Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذه الدراسة، نقدم على بروتوكول فعال لعزل الخلايا الليمفاوية ورواية من البقع في بير (PPs)، التي يمكن أن تستخدم بعد ذلك لفحوصات الوظيفية في الجسم الحي وفي المختبر ، فضلا عن دراسات سيتوميتريك تدفق من تي جرابي مساعد وخلايا مركز جيرمنال ب.

Abstract

في مخاطية القناة الهضمية، تشكل الخلايا المناعية كيان مناعية فريدة، التي تعزز التسامح المناعي بينما وفي الوقت نفسه منح الدفاع محصنة ضد مسببات الأمراض. ومن الثابت أن البقع في بير (PPs) دوراً أساسيا في شبكة المخاطي محصنة باستضافة عدة المستجيب T وخلية بمجموعات فرعية. شريحة معينة من هذه الخلايا المستجيب، ومساعد تي الحبيبي (طفح) ومركز جيرمنال (GC) ب الخلايا هي إضفاء الطابع المهني في تنظيم الحصانة humoral. ومن ثم فإن وصف هذه المجموعات الفرعية خلية داخل المركز الصحفي من حيث التمييز بين البرنامج والخصائص الوظيفية يمكن أن توفر معلومات هامة حول حصانة المخاطي. وتحقيقا لهذه الغاية، سيكون طريقة المطبق بسهولة وكفاءة واستنساخه من اللمفاويات في معزل عن المكتب الصحفي قيمة للباحثين. في هذه الدراسة، ونحن تهدف إلى إيجاد وسيلة فعالة لعزل الخلايا الليمفاوية من المكتب الصحفي للماوس مع خلية عالية الغلة. نهجنا كشفت أن النسيج الأولية المعالجة مثل استخدام الكواشف الجهاز الهضمي والتهيج الأنسجة، فضلا عن الخلية المصبوغة الظروف واختيار لوحات جسم، يكون له تأثير كبير على نوعية وهوية لمفاوية معزولة وعلى النتائج التجريبية.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول تمكن الباحثين كفاءة عزل السكان اللمفاويات من المكتب الصحفي للسماح بتدفق استنساخه التقييم القائم على الخلوي لمجموعات فرعية تي وخلية بتركز أساسا على مجموعات فرعية خلية طفح وب GC.

Introduction

هو زينت الجهاز الهضمي كامل من البداية إلى النهاية مع شبكة اللمفاوية واسعة النطاق الذي يحتوي على الخلايا المناعية أكثر من أي جهاز في الإنسان والفأر1. بير بقع (PPs) تشكل عنصرا رئيسيا لفرع هذه المنظمة المناعية الخلوية، ما يسمى الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالقناة الهضمية (جالت)2،3في الأمعاء. داخل المركز الصحفي، آلاف ملايين مستضدات المشتقة من المواد الغذائية، الحجمية commensal ومسببات الأمراض التي يتم أخذ عينات باستمرار، وعندما تكون الاستجابات المناعية المناسبة اللازمة تجاهها المناعة المعوية وبالتالي الحفاظ على محمل التوازن. وفي هذا المعني، ذكر المكتب الصحفي يمكن أن يطلق عليه اسم "اللوزتين الأمعاء الدقيقة". ذكر المكتب الصحفي تتكون من الأقسام الفرعية الرئيسية: قبة سوبيبيثيليال (SED)، مناطق المسام ب-خلية كبيرة؛ السطحية المرتبطة جريب ظهارة (FAE) ومنطقة إينتيرفوليكولار (أي إف آر) حيث تكون خلايا تي يقع4. ويمنح هذا التقسيم الفريد من المكتب الصحفي المستجيب مختلفة تمكن الخلية مجموعات فرعية للتعاون، وبالتالي، السيلينيوم في القناة الهضمية.

ذكر المكتب الصحفي انعدام اللمفاوي الزبائ، ونظرا لهذا السبب، يجري المستضدات تنقل إلى الصحفي من الأمعاء لا عن طريق الأوعية اللمفاوية خلافا لمعظم الأجهزة اللمفاوية الأخرى. بدلاً من ذلك، الخلايا الظهارية المتخصصة الموجودة في صناديق النشاط الخاص، ما يسمى م الخلايا، المسؤولة عن نقل المستضدات لومينال إلى الصحفي5. وفي وقت لاحق، يتم انتقاؤها المستضدات المنقولة بالخلايا الجذعية (DCs) والبالعات التي تقع في منطقة قبة سوبيبيثيليال (SED) تحت6،FAE7. عملية الفرز هذه مستضد بوحدات تحكم المجال Dc في PP أمر حاسم لبدء الاستجابة المناعية التكيفية8 والجيل اللاحق من الخلايا المبيضي إيغا9.

نظراً للعبء الثقيل مستضدي من كومينسال النباتات والمواد الغذائية، المضيف الصحفي اندوجينوسلي المنشط المستجيب T وخلية بمجموعات فرعية في وفرة كبيرة مثل طفح وب GC إيغا+ الخلايا10، مما يوحي بأن المكتب الصحفي تمثيل موقع للمناعة النشطة 11من الاستجابة. كشف ليصل إلى 20-25% طفح خلايا CD4 مجموع+ تي الخلية المقصورة ويصل إلى 10 – 15% ب GC الخلايا داخل الخلايا ب المجموع هو ممكن في المكتب الصحفي لجمعها من الفئران C57BL/6 الشباب المطعمين12. خلافا لسائر أنواع الخلايا مساعد تي (أي.، Th1، Th2، خلايا Th17)، تظهر الخلايا طفح انتحاء فريدة من نوعها في المسام خلية باساسا بسبب التعبير CXCR5، الذي يعزز طفح الخلية صاروخ موجه على طول التدرج CXCL1313. في مناطق المسام خلية ب PPs، حمل الخلايا طفح جزئ تبديل فئة إيغا وهايبرموتيشن جسدية في تنشيط الخلايا ب من التي تميز عالية تقارب إيغا إنتاج خلايا14. وفي وقت لاحق، هذه الخلايا البلازما إفراز جسم تهاجر إلى بروبريا الصفيحة (ليرة لبنانية) وتنظيم التوازن المناعي في الأمعاء10.

تحديد وتوصيف طفح وب GC السكان خلية داخل المركز الصحفي قد تمكن الباحثين من التحقيق في ديناميات خلطيه الاستجابات المناعية تحت ظروف حالة ثابتة دون الحاجة إلى نماذج التحصين مضيعة للوقت تستخدم تقليديا في "ب" طفح-GC خلية الدراسات15،16،،من1718. تحليل الخلايا طفح داخل المكتب الصحفي غير مباشرة كمجموعات فرعية خلية أخرى. وتشمل التحديات التقنية تحديد الأنسجة مثالية إعداد الشروط، سطح جسم-علامة الجمع، فضلا عن تحديد الضوابط المناسبة الإيجابية والسلبية. حقول البحث طفح و PP يحمل تقلبات كبيرة من حيث الإجراءات التجريبية وهي أبعد ما تكون عن منح توافق في آراء وضع بروتوكولات موحدة لأسباب عدة. أولاً، يميل كل خلية فرعية داخل المكتب الصحفي خلطات متأثرة بظروف إعداد الأنسجة التي تحتاج إلى مزيد من التعديلات في طريقة فرعية محددة خلية. ثانيا، هناك اختلاف كبير بين طرق الإبلاغ عنها فيما يتعلق بتفاصيل إعداد الخلية من "لالصحفي. الثالثة"، العدد الدراسات المقارنة على أساس بروتوكول التحقيق تقنيات إعداد الأنسجة مثالية والظروف التجريبية PP وطفح البحث محدودا نوعا ما.

الدراسات الحالية المستندة إلى بروتوكول اقترح PP خلية إعداد19،20،21،22 لم تكن طفح-أو GC المنحى الخلية ب. وعلاوة على ذلك، تم العثور على بعض شروط إعداد الأنسجة الموصى بها للصحفي19،20 مثل الهضم المستندة إلى كولاجيناز تؤثر على نتائج تحديد الهوية طفح بالتدفق الخلوي سلبا على18. وعلى هذا الأساس، نحن مسبب أن بروتوكولا الأمثل وموحد وقابل لإعادة الإنتاج التي يمكن استخدامها لدراسة ديناميات خلية طفح وب GC داخل المكتب الصحفي قيمة بالنسبة للمحققين الذين يعملون على هذا الموضوع. هذه الحاجة أعطانا الحافز لتوليد بروتوكولا محسنة وحديثة لعزل وتوصيف لمفاوية PP ناعما محسن لاسترداد الخلوي وصلاحية وكفاءة لتدفق سيتوميتريك توصيف عدة تي وب مجموعات فرعية من الخلية. نحن تهدف أيضا إلى استبعاد عدة خطوات إعداد شاقة اقترح في البروتوكولات السابقة، وبالتالي الحد من التلاعب المطلوب والوقت لإعداد الخلايا والأنسجة من المكتب الصحفي.

Protocol

وأجريت جميع الدراسات والتجارب المبينة في هذا البروتوكول بموجب المبادئ التوجيهية وفقا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) من بيت إسرائيل ديكونيس الطبي.

1-تصميم الإعداد التجريبية والمجموعات الماوس

  1. (اختياري) شارك بيت الفئران التجريبية لتيسير انتقال أفقي للقناة الهضمية الحجمية بين الفئران التجريبية، والحد من التقلبات غير محددة داخل الخلايا اللمفية PP. بالإضافة إلى ذلك، استخدام عناصر تحكم ليتيرماتي من نفس الجنس للحد من التقلبات.

2-الجراحي وخطوات إعداد الأنسجة:

  1. الاستئصال الجراحي للامعاء (SI)
    1. Euthanize الفئران استخدام الخنق2 CO أو أي طريقة مناظرة أقرته لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية.
    2. نقل الماوس إلى منطقة مخصصة للاستئصال الجراحي. وضع المؤخر لأسفل وتطهير البطن مع الإيثانول 70%. القيام فتح البطن بقطع الجلد البطن والصفاق على طول خط الوسط من العانة إلى القفص الصدري مما فتح التجويف الصفاقى.
      ملاحظة: تنفيذ الشق الأول على مساحة صغيرة نسبيا من الجلد لتجنب اختراق التجويف الصفاقى وإلحاق أضرار بالانسجة المعوية. مواصلة الختان حتى الحدود التشريحية المرجوة.
    3. تحديد الأعور، الذي هو معلما مثاليا للكشف عن الدقاق المحطة الطرفية، الذي يشكل الجزء الأعلى من الأمعاء الدقيقة.
      ملاحظة: يوجد الأعور عادة في الجانب الأيسر السفلي من البطن الماوس.
    4. تحديد تقاطع إيليوكايكال وجعل خفض هذا المستوى القاصي كما قدر الإمكان فصل الأعور الأمعاء. في جميع أنحاء الخطوات المقبلة، تجنب الاتصال الجسدي المفرط مع جدار الأمعاء للصحفي هشة تنهار بسهولة عند اللمس.
    5. إزالة بلطف الأمعاء الدقيقة أكمله حتى مصرة البواب بقطع مساريق استخدام مقص. تحديد نقطة التقاء بين بواب والاثني عشر، وقص العفج على هذا المستوى، مما يؤدي إلى إكمال مفرزة من الأمعاء الدقيقة من تجويف البطن.
      ملاحظة: (ط) تجنب فرط كهذا قد يسبب تمزق جدار الأمعاء. (ثانيا) إذا كان المطلوب هو عزل اللمفاويات ليرة لبنانية بالإضافة إلى الخلايا الليمفاوية PP، من الضروري إزالة كاملة من الدهون المساريقي العلوي. بيد لعزل PP فقط، تبقى الدهون المساريقي العلوي يمكن أن توفر بعض الفوائد خلال الخطوات العزل؛ ولذلك، ينبغي الحفاظ عليها.
    6. مكان فصل الأمعاء الصغيرة في لوحة 6-بئر مليئة ربمي الباردة + 10% مصل بقرى الجنين (FBS) ولطف تحرض الأنسجة يدوياً حتى جميع شرائح المعوية مغمورة في وسائط الإعلام الباردة. المحافظة على الأنسجة على الجليد في جميع أنحاء الخطوات المقبلة.
    7. بعد تشريح العدد المطلوب من الأمعاء الصغيرة الماوس، انتقل إلى الختان PP من الأمعاء الصغيرة التي تم جمعها.
  2. الاستئصال الجراحي للصحفي، وإعداد تعليق خلية مفردة:
    1. بلطف نقل الأمعاء على منشفة ورقية التي تجتاح الدهون المساريقي العلوي باستخدام الملقط والجانب المساريقي العلوي تواجه منشفة ورقية. ترطيب الجزء معوي كامل مع الباردة ربمي + 10% FBS لتجنب جفاف الأنسجة والالتصاق.
      ملاحظة: المتبقية الدهون المساريقي العلوي يمكن أن تكون مفيدة في هذه المرحلة نظراً لشرائح الأنسجة الدهنية في موقع سي المساريقي العلوي سوف تتمسك بمنشفة ورقية حفظ الموقع المساريقي العلوي المضادة مواجهة.
    2. تحديد الصحفي، الذي يظهر كمجاميع متعددة لوبولاتيد الأبيض في شكل "قرنبيط-مثل" على الجانب مضادة المساريقي العلوي لجدار الأمعاء.
      ملاحظة: لا يوصي فلاشينغ مضمون لومينال حتى هي اقتطعت الصحفي جميع. إفراغ محتوى لومينال قد يتسبب في انهيار المركز الصحفي وسيمنع تباين اللون بين الصحفي وجدار الأمعاء، ومفيدة جداً لتحديد الهوية البصرية للمركز الصحفي.
    3. بعد تحديد المركز الصحفي في الجهة المضادة المساريقي العلوي، مكان مقص منحنى نهاية العمليات الجراحية على الصحفي (منحنى ينبغي مواجهة) تقييد PP من الحدود البعيدة والقريبة.
      اختياري: دفع PP بلطف نحو ريش مقص باستخدام الإصبع. هذه المناورة سيؤدي إلى استبعاد أفضل غير PP الأنسجة المحيطة. المكوس الصحفي بلطف، باستثناء الأنسجة المعوية المحيطة.
      ملاحظة: (ط) هذه الخطوة أمر حاسم للحصول على PP خلية الغلة القصوى مع التقليل من تلوث الخلية المجاورة المقصورات المعوية مثل ليرة لبنانية وظهاره الأمعاء، وأيضا غنية بالخلايا T. (ثانيا) من أحد SI اقتطعت من الماوس C57BL/6، يمكن جمعها الصحفي 5-10 (متوسط الحجم، لوبولاتيد متعددة). بهدف المركز الصحفي حتى أصغر (لا لوبولاتيد متعددة)، جمع يصل إلى الصحفي 12-13 للماوس (C57BL/6) من الممكن استخدام هذا البروتوكول.
    4. نقل الصحفي قصت لوح زراعة الأنسجة 12-بئر مليئة بالجليد ربمي + 10% FBS وحافظت على الجليد باستخدام الملقط أو المقص الجراحي منحنية.
      ملاحظة: (ط) فورا بعد الختان للمركز الصحفي، مخاط ومحتوى الأمعاء على سطح PP يمكن تنظيفها بفرك الأنسجة بلطف في منشفة ورقية. هذه الخطوة ستساعد على تحسين جدوى لمفاوية PP. (ثانيا) بدلاً من نقل المكتب إلى لوحة، نقل إلى فصل أنابيب يمكن أيضا اعتبار تبعاً لعدد العينة الكلية.
    5. اختياري: عند إتمام الختان PP وإيداعه لاحقاً في لوحة جيدا، عدد وحجم المكتب الصحفي لتجمع من مجموعات تجريبية مختلفة/الماوس يمكن توثيقها بالتقاط صورة للوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على ذكر المكتب الصحفي.
    6. إعداد مجموعة من أنابيب مخروطية 50 مل مليئة 25 مل ربمي + 10% FBS (استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية). باستخدام مقص، قطع حافة تلميح ميليلتر 1,000 من المسافة التي سوف تسمح لتطلع الصحفي مع ماصة 1 مل. نضح الصحفي مع ماصة 1 مل ونقلها من لوحة 12-جيدا زراعة الأنسجة بالأنابيب المخروطية استعداد 50 مل.
      ملاحظة: استخدام تلميح جديد لكل عينة الماوس لتجنب التلوث المتبادل بين العينات.
    7. تأمين الغطاء ووضع الأنابيب عمودياً في شاكر مداري في 37 درجة مئوية، مع التحريك المستمر في 125 – 150 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. ومن ناحية أخرى، إعداد مجموعة جديدة من أنابيب 50 مل ووضع مصفاة خلية 40 ميكرومتر على رأس كل أنبوبة، سيتم من خلالها إعداد تعليق خلية مفردة.
      ملاحظة: الخطوة الانفعالات (ط) سوف إزالة الأنقاض المحتوى والمخاط والخلايا المعوية المتبقية، التي تقلل من بقاء الخلية والانتعاش لمفاوية PP إذا لم إزالتها. (ثانيا) لا تنطبق أي نوع من إنزيمات الجهاز الهضمي في الأنسجة PP لعملية الهضم يسبب خسارة هائلة في التعبير CXCR5 من سطح الخلية.
    8. بعد الانفعالات، نقل ذكر المكتب الصحفي مصفاة خلية 40 ميكرومتر وضعت على رأس هذه الأنابيب المخروطية أعدت حديثا 50 مل. استخدام الجانب مقربة من المكبس حقنه 10 مل، بلطف تعطيل الصحفي من خلال مصفاة الخلية لتوليد تعليق خلية مفردة. شطف في المصفاة مع 15 – 20 مل من البرد ربمي + 10% FBS.
      ملاحظة: (ط) قبل التصفية، اهتز الأنابيب التي تحتوي على الصحفي أفقياً. هذا يهز قصيرة ستسهل نقل الصحفي إلى مصافي الخلية. (ثانيا) باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرومتر لعزل الخلايا المناعية غير اللمفاوية (مثلاً.، وحيدات، الضامة، وحدات تحكم المجال Dc) ينصح.
    9. الطرد المركزي من تعليق خلية مفردة في 350-400 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    10. وتجاهل المادة طافية بعناية ريسوسبيند الخلايا بتركيز 10 × 106 خلايا/مل. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
      ملاحظة: (ط) قبل أن عد الخلايا، خلية الإجمالي لكل مجموعة الماوس PP يمكن تكون تقريبا يقدر العدد استخدام الصيغة التالية: "0.5-1 × 106 خلايا x (عدد PPs) = مجموع الخلايا". قد يكون من الضروري تخفيف المزيد مع تريبان الأزرق لخلية العد. (ثانيا) كبديل للعد اليدوي، يمكن استخدام عدادات خلية الآلي.
    11. نقل 2-2.5 × 106 خلايا في المجلد المناسب (على سبيل المثال., 200 ميليلتر) في لوحة 96-بئر مستديرة القاع.
      ملاحظة: لعينات المراقبة السلبية ولون واحد، قد يكون 0.5-1 × 106 خلايا كافية.
    12. الطرد المركزي اللوحة في 350 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نفض الغبار اللوحة.
    13. تغسل الخلايا في 200 ميليلتر "تلطيخ المخزن المؤقت".

3-سطح جسم تلطيخ

  1. تلوين صلاحية:
    1. بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الخلايا في 100 ميكروليتر من صبغة الجدوى يمكن حلها المخفف في برنامج تلفزيوني (1:1، 000). احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد أو عند 4 درجة مئوية في الظلام.
      ملاحظة: تلطيخ (ط) داخل الخلايا للكشف عن النسخ الرئيسية عوامل مثل Foxp3 أو Bcl-6 يتطلب تثبيت الخلايا. وفي هذه الحالة، الأصباغ البقاء غير يمكن حلها (مثلاً.، 7-عاد DAPI) لا يمكن استخدامه. (ثانيا) لتمييع صبغ صلاحية يمكن حلها، لا تستخدم أي المصبوغة من المخزن المؤقت الذي يحتوي على البروتين. الوسائط المستخدمة في هذه الخطوة يجب أن تكون خالية من البروتين. (ثالثا) استبعاد الخلايا الميتة باستخدام تلطيخ البقاء حاسم للخلايا الميتة يمكن أن يسبب صعوبات تقنية خطيرة في التحليل الخلوي التدفق التي تنبعث منها أوتوفلوريسسينسي، وربط الأجسام المضادة السطحية نونسبيسيفيكالي، الذي قد يؤدي إلى خطأ نتائج إيجابية.
    2. تغسل الخلايا مرتين مع تلطيخ المخزن المؤقت. أجهزة الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نفض الغبار اللوحة.
  2. كتلة fc والسطحية-الطبقة الأولى:
    1. إعداد الحل Fc-كتلة بتمييع الأجسام المضادة-CD16/32 (1: 200) في تلطيخ المخزن المؤقت.
    2. ريسوسبيند الخلايا في 20 ميكروليتر من استعداد نادي كتلة الحل. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد.
    3. دون الغسيل، إضافة 80 ميكروليتر من سطح جسم كوكتيل (انظر الجدول 1 لجسم موجزة) أعد في تخفيف مناسبة. تبني على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    4. تغسل مرتين عن طريق إضافة المخزن المؤقت المصبوغة المفرط. أجهزة الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نفض الغبار اللوحة.
  3. السطح-الطبقة الثانية:
    1. تحضير حل Streptavidin المصبوغة بتمييع مترافق fluorochrome Streptavidin في المخزن المؤقت المصبوغة.
    2. بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الخلايا تلطيخ الحل مع 100 ميكروليتر من ستريبتافيدين قبل المخفف (1: 100). احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل في الجليد في الظلام.
    3. تغسل مرتين تلطيخ المخزن المؤقت. أجهزة الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نفض الغبار اللوحة.
      اختياري: إذا تلطيخ داخل الخلايا للكشف عن خلية T التنظيمية الحبيبي هو غير مرغوب فيه، بعد الغسيل الأخير، ريسوسبيند الخلايا في 200 ميكروليتر من تلطيخ المخزن المؤقت ونقل إلى أنابيب مناسبة للحصول على البيانات في تدفق سيتوميتير. عند العينات ليست ثابتة، ينبغي إجراء الحصول على البيانات بالتدفق الخلوي داخل ح 3 – 4 للحصول على نتائج دقيقة.

4. تثبيت الخلية

  1. إعداد التثبيت/بيرميبيليزيشن (إصلاح/بيرم) العامل الحل باستخدام الكواشف من Foxp3/النسخ "عامل تلطيخ المخزن المؤقت تعيين". خلط جزء واحد من التثبيت/بيرميبيليزيشن التركيز مع ثلاثة أجزاء من التثبيت/permeabilization مادة إلى الحجم النهائي المطلوب.
  2. بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الخلايا في 200 ميكروليتر من الإصلاح/بيرم العامل الحل.
  3. احتضان صفيحة الجليد أو عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لا تتجاوز 20 دقيقة لهذه الخطوة. قد يقلل فترة حضانة أطول شدة استرداد الخلية.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نفض الغبار اللوحة. (اختياري) بعد هذه الخطوة، يمكن تخزين خلايا ثابتة لعدة أيام في 4 درجات مئوية في تلطيخ مخزن يحتوي على ألبومين المصل البقري (BSA) أو FBS حتى اللاحقة داخل الخلايا تلطيخ أو التدفق الخلوي اقتناء.
  5. ريسوسبيند الخلايا في 200 ميكروليتر من بيرميبيليزيشن المخزن المؤقت (x1) الطازج المخفف مسبقاً في تنقية المياه.
  6. الطرد المركزي في 350 غ س لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  7. أغسل مرة واحدة مع 200 ميكروليتر permeabilization المخزن المؤقت والطرد المركزي في 350 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت

5-داخل الخلايا تلطيخ

  1. إعداد الحل Fc-كتلة بتمييع الأجسام المضادة-CD16/32 (1: 200) في المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن.
    ملاحظة: بعد الخطوة التثبيت، الخلايا يجب الاحتفاظ في المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن حتى نهاية عملية المصبوغة داخل الخلايا.
  2. بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الخلايا في 20 ميكروليتر من حل كتلة Fc. احتضان لمدة 10 – 15 دقيقة في RT في الظلام.
  3. دون الغسيل، إضافة 80 ميكروليتر من داخل الخلية جسم كوكتيل (100 ميكروليتر الحجم النهائي) المخفف مسبقاً في المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن. احتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت
  4. إضافة 100 ميكروليتر من "المخزن المؤقت بيرم"، وأجهزة الطرد المركزي في 350 غ س لمدة 5 دقائق في الرايت
  5. أغسل مرة واحدة مع 200 ميكروليتر permeabilization المخزن المؤقت، والطرد المركزي في ز 350 x لمدة 5 دقائق في الرايت
  6. بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الخلايا في 200 ميكروليتر من تلطيخ المخزن المؤقت ونقل الخلايا في أنابيب مناسبة (الحجم النهائي ميكروليتر 400 في المخزن المؤقت المصبوغة) والحصول على البيانات بالتدفق الخلوي. كما يمكن تشغيل عينات الملون في لوحة 96-جيدا دون نقل إلى أنابيب إذا كان متوفراً cytometer تدفق مع خيار قارئ لوحة. هذه الخطوة يقلل من فقدان الخلية أثناء نقل الخلية.
  7. الحصول على حد أدنى من 5 × 105 مجموع الخلايا في سيتوميتير تدفق ليتمكن من القيام بتحليل استنساخه من طفح، معدل الخصوبة الإجمالي، فضلا عن خلايا ب GC.

النتائج

على النقيض من بروتوكول سابق20، لاحظنا أن الصحفي ليست موزعة بالتساوي سي ولكن المترجمة أكثر كثافة نحو الغايات البعيدة والقريبة من الدولية الاشتراكية كما هو موضح في الشكل 1A. وأظهر تحليل تدفق سيتوميتريك، إذا اتبعت بشكل صحيح، ل...

Discussion

هنا، يمكننا وصف بروتوكول الأمثل لتدفق سيتوميتريك توصيف الخلايا طفح وب GC. واحدة من المزايا الرئيسية لأن البروتوكول أنه يمكن عزل يصل إلى 107 (متوسط 4 – 5 × 106 خلايا) مجموع الخلايا PP من ماوس واحدة (سلالة C57BL/6) دون أي عملية الهضم. لاحظنا أن الخلية إجمالي العائد كان ارتباطاً إيجابيا مع عد...

Disclosures

وأعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نود أن نشكر لورا شتراوس وبيتر حكيم لإجراء مناقشات مفيدة ودعم مع التدفق الخلوي التحليلات.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-mouse CD4 antibodyeBioscience, Biolegend*17-0041-81 ,10054*For detailed information see Table 1
anti-mouse CD19 antibodyeBioscienceMA5-16536For detailed information see Table 1
anti-mouse PD-1 antibodyeBioscience61-9985-82For detailed information see Table 1
anti-mouse ICOS antibodyeBioscience12-9942-82For detailed information see Table 1
anti-mouse GL7 antibodyBiolegend144610For detailed information see Table 1
anti-mouse CXCR5 antibodyBiolegend*, BD Bioscience145512*, 551960For detailed information see Table 1
anti-mouse BCL-6 antibodyBiolegend358512For detailed information see Table 1
anti-mouse Foxp3 antibodyeBioscience17-5773-82For detailed information see Table 1
Streptavidin-BV421BD Bioscience563259For detailed information see Table 1
FixableViability DyeeBioscienceL34957For detailed information see Table 1
7AADBiolegend420404For detailed information see Table 1
FcBlock (CD16/32)BD Bioscience553141For detailed information see Table 1
Collagenase IIWorthingtonLS004176
Collagenase IVWorthingtonLS004188
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SeteBioscience00-5523-00
6-well,12-well & 96-well platesFalcon/Corning353046,353043/3596
50 ml conical tubesFalcon3520
40 µm cell strainerFalcon352340
10 ml syringe-plungerExel INT26265
RPMICorning15-040-CV
PBSCorning21-040-CM
FBSAtlanta BiologicalsS11150
Orbital shakerVWRModel 200
Curved-end scissor
Fine Serrated Forceps
Small curved scissor

References

  1. van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
  2. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  3. Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
  4. Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
  5. Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
  6. Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
  7. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
  8. Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
  9. Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
  10. Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
  11. Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
  12. Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
  13. Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
  14. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
  15. Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
  16. Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
  17. Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
  18. Espéli, M., Walker, J. M. . T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
  19. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
  20. De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
  21. Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
  22. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
  23. Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  24. Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
  25. Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
  26. Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
  27. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
  28. Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
  29. Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
  30. Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
  31. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  32. Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
  33. Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
  34. Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
  35. Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
  36. Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

141

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved