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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo describe una técnica de diferenciación endotelial de las células progenitoras cardíacas. Se centra especialmente en cómo la concentración del suero y la densidad de siembra de células afectan el potencial de diferenciación endotelial.

Resumen

Las células progenitoras cardíacas (CPCs) pueden tener potencial terapéutico para la regeneración cardiaca después de la lesión. En el corazón mamífero adultos, CPCs intrínsecos son muy escasos, pero CPCs ampliadas podrían ser útiles para la terapia celular. Un requisito previo para su uso es su capacidad para distinguir de forma controlada en los diferentes linajes cardiacos utilizando protocolos definidos y eficientes. Además, en vitro expansión, CPCs aislaron de pacientes o modelos preclínicos de la enfermedad pueden ofrecer herramientas de investigación fructífero para la investigación de los mecanismos de la enfermedad.

Los estudios actuales utilizan diferentes marcadores para identificar CPCs. Sin embargo, no todos se expresan en los seres humanos, que limita el impacto traslacional de algunos estudios preclínicos. Protocolos de diferenciación que son aplicables independientemente de la expresión de la técnica y el marcador de aislamiento permitirá la expansión estandarizada y cebado de CPCs para propósito de la terapia celular. Aquí describimos que el cebado de CPC bajo condiciones de densidad celular baja y una concentración baja del suero bovino fetal (FBS) facilita la diferenciación endotelial de CPCs. utilizando dos subpoblaciones diferentes de ratón y rata CPCs, demostramos que eso laminin es más sustrato adecuado de fibronectina para este propósito bajo el siguiente protocolo: después de cultivo de 2-3 días en medio incluyendo suplementos que mantienen multipotencia y con 3.5% FBS, CPCs son sembradas en laminina en < 60% confluencia y cultivadas en medio sin suplemento con bajas concentraciones de FBS (0.1%) durante 20-24 horas antes de la diferenciación en medio de la diferenciación endotelial. Porque CPCs son una población heterogénea, las concentraciones séricas y tiempos de incubación deba ajustarse dependiendo de las propiedades de la subpoblación de CPC respectiva. Teniendo en cuenta esto, la técnica puede aplicarse a otros tipos de CPC así y proporciona un método útil para investigar el potencial y los mecanismos de diferenciación y cómo se ven afectados por la enfermedad al utilizar CPCs de modelos de la enfermedad respectiva.

Introducción

Estudios recientes apoyan la existencia de las células progenitoras cardíacas residentes (CPC) en el corazón mamífero adulto1,2,3, y CPC podría ser una fuente útil para la terapia de la célula después de lesión cardíaca4, 5. Además, CPCs ampliados pueden proporcionar un modelo fructuoso para la detección de drogas y la investigación de los mecanismos de la enfermedad cuando están aisladas de pacientes con cardiomiopatías raros, o de enfermedad respectiva modelos6,7.

CPCs aislados del corazón adulto poseen/progenitoras celulares características1,2,3,8 como son multipotentes, clonogenic, y tienen la capacidad de auto renovación. Sin embargo, hay muchas poblaciones diferentes (sub) de CPCs exhibir perfiles de diferentes marcadores de superficie, incluyendo, por ejemplo, c-kit, Sca-1 y otros, u obtenido por técnicas de aislamiento diferentes (tabla 1). Varios protocolos de diferenciación y cultura han sido establecidos1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Estos protocolos varían sobre todo con respecto al factor de crecimiento y contenido de suero, que se ajustan según el propósito del cultivo y que pueden conducir a diferencias en los resultados y los resultados, incluyendo la eficiencia de la diferenciación.

Técnicas de aislamiento basadas en marcadores:

CPC puede ser aislado basado en un marcador de superficie específico expresión1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Estudios previos sugieren que c-kit y Sca-1 son los mejores marcadores para aislar residente CPC1,11,14,19,20. Porque ninguno de estos marcadores es realmente específico para CPC, generalmente se aplican combinaciones de marcadores diferentes. Por ejemplo, mientras que los CPCs expresan bajos niveles de c-kit21, c-kit se expresa también por otros tipos celulares, incluyendo células de mástil22, células endoteliales23y de células progenitoras hematopoyéticas24. Un problema adicional es el hecho de que no todos los marcadores se expresan a través de todas las especies. Este es el caso de Sca-1, que expresa en ratón pero no en humanos25. Por lo tanto, utilizando protocolos que son independientes de los marcadores de aislamiento puede ser ventajoso a la vista de los ensayos clínicos y estudios con muestras humanas.

Técnicas de aislamiento independiente del marcador:

Existen varias técnicas importantes de aislamiento de la CPC, que son sobre todo independientes de la expresión superficial del marcador, pero que se puede refinar la selección consecutivos de subfracciones de marcador positivo específicos según sea necesario (ver también tabla 1). (1) la técnica de la población (SP) de lado originalmente se ha caracterizado en una población primitiva de las células madre hematopoyéticas, basado en la capacidad de emanación el tinte DNA Hoechst 3334226 de ATP-binding cassette (ABC) transportadores27. Células cardíacas de SP han sido aisladas por los distintos grupos y registrados para expresar una variedad de marcadores con algunas diferencias menores entre informes2,8,13,14. (2) células unidad formación de colonias de fibroblastos (CFU-Fs) originalmente se han definido en base a una células mesenquimales estromales (MSC)-como fenotipo. MSCs aislados se cultivan en los platos para inducir la formación de la Colonia. Formadoras de colonias MSC-como CFU-Fs puede ser aislado del corazón adulto y son capaces de diferenciarse en linajes cardíaca15. (3) Cardiosphere-las células derivadas de (enfermedades CDC) son las células derivadas de racimos de células de biopsias de tejido o explantes28,29,30,31. Recientemente fue demostrado que sobre todo la CD105+/CD90 /c-kit– –fracción de la célula exhibe cardiomiogenético y potencial regenerativo32.

Con SP-CPC aislado de ratones, presentamos un protocolo para la inducción eficiente de linaje endotelial basado en un estudio previo en el CPCs de rata y ratón CPCs SP33. El protocolo contiene adaptaciones específicas a la cultura y la técnica de expansión con respecto a la densidad celular, el contenido de suero del medio y el sustrato. Se puede aplicar no sólo a ratón SP-CPC pero distintos tipos de CPC para el propósito de inducir un cambio de destino de una amplificación a un CPC endoteliales comprometido, ya sea ante el trasplante de estas células o su uso para estudios mecanísticos en vitro .

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Protocolo

El uso de ratones para propósito de aislamiento celular estaba de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y con la ley de protección Animal Suiza y fue aprobado por las autoridades cantonales suizas.

Nota: El aislamiento de Sca-1+/CD31– SP-CPC desde el corazón de ratón se hizo esencialmente descrita34 con algunas modificaciones. Para los materiales y reactivos utilizados, véase Tabla de materiales. Para todos los experimentos, SP-CPC cardiaco aislado de ratones era amplificado pasado y de célula línea-como forma. Pasos 7-20 se utilizaron para este estudio.

1. preparación de tejido

Nota: Todos los experimentos con ratones se realizarán según las normas y reglamentos. Este protocolo utiliza cuatro ratones. Placas que son de 100 mm de diámetro se describen como P100 y placas que son de 60 mm de diámetro se describen como P60 para las siguientes partes del protocolo.

  1. Inyectar cada ratón con 200 mg/kg de pentobarbital por vía intraperitoneal (i.p.) y espere hasta que totalmente está anestesiada comprobando su respuesta para dedos pellizcando.
  2. Limpie el pecho con etanol al 70%. Corte la piel y la pared torácica con unas tijeras para exponer la cavidad torácica.
  3. Levantar el corazón con unas pinzas y cortar en la base con unas tijeras. Poner el corazón en un P100 con 25 mL (5 mL para P60) de frío con tampón fosfato salino (PBS) (tres a cinco corazones por P100) o uno a dos corazones por P60.
  4. Bomba el corazón con unas pinzas para extraer la sangre de las cavidades (figura 1A).
  5. Poner el corazón en un P100 con 25 mL (5 mL para P60) de PBS frío para lavar. Retire las aurículas con unas tijeras pequeñas. Cortar el corazón en dos piezas longitudinales y lavarlos otra vez en PBS helado (25 mL/P100, 5 mL/P60).
  6. Transferencia de las piezas a un P100 nueva con 25 mL (5 mL para P60) de PBS frío. Cortar en trozos pequeños con unas tijeras pequeñas (figura 1B). Añadir una gota de colagenasa 1 mg/mL B diluido en solución salina balanceada de Hank (HBSS) y pique las piezas pequeñas con una hoja de afeitar estéril (figura 1).

2. la digestión

  1. Añadir 10 mL (2,5 mL en P60) de la solución de B de colagenasa 1 mg/mL en el plato de paso 1.6.
  2. Poner la solución de colagenasa B que contiene las piezas de corazón picado en una inclinada (30°) P100 (o P60) en una incubadora de 37 ° C (figura 1).
  3. Incubar las piezas de corazón picado para un máximo de 30 minutos; Homogeneizar por pasar repetidamente a través de una pipeta Pasteur cada 10 min durante la incubación (Figura 1E).
    Nota: Es importante no superar los 30 min de incubación en total para el paso 1.3.

3. filtración

  1. Añadir 10 mL (5 mL para P60) de frío HBSS suplementado con 2% FBS a las piezas de corazón picada y homogeneizada.
    Nota: HBSS suplementado con 2% FBS arrestina B colagenasa.
  2. Filtrar las piezas de corazón con 100 μm filtro para eliminar el tejido no digerida y centrifugar a 470 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT) (Figura 1F, filtros amarillo).
  3. Descarte el sobrenadante y resuspender el precipitado en 5 mL (3 mL para P60) de tampón de lisis de glóbulos rojos e incubar el sedimento durante 5 minutos con agitación ocasional en el hielo.
  4. Añadir 10 mL (5 mL para P60) de PBS (para detener la reacción de lisis) y filtrar la muestra a través de un filtro de 40 μm para excluir las celdas más grandes, incluyendo los cardiomiocitos residual (Figura 1F, filtros azul).
  5. Centrifugar el tubo a 470 x g durante 5 min a temperatura ambiente (sin freno). Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de DMEM incluyendo 10% FBS.
  6. Contar las células en una alícuota con un hemocitómetro. Resuspender las células con DMEM incluyendo 10% FBS, apuntando a una concentración celular final de 1 x 106 células/mL.
    Nota: Aproximadamente 5 x 106 células agotadas de cardiomiocitos y eritrocitos pueden estimarse por ratón.
  7. Distribuir las células en dos tubos (figura 2): en el tubo, agregar 1,5 mL para la tinción de Hoechst 33342 con verapamilo; en el tubo B, añadir 18,5 mL para la tinción de Hoechst 33342 y proceder a la mancha y ordenados células cardíacas de SP (pasos 4.1 y 4.2) por citometría de flujo.

4. clasificación de las células cardiacas SP mediante citometría de flujo

Nota: Verapamilo inhibe la emanación de Hoechst bloqueando la actividad de transportador ABC (MDR) la resistencia del multidrug. Hoechst 33342 es un tinte de unión al ADN que puede utilizarse para detectar el ciclo celular ya que se correlaciona con el contenido de ADN en las células vivas. Extrusión de Hoechst 33342 células aparecen en la parte baja de Hoechst de ambos canales de emisión (450 nm, azul de Hoechst; 650 nm, rojo de Hoechst), es decir, a un lado de la Hoechst-retener la "población principal del, dándoles su nombre"lado población". SP células están enriquecidas en células con propiedades de progenitoras y una alta expresión de transportadores de ABC multidrug-resistente (como MDR1 y ABCG2). Hoechst 33342 está escrito como Hoechst para las siguientes partes del protocolo. Es importante proteger los materiales sensibles a la luz para los resultados ideales.

  1. Tinción con Hoechst en presencia y ausencia de verapamilo
    1. Agregar verapamilo (con una concentración final de 83.3 μm) y Hoechst (con una concentración final de 5 μg/106 células) a la solución de la célula. Para el tubo, use Verapamil y Hoechst; tubo B, sólo para uso Hoechst. Incubar en un baño de agua (a 37 ° C) durante 90 minutos y revertir los tubos cada 20 min (figura 1).
    2. Centrifugar los tubos a 470 x g durante 5 min a TA. descartar el sobrenadante y resuspender cada precipitado en HBSS (1 x 106 células/mL).
    3. Tomar 1,5 mL alícuota para los stainings únicos y el control negativo del tubo B (figura 2): (i) isotiocianato de fluoresceína (FITC)-conjugado anti-Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-conjugado anti-CD31; (iii) nonstained las células (control negativo).
      Nota: Controles de isotipo se utilizan aquí para configurar el protocolo de aislamiento.
    4. Centrifugar los tubos A y B y las alícuotas del control negativo y tinción solo 470 x g durante 5 min a temperatura ambiente para el lavado de Hoechst y verapamilo.
    5. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet de tubo y (iii) el control negativo en 250 μl de HBSS y mantenerse en hielo en la oscuridad hasta la clasificación.
    6. Resuspender el precipitado de tubo B en 200 μL de la HBSS y la pelotilla (i, ii) las alícuotas manchas solo en 100 μl de HBSS. Añadir conjugado con FITC anti-Sca-1 (0,6 μg/107 células) y conjugado con APC anti-CD31 (0,25 μg/107 células). Incubar las pelotillas por 30 min en hielo y sacudirlas de vez en cuando en la oscuridad.
    7. Añadir 2 mL de HBSS a los tubos. Centrifugar los tubos a 470 x g durante 5 min a TA.
    8. Desechar el sobrenadante y resuspender los pellets con 1 mL de HBSS y centrifugue como arriba. Deseche el sobrenadante. Resuspender el precipitado de las alícuotas de manchas solo en 200 μL de HBSS. Resuspender el precipitado de tubo B en HBSS (20 x 106 células/mL).
    9. Mantener las muestras en hielo y protegidos de la luz hasta la clasificación.
  2. Clasificación con citometría de flujo
    1. Preparación estéril 1.5 mL clasificación tubos con 500 μl de HBSS incluyendo 2% FBS.
    2. Se tiñen las células con aminoactinomycin 7 D (7-AAD) (0,15 μg/106 células) en hielo durante 10 min a excluir las células muertas.
    3. Ordenar el SP cardiaco con la siguiente configuración: excitación Hoechst con 350 excitación nm (UV), recoger la emisión de fluorescencia con un filtro de paso de banda de 450/50 nm (Hoechst azul) y un filtro de paso banda 670/30 nm (Hoechst rojo) y utilizar un tamaño de boquilla de 100 μm y presión de 15 psi.
    4. Para el análisis, registro 5 x 105 eventos para las muestras de clasificación y 1 x 105 eventos para el control negativo, control de verapamilo y manche solo muestras.
      Nota: La cardíaca es alrededor del 0.5% - 2% (figura 1 H) pero puede variar entre laboratorios y aislamientos. El Sca-1+/CD31– fracción está alrededor de 1% - 11% de la total SP cardiaca (figura 1I) pero puede variar entre laboratorios y aislamientos. SCA-1+/CD31– SP-CPC se escribe como SP-CPC para las siguientes partes del protocolo.

5. primaria cultura de SP aislado-CPC

Nota: Se utilizaron tres tipos diferentes de medios de comunicación en el presente Protocolo. Ellos se denominan medio 1 (según Noseda et al.) 8, medio 2 y 3 medio y están describen en la Tabla de materiales con respecto a su composición.

  1. Calentar medio 1 a 37 ° C antes de usarlo y enfriar el centrifugar a 4 ° C. Centrifugar los tubos clasificación a 4 ° C y 470 x g durante 6 min y resuspender las células en el medio 1.
  2. Poner las células en un plato de P60 permeables al gas con 4 mL de medio de 1. Cambiar el medio cada 3 d hasta que las células hayan alcanzado el 70% - 80% de confluencia.
    Nota: Paso 5.2 puede tomar alrededor de 2-3 semanas.

6. expansión y diferenciación de SP-CPC

  1. Cultivo de células
    1. Cultura 3 x 105 CPCs SP en 8 mL de medio de 1 en un matraz T75.
    2. SP-CPC de incubar a 37 ° C con 5% CO2 hasta confluencia de 70% - 80%, cambiando el medio cada 2-3 d.
      Nota: El número de celular debe ser modificado según el tipo de CPCs utilizados, el tiempo de duplicación y el tamaño de celda.
  2. SP-CPC crecimiento y viabilidad con concentraciones distintas de suero
    1. Cultura SP-CPC para 2-3 d en T75 frascos con 8 mL de medio de 1. Cuidadosamente aspirar el medio y lavar con 5 mL de caliente (37 ° C) HBSS.
    2. Tratar las células con 5 mL de tripsina-EDTA por 5 min en la incubadora de la célula, añadir 5 mL de medio 1 dejar la actividad de tripsina y transferir la suspensión de células a un tubo de 15 mL.
    3. Centrifugar las células a 470 x g durante 5 min a TA.
    4. Resuspender las células en medio 1 o 2 medio (medio de inducción de linaje) y placa de 2.5 x 105 SP-CPC P60 platos con 3 mL de medio con suero diferentes concentraciones.
    5. Recoger el medio del plato de paso 6.2.4 para la colección de células muertas en un tubo de 15 mL después de 2 d de cultivo en medio 1 y medio 2.
    6. Trypsinize células adherentes como en el paso 6.2.2 y recoger la suspensión de células en el tubo de 15 mL de paso 6.2.5. Centrifugar las células a 840 x g durante 5 min a TA.
    7. Aspirar el sobrenadante y agregar 1 mL de medio de 1 o 2 medio para el recuento celular. La mancha SP-CPC con azul de tripán (0.4%) y cuenta trypan azul positivo (muertos) y trypan azul negativo células (viables).
      Nota: La viabilidad celular (paso 6.2.7) es dado como el número de la célula negativo azul de tripano en relación al número total de células.
  3. Inducción de la diferenciación endotelial
    1. Precapa una placa de cultivo (6-bien) con 10 μg/mL de laminina (LN) o fibronectina (FN).
      1. Hacer una solución de sustrato que contiene 10 μg/mL de LN o FN con medio de F12 (o PBS). Añadir 2 mL de solución sustrato a cada pocillo. Mantener la placa durante 30 min a 37 ° C.
      2. Aspire la solución de la placa y agregar 2 mL de PBS a cada pocillo hasta usarlo.
    2. Aspirar el medio de las células de paso 6.1.2, enjuague suavemente con 5 mL de caliente (37 ° C) HBSS, tratar con 5 mL de tripsina-EDTA por 5 min en la incubadora de la célula, añadir 5 mL de medio 1 dejar la actividad de tripsina y transferir la suspensión de células a un tubo de 15 mL.
    3. Centrifugar las células a 470 x g durante 5 min a TA. aspirar el sobrenadante y añadir 2 medio para el recuento celular.
    4. Semilla 8 x 104 células por pozo de la placa revestida con 3 mL de medio 2 y mantienen a 37 ° C durante 20-24 h. cambio el medio a 3 mL de medio de 3.
      Nota: Recomendamos usar el medio con una concentración baja del suero y sin suplementos, para las primeras 20 a 24 h. Se recomienda utilizar < 60% confluencia de células (es decir, el número de células de paso 6.3.4 debe ser ajustada dependiendo de la tasa de crecimiento y tamaño celular).
    5. Las células de 21 d la cultura y cambiar el medio cada 3 d.
    6. Verificar la naturaleza endotelial de las células diferenciadas por tinción con un marcador endotelial como von Willebrand Factor (FvW) y realizar microscopía de fluorescencia.
      1. Lavar las células con 1 mL de PBS y fijar las células en 3.7% de formaldehído durante 2 min a TA.
      2. Permeabilizar las células con 0,1% Triton X en ddH2O (o PBS) durante 30 min y bloque con 10% de suero de cabra de 1 h a TA.
      3. Incubar las células con el anticuerpo de anti-von Willebrand factor (1: 100) por 48 h a 4 ° C
      4. Lavar las células 3 x con 1 mL de PBS durante 10 minutos cada vez. Incubar con Alexa Fluor 546 anticuerpo secundario de cabra anti-conejo (1: 500) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
      5. Lave otra vez 3 x, de 10 minutos cada uno, con 1 mL de PBS. Teñir los núcleos celulares con 4'6-diamidino-2-phenylindole, diclorhidrato (DAPI; 1: 500) por 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
      6. Lavar las células 3 x, 5 minutos cada uno, con 1 mL de PBS. Montaje de las células y almacenar a 4 ° C
        Nota: Las condiciones de cultivo (sustrato, medio, reactivos suplementarios y concentración FBS) de medidas 6.1 y 6.3 se describen en la figura 3.
  4. Ensayo de formación de tubo
    1. Preparar una matriz de la membrana del sótano (p. ej., Matrigel, en adelante denominado matriz) placa.
      1. Descongelar la matriz a 4 ° C durante la noche.
      2. Cubrir una placa de 96 pocillos con 100 μl de la matriz en el hielo.
        Nota: Es importante evitar las burbujas en la matriz. Las placas tienen que ser cubierto en hielo para evitar la gelificación de la matriz.
      3. Mantener la placa a 37 ° C durante 30 minutos.
    2. Aspirar el medio de las células (después de la terminación del paso 6.3.5) suavemente enjuague las celdas con 5 mL de caliente (37 ° C) HBSS y tratarlos con tripsina-EDTA por 5 min en la incubadora de la célula. Añadir medio 3 para detener la actividad de tripsina y transferir la suspensión de células a un tubo de 15 mL.
    3. Centrifugar las células a 470 x g durante 5 min a TA. Aspire el sobrenadante, agregar 1 mL de medio 3 y pipetee suavemente.
    4. Si las células se agregan del filtro con un tamiz de 35 μm celular, las células.
    5. Contar las células y 2 x 103 4 x 103 células en 100 μl de medio de 3 en cada matriz-cubrió bien la semilla. Mantenga la placa a 37 ° C en la incubadora de la célula durante 16 h.
    6. Tome una foto con un microscopio de campo brillante con 2 aumentos.
      Nota: En el caso de una incompleta tripsinización, prolongar el tiempo de exposición a tripsina-EDTA a un máximo de 7-8 minutos.

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Resultados

Aislamiento de SP-CPC del ratón:

En este estudio, utilizamos el CPC de ratón aislado según el fenotipo de SP, mientras que resultados de rata CPCs son modificados y añadidos de un anterior informe con permiso (figura 8)33.

Proliferación celular en celulares alta y baja densidad y con concentraciones distintas de suer...

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Discusión

Ventajas de este protocolo:

Este protocolo proporciona una técnica de diferenciación endotelial del CPCs. Hemos encontrado que una concentración baja del suero y densidad celular baja podrían mejorar la eficiencia de diferenciación endotelial, por el que LN demostró para ser un sustrato más adecuado que el FN en estas condiciones. Utilizamos dos tipos distintos de CPC: rata CPCs, que fueron utilizadas en una línea como forma de la célula y el ratón SP-CPC, que fueron aislados y ampliado...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Vera Lorenz por su apoyo a útil durante los experimentos y el personal de la instalación de citometría de flujo del Departamento de Biomedicina (DBM), Universidad y Universidad Hospital de Basilea. Este trabajo fue apoyado por el estancia en pista programa de la Universidad de Basilea (Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster es apoyado por una beca de la Swiss National Science Foundation (grant número 310030_156953).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Culture medium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)ThermoFisher#12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 HamMerck#D8437
Penicillin-Streptomycin (P/S)ThermoFisher#15140122
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone#SH300713.5% (0.1% for lineage induction)
L-Glutamine ThermoFisher#25030Final concentration 2 mM
GlutathioneMerck#G6013
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)Peprotech#AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)Peprotech#AF-100-18B
B27 SupplementThermoFisher#17504044
Cardiotrophin 1 Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, Switzerland#100-125
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#14170
0.05 % Trypsin-EDTAThermoFisher#25300
T75 FlaskSarstedt#83.3911
Endothelial differentiation  
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Ham's F-12K (Kaighn's) MediumThermoFisher#21127
Laminin Merck#L2020
Fibronectin Merck#F4759Dilute in ddH2O
6 Well PlateFalcon#353046
Formaldehyde SolutionMerck#F1635Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)
Triton X-100Merck#934200.1% in ddH2O
Normal Goat Serum (10%)ThermoFisher#50062Z
Anti-von Willebrand Factor antibodyAbcam#ab69941:100 in 10% goat serum
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546ThermoFisher#A110101:500 in 10% goat serum
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)ThermoFisher#622471:500 in ddH2O 
SlowFade Antifade KitThermoFisher#S2828
BX63 widefield microscopeOlympus
Tube formation
96 Well PlateFalcon#353072
5 ml Round Bottom Tube with Strainer CapFalcon#352235
Matrigel Growth Factor ReducedCorning#354230
IX50 widefield microscopeOlympus
Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 
Reagents
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.in house hospital pharmacy#9077862Working solution: 200 mg/kg
Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#20012
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-)ThermoFisher#14175Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS  for quenching Collagenase B activity 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, PyruvateThermoFisher#331885Prepare DMEM + 10% FBS  + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining
Penicillin-Streptomycin  (P/S)ThermoFisher#15140122
HEPES 1 MThermoFisher#15630080Final concentration 25 mM
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone#SH30071
RBC LysisBuffer (10X)BioLegend#420301/100mLDilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter
Collagenase BMerck#11088807001Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter
bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)Merck#B2261Prepare 1 mg/mL in ddH2O
Verapamil-hydrochloride Merck#V4629Final concentration 83.3 µM 
APC Rat Anti-Mouse CD31BD Biosciences#5512620.25 µg/107cells
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)BD Biosciences#5574050.6 µg/107cells
7-Aminoactinomycin D (7-ADD)ThermoFisher#A13100.15 µg/106cells
APC rat IgG2a k Isotype ControlBD Biosciences#5539320.25 µg/107cells
FITC Rat IgG2a k Isotype ControlBD Biosciences#5546880.6 µg/107cells
Material
Needles 27GTerumo#NN-2719R
Needles 18GTerumo#NN-1838S
Single Use Syringes 1 mL sterileCODAN#62.1640
Transferpipette 3.5 mLSarstedt#86.1171.001
Cell Strainer 40 µm blueBD Biosciences #352340
Cell Strainer 100 µm yellowBD Biosciences#352360
Lumox Dish 50Sarstedt#94.6077.305
Culture Dishes P100Corning#353003
Culture Dishes P60Corning#353004
Mouse
LineAgeBreeding
C57BL/6NRj / male12 weeksin house
Product NameCompanyCatalogue No.
Reagents
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)ThermoFisher#12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 HamMerck#D8437
Penicillin-Streptomycin  (P/S)ThermoFisher#15140122
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone#SH30071
L-Glutamine ThermoFisher#25030
GlutathioneMerck#G6013
B27 SupplementThermoFisher#17504044
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)Peprotech#AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)Peprotech#AF-100-18B
Cardiotrophin 1 Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, Switzerland #100-125
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. 
Product NameMedium 18Medium 2Medium 3
ReagentsCultureLineage inductionEndothelial diff.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)35%35%
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham65%65%
Penicillin-Streptomycin  (P/S)1%1%
Fetal Bovine Serum (FBS)3.5%≤0.1%
L-Glutamine 2 mM2 mM
Glutathione0.2 nM0.2 nM
B27 Supplement1.3%
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)6.5 ng/mL
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF)13 ng/mL
Cardiotrophin 1 0.65 ng/mL
Thrombin0.0005 U/mLAll necessary components included in the kit
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKitAll necessary components included in the kit

Referencias

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