JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטת בידול אנדותל עבור ובתאים הלב. הוא מתמקד במיוחד כיצד סרום ריכוז וצפיפות זורעות תא משפיעים על פוטנציאל התמיינות אנדותל.

Abstract

ובתאים הלב (CPCs) ייתכן טיפולית פוטנציאל התחדשות לב לאחר פציעה. בלב יונקים בוגרים, CPCs מהותי נדיר, אך CPCs המורחב יכול להיות שימושי עבור טיפול בתאי. תנאי הכרחי לשימוש שלהם הוא היכולת להתמיין בצורה מבוקרת שושלות לב שונים באמצעות פרוטוקולי מוגדר ויעיל. בנוסף, על הרחבת במבחנה , CPCs מבודדים מחולים או מחלות פרה מודלים עשויים להציע כלי מחקר פורה לחקירה של מנגנוני המחלה.

מחקרים נוכחיים להשתמש סמנים שונים לזיהוי CPCs. עם זאת, לא כולם באים לידי ביטוי אצל בני אדם, אשר מגביל את השפעת translational מחקרים פרה. פרוטוקולים בידול הרלוונטיים ללא קשר ההבעה טכניקה, סמן בידוד יאפשר הרחבת מתוקננת ואת לקרקע של CPCs לצורך טיפול תא. כאן נתאר כי לקרקע של CPCs תחת ריכוז נמוך סרום שור עוברית (FBS) ותנאי צפיפות נמוכה תא מקלה את הבידול אנדותל של CPCs. באמצעות שתי subpopulations שונות של עכבר, חולדה CPCs, אנו מראים ש-laminin את זה יותר המצע מתאימה יותר fibronectin למטרה זו תחת פרוטוקול הבאים: לאחר culturing במשך 2-3 ימים בינוני כולל תוספי תזונה זה לשמור על multipotency ועם 3.5% FBS, CPCs נזרע על laminin ב < 60% הנהרות ותרבותית ב ללא תוספת בינוני עם ריכוזים נמוכים של FBS (0.1%) 20-24 שעות לפני בידול בידול אנדותל בינוני. מאחר CPCs הם אוכלוסיה הטרוגנית, סרום ריכוזים ושעות הדגירה עשוי צריכים להיות מותאמים בהתאם המאפיינים של subpopulation בהתאמה עלות לקליק. בהתחשב בכך, הטכניקה ניתן להחיל על סוגים אחרים של CPCs כמו גם והוא מספק שיטה שימושית כדי לחקור את הפוטנציאל ואת המנגנונים של בידול, כיצד הן מושפעות על ידי מחלת בעת שימוש CPCs מבודד מן המחלה בהתאמה מודלים.

Introduction

מחקרים שנעשו לאחרונה לתמוך את קיומו של תושב ובתאים הלב (CPCs) של הלב יונקים בוגרים1,2,3, CPCs יכול להיות מקור שימושי עבור טיפול בתאי לאחר פציעה לב4, 5. בנוסף, CPCs המורחב עשוי לספק מודל פורה והתרופות הקרנה, החקירה של מנגנוני המחלה כאשר מבודדים מחולים עם cardiomyopathies נדירים, או ממחלת בהתאמה מודלים6,7.

CPCs מבודד בלב למבוגרים בעלי גזע/קדמון תא מאפיינים1,2,3,8 כפי שהם multipotent, clonogenic, יש יכולת התחדשות עצמית. עם זאת, ישנן אוכלוסיות שונות (sub) רבים של CPCs מפגין סמן משטח שונה פרופילים, כולל, למשל, c-kit, Sca-1 ואחרים, או שאוחזרו באמצעות טכניקות שונות בידוד (טבלה 1). מספר פרוטוקולים תרבות ובידול כבר הוקמה1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. פרוטוקולים אלה משתנים בעיקר ביחס גורם גדילה והתוכן סרום, אשר מותאמים בהתאם לצורך culturing, אשר יכול להוביל הבדלי תוצאות ותוצאות, לרבות יעילות בידול.

טכניקות בידוד המבוסס על סמן:

CPCs ניתן לבודד המבוסס על סמן משטח מסוים ביטוי1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. מחקרים קודמים מצביעים כי c-kit, Sca-1 ייתכן הסמנים הכי טוב כדי לבודד תושב CPCs1,11,14,19,20. כי אף אחד סמנים אלה הוא באמת ספציפי CPCs, שילובים של סמנים שונים בדרך כלל מוחלים. לדוגמה, בעוד CPCs אקספרס רמות נמוכות של c-kit21, c-kit מתבטאת גם על ידי סוגי תאים אחרים, כולל תאי פיטום22, תאי אנדותל23של תאי גזע hematopoietic/קדמון24. בעיה נוספת היא העובדה כי לא כל הסמנים מבוטאים על-פני כל המינים. זהו המקרה Sca-1, אשר מבטא את העכבר אך לא אנושי25. לכן, באמצעות פרוטוקולים שאינן תלויות סמני בידוד עשוי להיות יתרון על רקע ניסויים קליניים ומחקרים באמצעות דגימות אנושי.

סמן תלויית בידוד טכניקות:

ישנן מספר טכניקות העיקריים של עלות לקליק בידוד, אשר אינם תלויים בראש ובראשונה ביטוי סמן משטח, אך אשר יכול להיות מעודן על-ידי בחירת ברציפות subfractions סמן-חיובית מסוימת. כנדרש (ראה גם לוח 1). (1) הטכניקה האוכלוסייה (SP) צד במקור מלווה בקרב אוכלוסיה פרימיטיבית של תאי גזע hematopoietic מבוסס על היכולת בזרימת לצבוע דנ א Hoechst 3334226 ב- ATP-איגוד קלטת (ABC) מובילי27. תאי SP לב מבודדת על ידי קבוצות שונות ודיווח לבטא מגוון של סמנים עם כמה הבדלים משניים בין דוחות2,8,13,14. (2) יחידה המושבה יוצרי תאי פיברובלסט (CFU-Fs) במקור הוגדרו בהתבסס על תא סטרומה mesenchymal (MSC)-כמו פנוטיפ. MSCs מבודד מתורבתים על מנות לזירוז הקמת המושבה. כגון המושבה יוצרי MSC דמוי CFU-Fs ניתן לבודד מהלב למבוגרים, והם מסוגלים להתמיין שושלות לב15. (3) Cardiosphere נגזר תאים (CDC) הם תאים בודדים נגזר אשכולות של התאים גדלו של ביופסיות רקמות או explants28,29,30,31. זה הוצג לאחרונה זה בעיקר את CD105+/CD90–/c-kit– תא שבר מוצגים cardiomyogenic, פוטנציאל הרגנרציה32.

כאן, אנו באמצעות SP-CPCs מבודד מן העכברים, מספקים פרוטוקול אינדוקציה יעיל של השושלת אנדותל מבוסס על מחקר קודם CPCs חולדה, עכבר SP-CPCs33. הפרוטוקול מכיל עיבודים ספציפית לתרבות, טכניקה הרחבה לגבי צפיפות התאים, התוכן סרום של המדיום, ואת המצע. זה יכול לחול לא רק על העכבר SP-CPCs אך לסוגים שונים של CPCs למטרה לזירוז מתג גורל מ הגברה ל CPC אנדותל שבוצעו, יהיה זה על רקע השתלת תאים אלה או השימוש בהם ללימודי מכניסטית במבחנה .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

השימוש של עכברים תא בידוד מטרה לפי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה ועם חוק ההגנה שוויצרי, אושרה על-ידי השלטונות הקנטונים שוויצרי.

הערה: את ניתוקה של Sca-1+/CD31– SP-CPCs מהלב עכבר נעשה בעיקרו של דבר כפי שתואר לעיל34 עם מספר שינויים. החומרים והשירותים ריאגנטים בשימוש, ראה טבלה של חומרים. עבור כל הניסויים, הלב SP-CPCs מבודד מן העכברים היו מוגבר, passaged, שימוש באופן קו דמוי תא. פסוקים 7-20 השתמשו במחקר זה.

1. רקמות הכנה

הערה: כל ניסויים שימוש בעכברים צריך להתבצע על פי הנחיות תקנות. פרוטוקול זה משתמש ארבעה עכברים. צלחות תרבות כי הם 100 מ מ קוטר מתוארים P100, צלחות תרבות המהווים 60 מ מ קוטר מתוארים P60 בחלקים הבאים של הפרוטוקול.

  1. להזריק כל עכבר עם 200 מ"ג/ק"ג של פנטוברביטל intraperitoneally (i.p.) ולחכות עד זה הוא מורדם לחלוטין על-ידי בדיקת תגובתה שאורך צובט.
  2. נגב את החזה עם 70% אתנול. חותכים את העור ואת בית החזה קיר עם מספריים כדי לחשוף את חלל בית החזה.
  3. הרם את הלב עם מלקחיים, לחתוך אותו בבסיס באמצעות מספריים. לשים את הלב P100 25 מ ל (5 מ"ל עבור P60) של קרות באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) (שלוש עד חמש לבבות לכל P100) או לבבות אחד או שניים לכל P60.
  4. משאבת הלב עם מלקחיים כדי להוציא את הדם החללים (איור 1 א').
  5. לשים את הלב P100 25 מ ל (5 מ"ל עבור P60) ל- PBS קר לרחצה. הסר את אטריה בעזרת מספריים קטנות. לחתוך את הלב לתוך שתי חתיכות האורך ולשטוף אותם שוב ב- PBS קר כקרח (25 מ ל/P100, 5 מ ל/P60).
  6. להעביר את החתיכות P100 חדש עם 25 מ ל (5 מ"ל עבור P60) של PBS קר. לחתוך את החלקים לחלקים קטנים יותר בעזרת מספריים קטנות (איור 1B). להוסיף טיפה של 1 מ"ג/מ"ל collagenase B מדולל של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS), מינצ את חתיכות קטנות ביסודיות עם סכין גילוח סטרילי (איור 1C).

2. מערכת העיכול

  1. להוסיף 10 מ ל (2.5 mL עבור P60) של הפתרון B collagenase 1 מ"ג/מ"ל למנה מהשלב 1.6.
  2. לשים את הפתרון collagenase B המכיל את השברים הלב טחון מוטה (כ-30 מעלות) P100 (או P60) בחממה של 37 ° C (איור 1D).
  3. דגירה החלקים הלב טחון לתקופה מקסימלית של 30 דקות; homogenize על ידי שוב ושוב הכנסתם פיפטה פסטר כל 10 דקות במהלך הדגירה (איור 1E).
    הערה: חשוב לא תעלה על 30 דקות של דגירה סה עבור שלב 1.3.

3. סינון

  1. להוסיף 10 מ ל (5 מ"ל עבור P60) של HBSS קר בתוספת 2% FBS ליצירות לב טחון הומוגני.
    הערה: HBSS בתוספת 2% FBS המרווה פעילות collagenase B.
  2. לסנן את החתיכות הלב דרך מסנן 100 מיקרומטר להסיר את רקמת מעוכל צנטריפוגה ב x 470 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) (איור 1F, מסננים צהוב).
  3. למחוק את תגובת שיקוע resuspend בגדר ב 5 מ ל (3 מ"ל של P60) של תאי הדם האדומים פירוק מאגר ו דגירה בגדר במשך חמש דקות עם רועדת פה ושם על קרח.
  4. להוסיף 10 מ ל (5 מ"ל עבור P60) ל- PBS (להפסיק את תגובת פירוק) ולסנן את הדגימה דרך מסנן 40 µm כדי לא לכלול תאים גדולים יותר, כולל שיורית cardiomyocytes (איור 1F, מסננים כחול).
  5. Centrifuge את הצינור ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב RT (ללא בלימה). למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 1 מ"ל של DMEM כולל 10% FBS.
  6. לספור את התאים aliquot עם hemocytometer. Resuspend התאים עם DMEM כולל 10% FBS, מכוון ריכוז התא האחרון של עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל....
    הערה: בערך 5 x 106 תאים cardiomyocyte, כדוריות דם אדומות-מדולדל יכול להיות המשוער העכבר.
  7. להפיץ את התאים לתוך שני צינורות (איור 2): שפופרת A, להוסיף 1.5 mL עבור Hoechst 33342 מכתים עם verapamil; הרכבת התחתית B, להוסיף 18.5 מ עבור צביעת Hoechst 33342 והמשך כתם ולמיין תאי SP לב (שלבים 4.1 ו- 4.2) על ידי cytometry זרימה.

4. מיון תאי הלב SP מאת Cytometry זרימה

הערה: Verapamil מעכב Hoechst בזרימת על ידי חסימת multidrug ההתנגדות פעילות טרנספורטר (MDR) ABC. Hoechst 33342 הוא צבע DNA מחייב כי ניתן להשתמש בתאים חיים כדי לזהות את מחזור התא כמו זה קשור עם תוכן ה-DNA. תאים Hoechst-33342-הבלטת ממד מופיעים בחלק Hoechst נמוכה בשני ערוצים פליטה (450 nm, כחול Hoechst; 650 nm, Hoechst אדום), בצד של Hoechst תמך "האוכלוסייה העיקרית", נותן להם השם "לצד האוכלוסייה שלהם". SP התאים מועשרים בתאים בעלי תכונות קדמון, הצג ביטוי גבוהה של מובילי ABC multidrug עמידים (כגון MDR1 ו ABCG2). Hoechst 33342 נכתב כ/כפי Hoechst בחלקים הבאים של הפרוטוקול. חשוב להגן על חומרים רגישים לאור תוצאות אידיאלי.

  1. צביעת עם Hoechst נוכחות, היעדר verapamil
    1. להוסיף הפתרון תא verapamil (עם ריכוז סופי של 83.3 מיקרומטר) ו Hoechst (עם ריכוז הסופי של 5 µg/106 תאים). שפופרת A, השתמש Verapamil Hoechst; הרכבת התחתית B, השתמש Hoechst בלבד. דגירה באמבט מים (ב 37 ° C) במשך 90 דקות ולחזור הצינורות כל 20 דקות (איור 1 ג'י).
    2. Centrifuge הצינורות ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב RT. להשליך תגובת שיקוע, resuspend כל גלולה ב- HBSS (1 x 106 תאים/mL).
    3. . קח mL 1.5 aliquot stainings יחיד ובקרה שלילי הרכבת התחתית B (איור 2): (i) fluorescein isothiocyanate (FITC)-מצומדת אנטי-Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-מצומדת anti-CD31; (iii) תאים nonstained (בקרה שלילית).
      הערה: Isotype פקדים משמשים כאן עבור הגדרת פרוטוקול בידוד.
    4. צנטריפוגה צינורות A ו- B , את aliquots מכתים בודד ושלילית שליטה ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב RT לכביסת Hoechst, verapamil.
    5. למחוק את תגובת שיקוע resuspend כדורי של שפופרת A וכן (iii) הפקד שלילי ב 250 µL של HBSS, לשמור אותם על קרח בחושך עד מיון.
    6. Resuspend בגדר של הרכבת התחתית B 200 µL של HBSS, בגדר של (i, ii) את aliquots מכתים יחיד ב- 100 µL של HBSS. הוסף FITC מצומדת אנטי-Sca-1 (0.6 µg/107 תאים) מצומדת APC אנטי-CD31 (0.25 µg/107 תאים). דגירה כדורי במשך 30 דקות על קרח ומנערים אותם מפעם לפעם בחושך.
    7. להוסיף 2 מ של HBSS הצינורות. Centrifuge הצינורות ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב- RT.
    8. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend כל החבילות עם 1 מ"ל של HBSS, צנטריפוגה כמו לעיל. למחוק את supernatants. Resuspend בגדר של aliquots מכתים יחיד ב- 200 µL של HBSS. Resuspend בגדר של הרכבת התחתית B ב- HBSS (20 x 106 תאים/mL).
    9. שומרים את הדגימות על קרח, מוגן מפני אור עד מיון.
  2. מיון עם cytometry זרימה
    1. להכין סטרילי mL 1.5 מיון צינורות עם 500 µL של HBSS כולל 2% FBS.
    2. כתם התאים עם 7-aminoactinomycin D (7-מ) (0.15 µg/106 תאים) על קרח למשך 10 דקות כדי לא לכלול תאים מתים.
    3. למיין את SP הלב באמצעות ההגדרות הבאות: לרגש Hoechst באמצעות עירור 350 nm (UV), לאסוף את פליטת קרינה פלואורסצנטית עם 450/50 ננומטר הלהקה לעבור סינון (Hoechst כחול) ועם 670/30 ננומטר הלהקה לעבור סינון (Hoechst אדום) ולהשתמש בגודל החרירים של 100 מיקרומטר ואת הלחץ 15 psi.
    4. לניתוח, להקליט 5 x 10 אירועים5 על הדגימות המיון ואירועים5 עונה 1 פרק 10 עבור שליטה שלילי, verapamil שליטה, מכתים בודדת דגימות.
      הערה: הלב SP הוא כ- 0.5% - 2% (איור 1 H) אבל עשוי להשתנות בין המעבדות מבודד. /CD31 Sca-1+– שבר הוא סביב 1% - 11% של SP לב מוחלט (איור 1I) אבל עשויים להשתנות בין המעבדות מבודד. Sca-1+/CD31– SP-CPCs נכתבות כמו SP-CPCs בחלקים הבאים של הפרוטוקול.

5. ראשי תרבות של SP מבודד-CPCs

הערה: שלושה סוגים שונים של מדיה שימשו פרוטוקול זה. הם מכונים בינוני 1 (לפי נוזדה. et al.) 8, 2 בינוני, ו 3 בינוני והם המתוארות בטבלה של חומרים לגבי הרכב שלהם.

  1. לחמם בינוני 1 ל 37 ° C לפני השימוש ולהרגע לצנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס. Centrifuge צינורות המיון ב 4 ° C ו- x 470 גרם במשך 6 דקות, resuspend תאי 1 בינוני.
  2. לשים את התאים על מאכל P60 חדיר גז עם 4 מ ל 1 בינוני. לשנות את המדיום בכל בתלת-ממד עד התאים הגיעו למפגש 70% - 80%.
    הערה: שלב 5.2 עשויה להימשך בסביבות 2-3 שבועות.

6. הרחבת ובידול של SP-CPCs

  1. תרבית תאים
    1. תרבות 3 x 105 SP-CPCs 8 מ ל 1 בינוני בבקבוקון T75.
    2. דגירה SP-CPCs ב 37 ° C עם 5% CO2 עד 70% - 80% הנהרות, שינוי המדיום d כל 2-3.
      הערה: המספר התא צריך להיות שונה לפי סוג CPCs בשימוש זמן ההכפלה, גודל התא.
  2. SP-CPC הצמיחה ואת הכדאיות תחת ריכוזים שונים בסרום
    1. תרבות SP-CPCs במשך 2-3 d ב- T75 מבחנות עם 8 מ ל 1 בינוני. בזהירות תשאף המדיום ולשטוף בעדינות עם 5 מיליליטר (37 ° C) HBSS חמות.
    2. לטיפול תאי עם 5 מ של טריפסין-EDTA עבור 5 דקות בחממה תא, הוסף 5 מ של בינוני 1 להפסיק את הפעילות טריפסין, ולהעביר התליה תא לרכבת התחתית 15 מ"ל.
    3. Centrifuge התאים ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב- RT.
    4. Resuspend התאים בינוני 1 או 2 בינוניים (שושלת היוחסין אינדוקציה בינוני), צלחת 2.5 10x5 SP-CPCs על P60 מנות עם 3 מ"ל של מדיום המכילים ריכוזים שונים בסרום.
    5. לאסוף את המדיום המנה של צעד 6.2.4 עבור האוסף של תאים מתים לתוך צינור 15 מ"ל לאחר 2 ד' של culturing בינוני 1 או 2 בינוניים.
    6. Trypsinize תאים חסיד כמו שלב 6.2.2 ולאסוף התליה תא לתוך הצינור 15 מ"ל של צעד 6.2.5. Centrifuge התאים ב x 840 גרם במשך 5 דקות ב- RT.
    7. וארוקן את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל של בינוני 1 או 2 בינוניים לספירת תאים. כתם SP-CPCs עם trypan blue (0.4%) ו- count trypan blue-חיוביות (המלח) ותאים trypan blue-שלילי (מעשית).
      הערה: הכדאיות תא (שלב 6.2.7) ניתנת כמספר trypan-כחול התא שלילי ביחס המספר בתא סכום.
  3. אינדוקציה של בידול אנדותל
    1. Precoat צלחת תרבות (6-טוב) עם µg/mL 10 laminin (LN) או fibronectin (FN).
      1. להפוך את פתרון מצע המכיל 10 µg/mL של LN או FN עם F12 בינוני (או PBS). להוסיף 2 מ"ל של המצע פתרון טוב לכל. לשמור על הלוח למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
      2. האחות הפתרון מהצלחת ולהוסיף 2 מ של PBS מכל קידוח עד השימוש בו.
    2. האחות המדיום מתאי מהשלב 6.1.2 לשטוף אותם בעדינות עם 5 מיליליטר (37 ° C) HBSS חמות, להתייחס אליהם עם 5 מ של טריפסין-EDTA עבור 5 דקות בחממה תא, הוסף 5 מ של בינוני 1 להפסיק את הפעילות טריפסין, להעביר התליה תא צינור 15 מ"ל.
    3. Centrifuge התאים ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב RT. לשאוב תגובת שיקוע והוסף בינוני 2 לספירת תאים.
    4. 4 תאי זרע 8 x 10 טוב על צלחת מצופה עם 3 מ"ל של 2 בינוני ולשמור אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20-24 ח' שינוי המדיום עד 3 מ"ל של 3 בינוני.
      הערה: אנו ממליצים על שימוש בינוני המכילים ריכוז נמוך סרום — וללא תוספי מזון — עבור ה 20-24 הראשון. המלצנו באמצעות < הנהרות תא 60% (כלומר, המספר הנייד של שלב 6.3.4 יש יותאם בהתאם גודל התא וקצב גדילה).
    5. התרבות התאים עבור 21 d ושנה המדיום בכל בתלת-ממד.
    6. לוודא הטבע אנדותל של תאים על-ידי מכתימה אותם עם סמן אנדותל כגון Willebrand פון פקטור (vWF), מיקרוסקופיה פלורסצנטיות ביצוע.
      1. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS ולתקן את התאים ב- 3.7% פורמלדהיד למשך 2 דקות ב- RT.
      2. Permeabilize התאים עם 0.1% X טריטון ddH2O (או PBS) במשך 30 דקות, לחסום את זה עם נסיוב עז 10% 1 h RT.
      3. דגירה התאים עם אנטי-פון Willebrand גורם נוגדנים (1: 100) במשך 48 שעות ב 4 ° C
      4. לשטוף את התאים 3 x עם 1 מ"ל ל- PBS, 10 דקות בכל פעם. תקופת דגירה אותם עם אלקסה עבור חיל הים 546 עז ארנב אנטי משני נוגדנים (שבערך) של h 1 ב RT בחושך.
      5. תשטוף שוב 3 x, למשך 10 דקות כל אחד, עם 1 מ"ל ל- PBS. כתם גרעינים תא עם 4'6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (דאפי; שבערך) עבור 5 דקות ב RT בחושך.
      6. לשטוף את התאים 3 x, למשך 5 דקות כל אחד, עם 1 מ"ל ל- PBS. הר התאים ואחסן אותם ב 4 ° C
        הערה: התנאים culturing (המצע, בינוני, ריאגנטים משלימה, וריכוז FBS) של שלבים 6.1 ו- 6.3 מתוארים באיור3.
  4. צינור היווצרות assay
    1. מטריצה קרום המרתף (למשל, Matrigel, המכונה מעתה ואילך מטריקס) להכין צלחת.
      1. הפשרת המטריצה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      2. המעיל צלחת 96-ובכן עם 100 µL המטריקס על קרח.
        הערה: חשוב להימנע בועות במטריקס. לוחיות הרישוי חייב להיות מצופה בקרח כדי למנוע את jellification של המטריקס.
      3. לשמור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. האחות המדיום מתאי (לאחר סיום שלב 6.3.5) לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר (37 ° C) HBSS חמות ובעדינות לטפל בהם עם טריפסין-EDTA בשביל 5 דקות בחממה התא. להוסיף 3 בינוני להפסיק את הפעילות טריפסין ולהעביר התליה תא ל צינור 15 מ"ל.
    3. Centrifuge התאים ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב RT. לשאוב תגובת שיקוע, להוסיף 1 מ"ל של 3 בינוני, ו pipet בעדינות.
    4. לסנן את התאים עם מסננת תא מיקרומטר 35, אם התאים נצברות.
    5. לספור את התאים, זרע 2 x 103 כדי 4 x 103 תאים µL 100 של 3 בינוני בכל מטריצה מצופים היטב. לקחת את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס בחממה תא עבור 16 h.
    6. צלם תמונה עם מיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה X 2.
      הערה: במקרה של trypsinization לא שלם, להאריך את זמן החשיפה כדי טריפסין-EDTA למקסימום של 7-8 דקות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בידוד SP-CPC העכבר:

במחקר זה, השתמשנו CPCs העכבר מבודד על פי פנוטיפ SP, ואילו תוצאות של עכברוש CPCs ששינה והוסיף מן הדוח הקודם עם הרשאה (איור 8)33.

התפשטות תאים מתחת הצפיפויות גבוהות ונמוכות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

היתרונות של פרוטוקול זה:

פרוטוקול זה מספק טכניקה בידול אנדותל של CPCs. מצאנו כי ריכוז בסרום נמוכה בעלת צפיפות נמוכה תא יכול לשפר את היעילות של בידול אנדותל, לפיה LN נוכחו להיות מצע מתאים יותר מאשר FN בתנאים אלה. . היינו שני סוגים שונים של CPCs: עכברוש CPCs, אשר היו בשימוש של התא, כמו קו בא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים תודה ורה לורנץ את תמיכתה מועיל במהלך הניסויים, והעובדים מהמתקן Flow Cytometry מן המחלקה וההתערבות (DBM), האוניברסיטה אוניברסיטת בית החולים באזל. עבודה זו נתמכה על ידי השהייה בעל המסלול לתוכנית של אוניברסיטת בזל (Michika מוצ'יזוקי). גבריאלה מ Kuster נתמך על ידי מענק של קרן המדע הלאומית השוויצרית (310030_156953 מספר גרנט).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Culture medium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)ThermoFisher#12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 HamMerck#D8437
Penicillin-Streptomycin (P/S)ThermoFisher#15140122
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone#SH300713.5% (0.1% for lineage induction)
L-Glutamine ThermoFisher#25030Final concentration 2 mM
GlutathioneMerck#G6013
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)Peprotech#AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)Peprotech#AF-100-18B
B27 SupplementThermoFisher#17504044
Cardiotrophin 1 Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, Switzerland#100-125
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#14170
0.05 % Trypsin-EDTAThermoFisher#25300
T75 FlaskSarstedt#83.3911
Endothelial differentiation  
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Ham's F-12K (Kaighn's) MediumThermoFisher#21127
Laminin Merck#L2020
Fibronectin Merck#F4759Dilute in ddH2O
6 Well PlateFalcon#353046
Formaldehyde SolutionMerck#F1635Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)
Triton X-100Merck#934200.1% in ddH2O
Normal Goat Serum (10%)ThermoFisher#50062Z
Anti-von Willebrand Factor antibodyAbcam#ab69941:100 in 10% goat serum
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546ThermoFisher#A110101:500 in 10% goat serum
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)ThermoFisher#622471:500 in ddH2O 
SlowFade Antifade KitThermoFisher#S2828
BX63 widefield microscopeOlympus
Tube formation
96 Well PlateFalcon#353072
5 ml Round Bottom Tube with Strainer CapFalcon#352235
Matrigel Growth Factor ReducedCorning#354230
IX50 widefield microscopeOlympus
Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 
Reagents
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.in house hospital pharmacy#9077862Working solution: 200 mg/kg
Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#20012
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-)ThermoFisher#14175Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS  for quenching Collagenase B activity 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, PyruvateThermoFisher#331885Prepare DMEM + 10% FBS  + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining
Penicillin-Streptomycin  (P/S)ThermoFisher#15140122
HEPES 1 MThermoFisher#15630080Final concentration 25 mM
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone#SH30071
RBC LysisBuffer (10X)BioLegend#420301/100mLDilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter
Collagenase BMerck#11088807001Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter
bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)Merck#B2261Prepare 1 mg/mL in ddH2O
Verapamil-hydrochloride Merck#V4629Final concentration 83.3 µM 
APC Rat Anti-Mouse CD31BD Biosciences#5512620.25 µg/107cells
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)BD Biosciences#5574050.6 µg/107cells
7-Aminoactinomycin D (7-ADD)ThermoFisher#A13100.15 µg/106cells
APC rat IgG2a k Isotype ControlBD Biosciences#5539320.25 µg/107cells
FITC Rat IgG2a k Isotype ControlBD Biosciences#5546880.6 µg/107cells
Material
Needles 27GTerumo#NN-2719R
Needles 18GTerumo#NN-1838S
Single Use Syringes 1 mL sterileCODAN#62.1640
Transferpipette 3.5 mLSarstedt#86.1171.001
Cell Strainer 40 µm blueBD Biosciences #352340
Cell Strainer 100 µm yellowBD Biosciences#352360
Lumox Dish 50Sarstedt#94.6077.305
Culture Dishes P100Corning#353003
Culture Dishes P60Corning#353004
Mouse
LineAgeBreeding
C57BL/6NRj / male12 weeksin house
Product NameCompanyCatalogue No.
Reagents
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)ThermoFisher#12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 HamMerck#D8437
Penicillin-Streptomycin  (P/S)ThermoFisher#15140122
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone#SH30071
L-Glutamine ThermoFisher#25030
GlutathioneMerck#G6013
B27 SupplementThermoFisher#17504044
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)Peprotech#AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)Peprotech#AF-100-18B
Cardiotrophin 1 Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, Switzerland #100-125
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. 
Product NameMedium 18Medium 2Medium 3
ReagentsCultureLineage inductionEndothelial diff.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)35%35%
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham65%65%
Penicillin-Streptomycin  (P/S)1%1%
Fetal Bovine Serum (FBS)3.5%≤0.1%
L-Glutamine 2 mM2 mM
Glutathione0.2 nM0.2 nM
B27 Supplement1.3%
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)6.5 ng/mL
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)13 ng/mL
Cardiotrophin 1 0.65 ng/mL
Thrombin0.0005 U/mLAll necessary components included in the kit
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKitAll necessary components included in the kit

References

  1. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
  2. Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
  3. Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255(2012).
  4. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  5. Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
  6. Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
  7. Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
  8. Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930(2015).
  9. Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
  10. El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
  11. Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
  12. Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
  13. Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
  14. Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
  15. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
  16. Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
  17. Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
  18. Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
  19. Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
  20. Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
  21. Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
  22. Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
  23. Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
  24. Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
  25. Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  27. Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
  28. Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
  29. Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195(2009).
  30. Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669(2011).
  31. Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
  32. Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260(2014).
  33. Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
  34. Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
  35. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  36. Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved