتحديد على التوالي اﻷفخاذ علامة إيجابية محددة حسب الحاجة (انظر أيضا الجدول 1). (1) تقنية السكان (SP) الجانب اتسم أصلاً في عدد سكان بدائية من الخلايا الجذعية المكونة للدم استناداً إلى القدرة على افلوكس صبغ الحمض النووي هويشت 3334226 ملزم ATP كاسيت (ABC) الناقلين27. تم عزلة بواسطة مجموعات مختلفة القلب SP الخلايا وذكرت للتعبير عن مجموعة متنوعة من علامات مع بعض الاختلافات الطفيفة بين التقارير2،8،،من1314. (2) مستعمرة-تشكيل وحدة تنتجها الخلايا الليفية الخلايا (زيمبابوي-خ) أصلاً تم تعريفها على أساس في خلية stromal الوسيطة (MSC)-مثل النمط الظاهري. تستزرع MSCs معزولة عن الأطباق للحث على تشكيل مستعمرة. مثل مستعمرة-تشكيل لجنة السلامة البحرية مثل زيمبابوي-خ يمكن أن تكون معزولة عن قلب الكبار وهي قادرة على تفرق في الأنساب القلب15. (3) المستمدة من كارديوسفيري الخلايا (CDC) هي خلايا مفردة مشتقة من مجموعات من الخلايا التي نمت من خزعات الأنسجة أو اكسبلانتس28،29،،من3031. مؤخرا تبين أن معظمها CD105+/CD90 معارض جزء الخلية/c-kit– –كارديوميوجينيك والتجدد المحتمل32.

هنا، باستخدام SP-Cpc المعزولة من الفئران، نقدم بروتوكول لاستحثاث كفاءة النسب غشائي استناداً إلى دراسة سابقة في Cpc الجرذ والفأر SP-Cpc33. ويتضمن البروتوكول تعديلات محددة للثقافة وأسلوب التوسع فيما يتعلق بكثافة الخلية، ومحتوى مصل المتوسطة، والركيزة. فإنه يمكن تطبيقها ليس فقط على الماوس SP-Cpc ولكن للحصول على أنواع مختلفة من تكلفة النقرة لهذا الغرض لحفز التحول مصير من تضخيم للحزب الشيوعي الصيني غشائي المرتكبة، سواء كان ذلك نظراً لزرع هذه الخلايا أو استعمالها للدراسات الميكانيكية في المختبر .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

استخدام الماوس لغرض عزل الخلية وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، ومع "قانون حماية الحيوان السويسرية" وأقرته "سلطات الكانتونات السويسرية".

ملاحظة: عزل هيئة الأوراق المالية-1+/CD31– تم س-Cpc من قلب الماوس أساسا كما هو موضح سابقا34 مع إدخال بعض التعديلات عليها. للمواد والكواشف المستخدمة، انظر الجدول للمواد. لجميع التجارب، تضخم القلب SP-Cpc المعزولة من الفئران، باساجيد، وتستخدم بطريقة شبيهة بخط خلية. واستخدمت مقاطع من 7-20 لهذه الدراسة.

1-إعداد الأنسجة

ملاحظة: يجب إجراء جميع التجارب الفئران باستخدام وفقا للمبادئ التوجيهية والأنظمة. هذا البروتوكول يستخدم الفئران الأربعة. يتم وصف لوحات الثقافة التي 100 ملم في القطر P100 ولوحات الثقافة التي 60 ملم في القطر توصف P60 للأجزاء التالية من البروتوكول.

  1. حقن كل الماوس مع 200 مغ/كغ بينتوباربيتال إينترابيريتونيلي (القائمة) والانتظار حتى أنه هو تماما تخديره بالتحقق من ردها على أخمص القدمين معسر.
  2. مسح الصدر مع الإيثانول 70%. قطع الجلد وجدار الصدر مع مقص لفضح تجويف الصدر.
  3. رفع القلب بالملقط وقطع عليه في القاعدة باستخدام مقص. وضع القلب في P100 مع 25 مل (5 مل ل P60) من المياه المالحة الباردة مخزنة الفوسفات (PBS) (ثلاث إلى خمس قلوب كل P100) أو واحد إلى اثنين في قلوب كل P60.
  4. مضخة القلب بالملقط لإخراج الدم من التجاويف (الشكل 1A).
  5. وضع القلب في P100 مع 25 مل (5 مل ل P60) لبرنامج تلفزيوني الباردة للغسيل. إزالة الاذينين استخدام مقص صغير. قص القلب إلى قطعتين طولية ويغسل لهم مرة أخرى في برنامج تلفزيوني المثلج (25 مل/P100، 5 مل/P60).
  6. نقل القطع إلى P100 جديدة مع 25 مل (5 مل ل P60) لبرنامج تلفزيوني الباردة. قص القطع إلى أجزاء أصغر باستخدام مقص صغير (الشكل 1B). إضافة قطره من 1 ملغ/مل كولاجيناز ب المخفف في هانك لحل متوازن الملح (حبس) وفرم القطع الصغيرة جيدا بشفرة حلاقة معقم (الشكل 1).

2-الهضم

  1. إضافة 10 مل (2.5 مل ل P60) الحل ب كولاجيناز 1 ملغ/مل للطبق من الخطوة 1، 6.
  2. وضع الحل كولاجيناز ب التي تحتوي على قطع القلب مفروم في (حوالي 30°) يميل P100 (أو P60) في حاضنة 37 درجة مئوية (الشكل 1).
  3. احتضان القطع القلب المفروم لمدة أقصاها 30 دقيقة؛ مجانسة بتمرير لهم مرارا وتكرارا عن طريق ماصة باستور كل 10 دقائق أثناء الاحتضان (الشكل 1E).
    ملاحظة: من المهم أن لا يتجاوز 30 دقيقة للحضانة في المجموع للخطوة 1، 3.

3-الترشيح

  1. إضافة 10 مل (5 مل ل P60) من هبس الباردة وتستكمل مع 2% FBS للقطع قلب مفروم والمتجانس.
    ملاحظة: حبس وتستكمل مع النشاط كولاجيناز ب 2% FBS يروي.
  2. تصفية قطع القلب من خلال 100 ميكرومتر تصفية لإزالة الأنسجة عسر الهضم، وأجهزة الطرد المركزي في 470 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) (الشكل 1F، مرشحات الأصفر).
  3. تجاهل المادة طافية ريسوسبيند بيليه في 5 مل (3 مل ل P60) من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء، واحتضان بيليه لمدة 5 دقائق مع الهز عرضية على الجليد.
  4. إضافة 10 مل (5 مل ل P60) من برنامج تلفزيوني (لوقف رد الفعل تحلل) وتصفية العينة من خلال عامل تصفية 40 ميكرومتر استبعاد الخلايا الكبيرة، بما في ذلك كارديوميوسيتيس المتبقية (الشكل 1F، مرشحات الأزرق).
  5. الطرد المركزي الأنبوب في 470 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت (دون الفرامل). تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 1 مل دميم بما في ذلك 10% FBS.
  6. عد الخلايا في قاسمة مع هيموسيتوميتير. ريسوسبيند الخلايا مع دميم بما في ذلك 10% FBS، يهدف إلى تركيز خلية الأخيرة من 1 × 106 خلايا/مل.
    ملاحظة: تقريبا 5 × 106 خلايا كارديوميوسيتي وكرات الدم الحمراء المستنفد يمكن تقدير كل الماوس.
  7. توزيع الخلايا في أنابيب اثنين (الشكل 2): في الأنبوب A، قم بإضافة 1.5 مل لتلطيخ هويشت 33342 مع فيراباميل؛ في الأنبوب ب، إضافة مل 18.5 لتلطيخ هويشت 33342 والمضي قدما لوصمة عار وفرز الخلايا س القلب (خطوات 4.1 و 4.2) بالتدفق الخلوي.

4-فرز الخلايا س القلب بالتدفق الخلوي

ملاحظة: يمنع فيراباميل efflux هويشت بحجب عصيات مقاومة نشاط الناقل ABC (المقاوم). هويشت 33342 هو صبغة الحمض النووي ملزمة التي يمكن استخدامها للكشف عن دورة الخلية، كما أنه يرتبط بمحتوى الحمض النووي في الخلايا الحية. تظهر الخلايا هويشت-33342-البثق في الجزء المنخفض هويشت من كلتا القناتين الانبعاثات (450 نانومتر، الأزرق هويشت؛ 650 نانومتر، الأحمر هويشت)، جانبا هويشت-الإبقاء على "السكان الرئيسية"، منحهم اسم "الجانب سكانها". حزمة الخدمة SP الخلايا التي أثرت في الخلايا التي تحتوي على خصائص السلف وإظهار تعبير عالية من الناقلين ABC المقاوم للأدوية المتعددة (مثل MDR1 و ABCG2). هويشت 33342 مكتوبة هويشت للأجزاء التالية من البروتوكول. من المهم أن تحمي مواد حساسة للضوء لنتائج مثالية.

  1. تلطيخ مع هويشت في وجود وغياب فيراباميل
    1. إضافة فيراباميل (بتركيز نهائي من 83.3 ميكرومتر) وهويشت (مع تركيز نهائي من 5 ميكروغرام/106 خلايا) في حل الخلية. استخدام أنبوب A، فيراباميل وهويشت؛ الأنبوبة ب، استخدم هويشت فقط. احتضان في حمام مائي (عند 37 درجة مئوية) لمدة 90 دقيقة، وتعود هذه الأنابيب كل 20 دقيقة (الشكل 1).
    2. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 470 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت تجاهل المادة طافية وريسوسبيند كل بيليه في حبس (1 × 106 خلايا/مل).
    3. تتخذ من 1.5 مل الكوة ستينينجس واحدة والمراقبة السلبية من الأنبوب ب (الشكل 2): (ط) fluorescein isothiocyanate (فيتك)-مترافق مكافحة-الهيئة-1؛ (ثانيا) اللوفيكوسيانين (APC)-مترافق مكافحة--CD31؛ (ثالثا) نونستينيد الخلايا (مراقبة سلبية).
      ملاحظة: يتم استخدام عناصر تحكم ايستب هنا لإعداد بروتوكول العزلة.
    4. الطرد المركزي أنابيب A و B ومختبرين التحكم تلطيخ واحدة وسلبية في 470 x ز لمدة 5 دقائق في RT للغسيل هويشت وفيراباميل.
    5. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الكريات من الأنبوب A و (الثالث) مراقبة سلبية في 250 ميليلتر من حبس وإبقائهم على الجليد في الظلام حتى الفرز.
    6. ريسوسبيند بيليه من الأنبوب ب 200 ميليلتر من حبس وبيليه (الأول والثاني) من مختبرين تلطيخ واحد في 100 ميليلتر من حبس. إضافة فيتك مترافق مكافحة-الهيئة-1 (0.6 ميكروغرام/107 الخلايا) والجيش الشعبي الكونغولي مترافق مكافحة--CD31 (0.25 ميكروغرام/107 الخلايا). احتضان الكريات لمدة 30 دقيقة على الجليد ويهز لهم من وقت لآخر في الظلام.
    7. إضافة 2 مل هبس للأنابيب. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 470 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت
    8. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند جميع الكريات مع 1 مل من حبس وأجهزة الطرد المركزي كما أعلاه. تجاهل في سوبيرناتانتس. ريسوسبيند بيليه مختبرين تلطيخ واحد في 200 ميليلتر من هبس. ريسوسبيند بيليه من الأنبوب ب في حبس (20 × 106 خلايا/مل).
    9. تبقى العينات على الجليد ومحمية من الضوء حتى الفرز.
  2. الفرز مع التدفق الخلوي
    1. إعداد معقم مل 1.5 فرز أنابيب مع 500 ميليلتر من حبس بما في ذلك 2% FBS.
    2. وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على 7-أمينواكتينوميسين د (7-عاد) (0.15 ميكروغرام/106 خلايا) على الجليد لمدة 10 دقائق لاستبعاد الخلايا الميتة.
    3. فرز SP القلب باستخدام الإعدادات التالية: تثير هويشت استخدام 350 نانومتر (الأشعة فوق البنفسجية) الإثارة وجمع الانبعاثات الأسفار مع مرشح تمرير نطاق شمال البحر الأبيض المتوسط 450/50 (هويشت الأزرق) ومرشح تمرير فرقة 670/30 نانومتر (هويشت الأحمر)، واستخدام حجم فوهة من 100 ميكرومتر والضغط من 15 رطل/بوصة مربعة.
    4. للتحليل وتسجيل أحداث5 5 × 10 لفرز العينات وأحداث5 1 × 10 للمراقبة السلبية والتحكم فيراباميل، وتلطيخ واحد العينات.
      ملاحظة: القلب SP حوالي 0.5%-2% (الشكل 1 ح) ولكن قد تختلف بين المختبرات ويعزل. /CD31 هيئة الأوراق المالية-1+كسر– حوالي 1%-11% SP القلب مجموع (1I الشكل) ولكن قد تختلف بين المختبرات ويعزل. هيئة الأوراق المالية-1+/CD31– SP-Cpc مكتوبة ك SP-Cpc للأجزاء التالية من البروتوكول.

5-الابتدائي ثقافة معزولة SP-Cpc

ملاحظة: استخدمت ثلاثة أنواع مختلفة من وسائل الإعلام في هذا البروتوكول. يشار إليها متوسطة 1 (وفقا نوسيدا et al.) 8, 2 المتوسطة، و 3 المتوسطة وهي الموصوفة في الجدول للمواد المتعلقة بتكوينها.

  1. الاحماء متوسطة 1 إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام وتبريد أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية. الطرد المركزي فرز أنابيب في 4 درجات مئوية و 470 x ز لمدة 6 دقائق وريسوسبيند الخلايا في المتوسط 1.
  2. وضع الخلايا على طبق P60 غاز نفاذية مع 4 مل من 1 المتوسطة. تغيير المتوسطة كل 3 د حتى وصلت الخلايا التقاء 70% إلى 80%.
    ملاحظة: الخطوة 5.2 قد يستغرق حوالي 2-3 أسابيع.

6-توسيع وتمايز SP-Cpc

  1. خلية ثقافة
    1. ثقافة 3 × 105 س-Cpc في 8 مل من 1 المتوسطة في قارورة T75.
    2. احتضان SP-Cpc في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 حتى التقاء 70% إلى 80%، التغير المتوسط كل 2-3 د.
      ملاحظة: ينبغي تعديل عدد الخلايا وفقا لنوع Cpc المستخدمة والوقت مضاعفة حجم الخلية.
  2. س--الحزب الشيوعي الصيني النمو والبقاء تحت تركيزات مصل مختلفة
    1. الثقافة SP-Cpc لمد 2-3 في قوارير T75 مع مل 8 1 المتوسطة. نضح المتوسطة وشطف بلطف مع 5 مل الحارة (37 درجة مئوية) حبس بعناية.
    2. علاج الخلايا مع 5 مل يدتا التربسين لمدة 5 دقائق في الخلية الحاضنة وإضافة 5 مل من 1 المتوسطة وقف النشاط التربسين، ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل.
    3. الطرد المركزي الخلايا في 470 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت
    4. ريسوسبيند الخلايا في متوسطة 1 أو 2 المتوسطة (النسب المتوسطة التعريفي) ولوحة 2.5 × 105 SP-Cpc الأطباق P60 مع 3 مل متوسطة التي تحتوي على تركيزات مختلفة من المصل.
    5. جمع المتوسطة من طبق الخطوة 6.2.4 لجمع الخلايا الميتة في أنبوب 15 مل بعد 2 (د) من استزراع في المتوسط 1 أو 2 متوسطة.
    6. تريبسينيزي الخلايا ملتصقة كما في الخطوة 6.2.2 وجمع تعليق خلية في أنبوب 15 مل الخطوة 6.2.5. الطرد المركزي الخلايا في x 840 ز لمدة 5 دقائق في الرايت
    7. نضح المادة طافية وإضافة 1 مل من متوسطة 1 أو 2 متوسطة لخلية العد. وصمة عار SP-Cpc تريبان الأزرق (0.4 في المائة) والكونت تريبان الأزرق-إيجابية (الميت) وتريبان الأزرق سالب الخلايا (قابلة للتطبيق).
      ملاحظة: صلاحية خلية (الخطوة 6.2.7) تعطي كعدد الخلايا تريبان الأزرق السلبية فيما يتعلق بعدد إجمالي الخلايا.
  3. التعريفي للتمايز غشائي
    1. بركات صفيحة ثقافة (6-جيد) مع 10 ميكروغرام/مل لامينين (LN) أو فيبرونيكتين (الجبهة الوطنية).
      1. جعل حلاً الركيزة التي تحتوي على 10 ميكروغرام/مل LN أو FN مع F12 المتوسطة (أو برنامج تلفزيوني). إضافة 2 مل من محلول الركازة لكل بئر. الحفاظ على اللوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      2. نضح الحل من اللوحة وإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني لكل بئر حتى استخدامه.
    2. نضح المتوسطة من الخلايا من الخطوة 6.1.2 وشطف لهم بلطف مع 5 مل الحارة (37 درجة مئوية) حبس وتعاملهم مع 5 مل يدتا التربسين لمدة 5 دقائق في الخلية الحاضنة، وإضافة 5 مل من 1 المتوسطة لوقف نشاط التربسين ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل.
    3. الطرد المركزي الخلايا في 470 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت أسبيراتي المادة طافية وإضافة 2 المتوسطة لخلية العد.
    4. البذور 8 × 104 خلايا كل جيدا على لوحة المغلفة مع 3 مل من 2 المتوسطة وإبقائه في 37 درجة مئوية ل 20-24 حاء – التغير المتوسط إلى 3 مل من 3 المتوسطة.
      ملاحظة: من المستحسن استخدام المتوسطة التي تحتوي على تركيز مصل منخفضة – ودون ملاحق – لأول ح 20-24. ننصح باستخدام < التقاء خلية 60% (أيعدد الخلايا من الخطوة 6.3.4 يجب أن يعدل تبعاً لمعدل حجم ونمو الخلية).
    5. الثقافة الخلايا لمد 21 وتغير متوسط كل 3 د.
    6. التحقق من طبيعة غشائي الخلايا المتمايزة تلطيخ لهم مع علامة غشائي مثل فون ويليبراند المنفذ fluorescence مجهرية وعامل (فوف).
      1. تغسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا في فورمالدهايد 3.7% لمدة 2 دقيقة في الرايت
      2. بيرميبيليزي الخلايا مع 0.1% X تريتون في ddH2س (أو برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة ومنعه مع 10% مصل الماعز ح 1 في الرايت
      3. احتضان الخلايا مع مكافحة فون ويليبراند عامل جسم (1: 100) ح 48 عند 4 درجة مئوية
      4. تغسل الخلايا 3 x مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، لمدة 10 دقائق في كل مرة. احتضان لهم مع أليكسا فلور 546 الماعز الأرنب المضادة الأجسام المضادة الثانوية (1: 500) ح 1 في RT في الظلام.
      5. أغسل x 3 مرة أخرى، لمدة كل منها 10 دقائق مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. وصمة عار نواة الخلية مع 4 ' 6-دياميدينو-2-فينيليندولي، هيدروكلوريد (DAPI؛ 1: 500) لمدة 5 دقائق في RT في الظلام.
      6. تغسل الخلايا 3 x، لمدة 5 دقائق في كل منهما، مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. جبل الخلايا وتخزينها في 4 درجات مئوية
        ملاحظة: شروط الخطوات 6.1 و 6.3 تثقيف (الركيزة والمتوسطة والمواد الكاشفة تكميلية وتركيز FBS) يرد في الشكل 3.
  4. أنبوب تشكيل الإنزيم
    1. إعداد مصفوفة لغشاء (مثلاً، ماتريجيل، يشار إليها من الآن فصاعدا مصفوفة) لوحة.
      1. ذوبان الجليد المصفوفة في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
      2. معطف صفيحة 96-جيدا مع 100 ميليلتر من المصفوفة على الجليد.
        ملاحظة: من المهم تجنب أي فقاعات في المصفوفة. اللوحات يجب أن تكون مغلفة بالثلج لتفادي جيليفيكيشن المصفوفة.
      3. الحفاظ على اللوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. نضح المتوسطة من الخلايا (بعد انتهاء الخطوة 6.3.5) ولطف شطف الخلايا مع 5 مل الحارة (37 درجة مئوية) حبس، وتعاملهم مع التربسين يدتا لمدة 5 دقائق في الخلية الحاضنة. أضف 3 المتوسطة لوقف النشاط التربسين ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل.
    3. الطرد المركزي الخلايا في 470 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت أسبيراتي المادة طافية، أضف 1 مل 3 المتوسطة، وبيبيت بلطف.
    4. تصفية الخلايا مع مصفاة خلية 35 ميكرون، إذا كان يتم تجميع الخلايا.
    5. عد الخلايا والبذور 2 × 103 إلى 4 × 103 خلايا في 100 ميليلتر من متوسطة 3 في كل مصفوفة المغلفة بشكل جيد. تبقى اللوحة عند 37 درجة مئوية في الخلية الحاضنة ح 16.
    6. التقاط صورة مجهر مشرق الميدان الساعة 2 X التكبير.
      ملاحظة: في حالة تريبسينيزيشن غير مكتملة، إطالة وقت التعرض إلى التربسين-يدتا بحد أقصى 7-8 دقيقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

عزل SP-الحزب الشيوعي الصيني الماوس:

في هذه الدراسة، قمنا باستخدام الماوس Cpc المعزولة وفقا النمط الظاهري SP، بينما يتم تعديل النتائج من الفئران Cpc وأضيف من تقرير سابق مع الإذن (الشكل 8)33.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

مزايا هذا البروتوكول:

يوفر هذا البروتوكول أسلوب المفاضلة بطانية لتكلفة النقرة. ووجدنا أن تركيز المصل منخفضة، والخلية منخفضة الكثافة يمكن تحسين كفاءة التمايز بطانية، حيث ثبت LN الركازة أكثر ملاءمة من الجبهة الوطنية في ظل هذه الظروف. استخدمنا نوعين متميزين من تكلفة النقرة: الف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون لورينز فيرا للدعم المفيد الذي قدمته خلال التجارب والموظفين من "مرفق التدفق الخلوي" من إدارة الطب الحيوي (DBM) وجامعة بازل في مستشفى الجامعة. وأيد هذا العمل البقاء في مسار البرنامج من جامعة بازل (موشيزوكي ميتشيكا). م. غابرييلا كوستر معتمد بمنحه من "مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية" (المنحة رقم 310030_156953).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Culture medium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)ThermoFisher#12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 HamMerck#D8437
Penicillin-Streptomycin (P/S)ThermoFisher#15140122
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone#SH300713.5% (0.1% for lineage induction)
L-Glutamine ThermoFisher#25030Final concentration 2 mM
GlutathioneMerck#G6013
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)Peprotech#AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)Peprotech#AF-100-18B
B27 SupplementThermoFisher#17504044
Cardiotrophin 1 Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, Switzerland#100-125
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#14170
0.05 % Trypsin-EDTAThermoFisher#25300
T75 FlaskSarstedt#83.3911
Endothelial differentiation  
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Ham's F-12K (Kaighn's) MediumThermoFisher#21127
Laminin Merck#L2020
Fibronectin Merck#F4759Dilute in ddH2O
6 Well PlateFalcon#353046
Formaldehyde SolutionMerck#F1635Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)
Triton X-100Merck#934200.1% in ddH2O
Normal Goat Serum (10%)ThermoFisher#50062Z
Anti-von Willebrand Factor antibodyAbcam#ab69941:100 in 10% goat serum
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546ThermoFisher#A110101:500 in 10% goat serum
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)ThermoFisher#622471:500 in ddH2O 
SlowFade Antifade KitThermoFisher#S2828
BX63 widefield microscopeOlympus
Tube formation
96 Well PlateFalcon#353072
5 ml Round Bottom Tube with Strainer CapFalcon#352235
Matrigel Growth Factor ReducedCorning#354230
IX50 widefield microscopeOlympus
Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 
Reagents
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.in house hospital pharmacy#9077862Working solution: 200 mg/kg
Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#20012
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-)ThermoFisher#14175Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS  for quenching Collagenase B activity 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, PyruvateThermoFisher#331885Prepare DMEM + 10% FBS  + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining
Penicillin-Streptomycin  (P/S)ThermoFisher#15140122
HEPES 1 MThermoFisher#15630080Final concentration 25 mM
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone#SH30071
RBC LysisBuffer (10X)BioLegend#420301/100mLDilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter
Collagenase BMerck#11088807001Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter
bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)Merck#B2261Prepare 1 mg/mL in ddH2O
Verapamil-hydrochloride Merck#V4629Final concentration 83.3 µM 
APC Rat Anti-Mouse CD31BD Biosciences#5512620.25 µg/107cells
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)BD Biosciences#5574050.6 µg/107cells
7-Aminoactinomycin D (7-ADD)ThermoFisher#A13100.15 µg/106cells
APC rat IgG2a k Isotype ControlBD Biosciences#5539320.25 µg/107cells
FITC Rat IgG2a k Isotype ControlBD Biosciences#5546880.6 µg/107cells
Material
Needles 27GTerumo#NN-2719R
Needles 18GTerumo#NN-1838S
Single Use Syringes 1 mL sterileCODAN#62.1640
Transferpipette 3.5 mLSarstedt#86.1171.001
Cell Strainer 40 µm blueBD Biosciences #352340
Cell Strainer 100 µm yellowBD Biosciences#352360
Lumox Dish 50Sarstedt#94.6077.305
Culture Dishes P100Corning#353003
Culture Dishes P60Corning#353004
Mouse
LineAgeBreeding
C57BL/6NRj / male12 weeksin house
Product NameCompanyCatalogue No.
Reagents
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)ThermoFisher#12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 HamMerck#D8437
Penicillin-Streptomycin  (P/S)ThermoFisher#15140122
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone#SH30071
L-Glutamine ThermoFisher#25030
GlutathioneMerck#G6013
B27 SupplementThermoFisher#17504044
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)Peprotech#AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)Peprotech#AF-100-18B
Cardiotrophin 1 Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, Switzerland #100-125
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. 
Product NameMedium 18Medium 2Medium 3
ReagentsCultureLineage inductionEndothelial diff.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)35%35%
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham65%65%
Penicillin-Streptomycin  (P/S)1%1%
Fetal Bovine Serum (FBS)3.5%≤0.1%
L-Glutamine 2 mM2 mM
Glutathione0.2 nM0.2 nM
B27 Supplement1.3%
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)6.5 ng/mL
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)13 ng/mL
Cardiotrophin 1 0.65 ng/mL
Thrombin0.0005 U/mLAll necessary components included in the kit
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKitAll necessary components included in the kit

References

  1. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
  2. Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
  3. Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255(2012).
  4. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  5. Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
  6. Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
  7. Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
  8. Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930(2015).
  9. Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
  10. El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
  11. Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
  12. Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
  13. Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
  14. Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
  15. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
  16. Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
  17. Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
  18. Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
  19. Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
  20. Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
  21. Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
  22. Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
  23. Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
  24. Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
  25. Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  27. Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
  28. Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
  29. Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195(2009).
  30. Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669(2011).
  31. Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
  32. Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260(2014).
  33. Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
  34. Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
  35. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  36. Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved