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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In dieser Studie präsentieren wir eine neue und effektive Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus Peyer Patches (PPs), die anschließend für in Vivo und in Vitro funktionelle Assays sowie Flow durchflusszytometrischen Studien des follikulären T verwendet werden können Helfer und germinal Center B-Zellen.

Zusammenfassung

In der Darm-Schleimhaut bilden Immunzellen eine einzigartige immunologische Einheit, die Immuntoleranz fördert, während die Übertragung gleichzeitig Immunabwehr gegen Krankheitserreger. Es ist allgemein bekannt, dass Peyer Patches (PPs) eine wesentliche Rolle in der Schleimhaut immun-Netzwerk haben, durch die Veranstaltung von mehreren Effektor T und B-Zell-Subsets. Ein bestimmten Anteil dieser Effektorzellen, follikuläre T Helfer (TFH) und germinal Center (GC) B-Zellen sind in der Verordnung der humoralen Immunität professionalisiert. Daher bieten die Charakterisierung dieser Zelle Teilmengen innerhalb von PPs in Bezug auf ihre Differenzierung-Programm und funktionellen Eigenschaften wichtige Informationen über die Schleimhaut Immunität. Zu diesem Zweck wäre eine leicht anwendbare, effiziente und reproduzierbare Methode der Lymphozyten isoliert von PPs wertvoll für Forscher. In dieser Studie hatten wir vor, eine wirksame Methode zur Isolierung von Lymphozyten aus Maus PPs mit hohe Zellausbeute zu generieren. Unser Ansatz offenbart, dass anfängliche Gewebe wie die Verwendung von Verdauungs Reagenzien und Gewebe Agitation, Verarbeitung sowie Zelle Färbung Bedingungen und Auswahl von Antikörper-Panels, haben großen Einfluss auf die Qualität und Identität der isolierten Lymphozyten und auf experimentelle Ergebnisse.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, Forscher, um effizient Lymphozyten-Populationen von PPs ermöglicht reproduzierbare Flow Cytometry Beurteilung der T- und B-Zelle Teilmengen Schwerpunkt auf TFH und GC B Zelle Teilmengen zu isolieren.

Einleitung

Der gesamte Magen-Darmtrakt von Anfang bis zum Ende ist mit einem umfangreichen lymphatischen Netz geschmückt, die Immunzellen mehr als jedes andere Organ in der Human- und Maus1enthält. Peyer ist Patches (PPs) bilden einen wesentlichen Bestandteil der intestinalen Zweig dieser zellulären immun-Organisation, so genannten Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe (GALT)2,3. In PPs, Tausende von Millionen von Antigenen abgeleitet aus diätetischen Materialien Kommensale Mikrobiota und Krankheitserreger sind ständig abgetastet wird und wenn notwendig entsprechende Immunantworten gegen sie sind montiert so Pflege Darm immun Homöostase. In diesem Sinne könnte PPs als "Mandeln des Dünndarms" benannt werden. KKS bestehen aus großen Sub Fächer: subepithelialen Kuppel (SED), große B-Zell-Follikel-Zonen; die darüber liegende Follikel-assoziierten Epithel (FAE) und interfollikulären Region (IFR), wo T-Zellen befindet sich4sind. Dieses einzigartige Abschottung der PPs ermöglicht verschiedenen Effektor Zelle Teilmengen zu kooperieren und verleiht somit Immunkompetenz im Darm.

PPs fehlt afferenten Lymphgefäße, und aus diesem Grund werden Antigene zu PPs aus Dünndarm transportiert nicht durch Lymphgefäße im Gegensatz zu die meisten von den anderen lymphatischen Organen durchgeführt. Stattdessen sind spezialisierte Epithelzellen befindet sich in FAE, so genannte M-Zellen, verantwortlich für die Übertragung der luminalen Antigene in der PPs-5. Anschließend werden die transportierten Antigene von dendritischen Zellen (DCs) abgeholt und Fresszellen, die im Großraum subepithelialen Kuppel (SED) unter die FAE6,7befinden. Dieses Antigen Sortierverfahren von DCs in der PP ist entscheidend für die adaptive Immunantwort8 und nachfolgende Generation von IgA insulinproduzierenden Zellen9zu initiieren.

Aufgrund der schweren Antigenen Belastung von Kommensalen Flora und diätetische Material aktiviert PPs Host endogen Effektor T und B Zelle Teilmengen in großen Häufigkeiten wie TFH und IgA+ GC B Zellen10, was darauf hindeutet, dass PPs eine Website des aktiven Immunsystems darstellen Antwort11. Erkennung von bis zu 20 – 25 % TFH Zellen im gesamten CD4+ T Handy-Fach und bis zu 10 – 15 % GC B innerhalb der gesamten B-Zellen Zellen ist möglich in KKS geimpfte junge C57BL/6 Mäusen12abgeholt. Im Gegensatz zu anderen T-Helfer-Zelltypen (i.e., Th1, Th2, Th17-Zellen), TFH Zellen zeigen einzigartige Tropismus in B-Zell-Follikel vor allem wegen CXCR5 Ausdruck, der TFH Zelle Homing entlang CXCL13 gradient13fördert. In den B-Zell-Follikel Zonen der PPs induzieren TFH Zellen IgA Class Switch Rekombination und somatische Hypermutation in aktivierten B-Zellen hohe Affinität IgA produzieren Zellen14 unterscheiden. Anschließend diese Antikörper-sezernierenden Plasmazellen migrieren in der Lamina Propria (LP) und immun Homöostase in den Darm10zu regulieren.

Identifizierung und Charakterisierung der TFH und GC B-Zell-Populationen in PPs könnten Forscher zu untersuchen, die Dynamik der humoralen Immunantwort unter Steady-State-Bedingungen ohne zeitraubende Immunisierung Modelle ermöglichen. traditionell verwendet im TFH-GC B Zelle Studien15,16,17,18. Analyse der TFH Zellen innerhalb von PPs ist nicht so einfach wie andere Zelle Teilmengen. Technische Herausforderungen sind ideale Vorbereitung Gewebeverhältnisse, Oberfläche Antikörper-Marker Kombination Identifizierung sowie die Auswahl geeigneter positiver und negativer Kontrollen. TFH und PP Forschungsfelder weisen große Variabilität in Bezug auf die experimentelle Verfahren und sind bei weitem nicht die Übertragung eines Konsens um standardisierte Protokolle aus mehreren Gründen zu etablieren. Erstens neigt jede Zelle Teilmenge innerhalb PPs differentiell Gewebeverhältnisse Vorbereitung erfordern weitere Änderungen in einer Zelle Teilmenge-spezifische Art und Weise betroffen zu sein. Zweitens gibt es eine deutliche Diskrepanz zwischen den gemeldeten Methoden über die Details der Zelle Vorbereitung von Dritten PPS, die Anzahl der Protokoll-basierte vergleichende Studien untersuchen ideale Gewebe Präparationstechniken und experimentellen Bedingungen für PP und TFH ist Forschung eher begrenzt.

Aktuelle Protokollbasierte Studien vorgeschlagen für PP Zelle Vorbereitung19,20,21,22 waren nicht TFH oder GC B-Zell-orientierte. Darüber hinaus einige Gewebe Herstellungsbedingungen für PPs19,20 wie Kollagenase-basierte Verdauung empfohlen wurden gefunden, um negativ auf das Ergebnis der TFH Identifikation durch Durchflusszytometrie18. Auf dieser Grundlage begründete wir, dass eine optimierte, standardisierte und reproduzierbare Protokoll, das zur TFH und GC B Zelldynamik in PPs Untersuchung wäre wertvoll für die Ermittler arbeiten zu diesem Thema. Diese Notwendigkeit gab uns den Anstoß, erzeugen eine verbesserte und aktuelle Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von PP-Lymphozyten, die fein für zelluläre Recovery, Rentabilität und Effizienz für Durchfluss durchflusszytometrischen Charakterisierung der mehrere T- und B optimiert ist Zelle Teilmengen. Wir wollten auch auszuschließende mehrere aufwändige Vorbereitungsschritte vorgeschlagen in früheren Protokollen, damit Verringerung der erforderlichen Manipulationen und Zeit für Gewebe- und Vorbereitung von PPs.

Protokoll

Alle Studien und Experimente, die in diesem Protokoll beschrieben wurden unter Leitlinien nach institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) des Beth Israel Deaconess Medical Center durchgeführt.

1. Gestaltung Versuchsaufbau und Maus-Gruppen

  1. (Optional) Co Haus die experimentellen Mäuse, horizontale Übertragung von Darm Microbiota zwischen experimentellen Mäuse zu erleichtern und um unspezifische Variabilität innerhalb der PP-Lymphozyten zu reduzieren. Darüber hinaus verwenden Sie stellt Steuerelemente des gleichen Geschlechts Variabilität zu minimieren.

2. chirurgische Exzision und Gewebe Vorbereitungsschritte:

  1. Chirurgische Entfernung des Dünndarms (SI)
    1. Einschläfern Sie Mäuse mit CO2 Erstickung oder eine gleichwertige Methode im institutionellen Tierethik Ausschuss angenommene.
    2. Übertragen Sie die Maus, um einen eigenen Bereich für die chirurgische Exzision. Rückseite nach unten legen und den Bauch mit 70 % Ethanol desinfiziert. Führen Sie eine Laparotomie durch Schneiden der Bauchhaut und Bauchfell entlang der Mittellinie vom Schambein, den Brustkorb damit zur Eröffnung der Bauchhöhle.
      Hinweis: Führen Sie den ersten Schnitt auf einer relativ kleinen Fläche der Haut eindringen der Bauchhöhle und Darmgewebe zu beschädigen zu vermeiden. Die Exzision bis zum gewünschten anatomischen Grenze weiter.
    3. Identifizieren Sie den Blinddarm, der eine ideale Landmarke für die Erkennung von terminal Ileum ist das distale Segment des Dünndarms darstellt.
      Hinweis: Blinddarm befindet sich in der Regel auf der unteren linken Seite des Bauches Maus.
    4. Punktgenaue Ileocaecal Kreuzung und machen Sie einen Schnitt auf dieser Ebene als distal wie möglich, den Dünndarm von den Blinddarm zu trennen. Vermeiden Sie in den nächsten Schritten übermäßige körperliche Kontakt mit der Darmwand weil zerbrechlich PPs leicht auf Touch zusammenbrechen.
    5. Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Dünndarm bis zu den Pylorussphinkter durch das Mesenterium mit einer Schere schneiden. Erkennen der Kreuzung Pylorus und Duodenum und schnipp den Zwölffingerdarm auf dieser Ebene führt zur Ablösung der Dünndarm aus der Bauchhöhle zu vervollständigen.
      Hinweis: (i) vermeiden Sie Hyperextension da dies den Bruch der Darmwandführen könnte. (Ii) LP-Lymphozyten isoliert neben PP Lymphozyten gewünscht, vollständige Entfernung der mesenterialen Fett ist notwendig. Jedoch zur PP Isolierung nur könnte verbleibenden mesenterialen Fett einige Vorteile während der weiteren Schritte der Isolierung bieten; Daher sollten sie beibehalten werden.
    6. Freistehende Dünndarm in eine 6-Well-Platte mit kalten RPMI + 10 % fetalen bovine Serum (FBS) gefüllt und schütteln Sie sanft die Geweben manuell bis Darm segmentübergreifend in den kalten Medien getaucht sind. Pflegen Sie das Gewebe auf dem Eis in den nächsten Schritten.
    7. Nach dem Zerlegen der gewünschten Anzahl von Maus-Dünndarm, fahren Sie mit PP Exzision von gesammelten Dünndarm.
  2. Die chirurgische Exzision der PPs und Vorbereitung der einzelnen Zellsuspension:
    1. Sanft den Dünndarm auf ein Papiertuch von der mesenterialen Fett mit Pinzette greifen und mesenterialen zugewandte Papiertuch. Befeuchten Sie das gesamte Darm-Segment mit kalten RPMI + 10 % FBS Gewebe Dehydrierung und Klebrigkeit zu vermeiden.
      Hinweis: Verbleibende mesenterialen Fett kann in dieser Phase hilfreich sein, weil Fettgewebe Segmente auf mesenterialen Ortsbild des SI das Papiertuch halten die Anti-mesenterialen Seite nach oben festhalten werden.
    2. Identifizieren Sie die PPs, die als weiße Multi-lappenden Aggregate in eine "Blumenkohl" Form auf der Anti-mesenterialen Seite der Darmwand erscheinen.
      Hinweis: Flushing, der luminalen Inhalt wird nicht empfohlen, bis alle PPs herausgeschnitten werden. Entleerung des luminalen Inhalts könnte dazu führen, dass den Zusammenbruch der PPs und verhindert, dass der Farbkontrast zwischen PPs und die Darmwand, die was sehr hilfreich zur visuellen Identifikation von PPs ist.
    3. Nach der Identifizierung PPs auf der Anti-mesenterialen Seite, legen Sie die chirurgische Schere gebogene Ende auf PPs (Kurve sollte aufgedeckt) Ruhigstellung der PP von der proximalen und distalen Grenze.
      Optional: Drücken Sie die PP sanft gegen die Klingen der Schere mit einer Fingerspitze. Dieses Manöver wird besser unter Ausschluss des umgebenden Gewebes nicht PP führen. Verbrauchsteuern die PPs sanft, mit Ausnahme der umliegenden Darmgewebe.
      Hinweis: (i) dieser Schritt ist entscheidend, um maximale PP Zellausbeute bei gleichzeitiger Minimierung der Zelle Verunreinigungen aus dem benachbarten Darm Fächer wie LP und Darmepithel, sind auch reich an T-Zellen zu erhalten. (Ii) können ein SI von C57BL/6 Maus herausgeschnitten 5-10 PPs (Durchschnittsgröße, Multi-gelappt) abgeholt werden. Mit dem Ziel, noch kleinere PPs (Multi-gelappt), Sammlung von bis zu 12-13 PPs per Mausklick (C57BL/6) kann mithilfe dieses Protokolls.
    4. Übertragung der ausgeschnittenen PPs auf ein 12-Well-Zellkultur-Platte gefüllt mit eiskalten RPMI + 10 % FBS und gepflegt auf Eis mit Zange oder gebogene Chirurgische Scheren.
      Hinweis: (i) unmittelbar nach Exzision von PPs können Schleim und Darminhalt auf der PP-Oberfläche gereinigt werden durch Reiben das Gewebe sanft auf einem Papiertuch. Dieser Schritt hilft, die Lebensfähigkeit des PP-Lymphozyten zu verbessern. (Ii) anstelle der PPs auf einer Platte zu übertragen, kann die Röhren getrennt übertragen auch abhängig von Anzahl der Gesamtstichprobe betrachtet werden.
    5. Optional: Wenn PP Exzision und anschließende Platzierung in der well-Platte abgeschlossen sind, können die Anzahl und Größe der PPs aus verschiedenen experimentellen/Maus Gruppen gesammelt dokumentiert werden durch eine Aufnahme der Gewebekultur Platte mit PPs.
    6. Bereiten Sie einen Satz von 50 mL konische Röhrchen gefüllt mit 25 mL RPMI + 10 % FBS (bei 37 ° C vorgewärmt). Mit einer Schere, schneiden Sie den Rand von einem 1.000 µL-Tipp aus der Distanz, die das Streben der PPs mit 1 mL Pipette ermöglichen. Die PPs mit 1 mL Pipette abzusaugen und auf die vorbereiteten 50 mL konische Röhrchen aus der Gewebekultur 12-Well-Platte übertragen.
      Hinweis: Verwenden Sie einen neuen Tipp für jede Maus-Probe, um Cross-Kontamination zwischen den Proben zu vermeiden.
    7. Sichern Sie den Deckel und stellen Sie die Rohre senkrecht in einem Orbitalschüttler bei 37 ° C, mit kontinuierlichen Agitation bei 125-150 u/min für 10 min. Unterdessen bereiten Sie einen neuen Satz von 50 mL-Tuben und platzieren Sie ein 40 µm Zelle Sieb auf der Oberseite jedes Röhrchen, durch die einzelne Zellsuspension vorbereitet werden.
      Hinweis: (i) der Erregung Schritt wird der verbleibende Darm Inhalt, Schleim und Zelle Schutt entfernen, die die Zellviabilität und Wiederherstellung der PP-Lymphozyten zu verringern, wenn nicht entfernt. (Ii) gelten Sie jeglicher Art von Verdauungs-Enzymen nicht, auf PP-Gewebe, weil die Verdauung führt zu einen dramatischen Verlust der CXCR5 Ausdruck von der Zelloberfläche.
    8. Nach der Aufregung Übertragung der PPs auf 40 µm Zelle Sieb auf die neu vorzubereitenden konisch 50 mL Röhrchen gelegt. Mit der abgerundeten Seite eine 10 mL Spritzenkolben, sanft stören die PPs durch die Zelle Sieb, einzelne Zellsuspension zu generieren. Spülen Sie das Sieb mit 15 – 20 mL kalte RPMI + 10 % FBS.
      Hinweis: (i) vor dem Filtern, schütteln Sie die Röhrchen mit dem PPs horizontal. Dieser kurze Shake erleichtert die Übertragung von PPs in Zelle Siebe. (Ii) mit einem 70 µm-Zelle-Sieb für die Isolierung von nicht-lymphatischen Immunzellen (zB., Monozyten, Makrophagen, DCs) wird empfohlen.
    9. Zentrifugieren Sie die einzelnen Zellsuspensionen 350 – 400 X g für 10 min bei 4 ° C.
    10. Sorgfältig den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in einer Konzentration von 10 x 106 Zellen/mL. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
      Hinweis: (i) vor dem Zellzählung, die Ergebniszelle Zahl für jede Maus PP-Gruppe ungefähr abgeschätzt werden anhand der folgenden Formel: "0,5-1 x 106 Zellen x (Anzahl der PPs) = total Zellzahl". Weitere Verdünnungen mit Trypan blau für Zellzählung können erforderlich sein. (Ii) als Alternative zum manuellen zählen können automatisierte Zelle Zähler verwendet werden.
    11. 2-2,5 x 106 Zellen im entsprechenden Volumen zu übertragen (z. B.., 200 µL) in eine 96-Well Rundboden-Platte.
      Hinweis: Für einfarbige und negative Kontrollproben, vielleicht 0,5-1 x 106 Zellen ausreichend sein.
    12. Zentrifugieren Sie die Platte 350 X g für 5 min bei 4 ° C. Streichen Sie die Platte.
    13. Waschen Sie die Zellen in 200 µL Puffer Färbung.

3. Oberfläche Antikörper Färbung

  1. Lebensfähigkeit Färbung:
    1. Nach der letzten Wäsche Aufschwemmen der Zellen in 100 μl fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff verdünnt mit PBS-Puffer (1:1 000). 30 min auf Eis oder bei 4 ° C im Dunkeln inkubieren.
      Hinweis: (i) intrazelluläre Färbung für den Nachweis der wichtigsten Transkription Faktoren wie Foxp3 oder Bcl-6 erfordert Fixierung der Zellen. In diesem Fall nicht fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoffe (zB., 7-AAD, DAPI) kann nicht verwendet werden. (Ii) um fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff zu verdünnen, verwenden Sie keine befleckenden Puffer, Protein enthält. In diesem Schritt verwendeten Medien müssen Protein-frei sein. (Iii) der Ausschluss von abgestorbenen Zellen mithilfe von Lebensfähigkeit Färbung ist entscheidend, denn abgestorbene Zellen erhebliche technische Schwierigkeiten in Flow-Zytometrie-Analyse durch das aussenden Autofluoreszenz und nonspecifically, Oberfläche Antikörper binden verursachen können, die auf False führen könnte positive Ergebnisse.
    2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit Puffer beflecken. Zentrifuge bei 350 X g für 5 min bei 4 ° C. Streichen Sie die Platte.
  2. FC-Block und Oberfläche - Schicht I:
    1. Bereiten Sie die Fc-Block-Lösung durch Verdünnung von Anti-CD16/32 Antikörper (1: 200) in der Färbung Puffer.
    2. Aufschwemmen der Zellen in 20 μL bereit Fc-Block-Lösung. Inkubieren Sie für 15 min auf Eis.
    3. Ohne waschen, fügen Sie 80 μL der Oberfläche Antikörper cocktail (siehe Tabelle 1 für den Antikörper Zusammenfassung) bei entsprechenden Verdünnungen vorbereitet hinzu. Inkubieren Sie für mindestens 30 min auf Eis.
    4. Waschen Sie zweimal durch Zugabe von übermäßigen Färbung Puffer. Zentrifuge bei 350 X g für 5 min bei 4 ° C. Streichen Sie die Platte.
  3. Oberfläche - Schicht II:
    1. Bereiten Sie Streptavidin Färbelösung durch Verdünnung Fluorochrom konjugiert Streptavidin in Färbung Puffer vor.
    2. Aufschwemmen Sie nach der letzten Wäsche Färbelösung Zellen mit 100 μL vorverdünnt Streptavidin (1: 100). Mindestens 15 min auf Eis im Dunkeln inkubieren.
    3. Zweimal mit Färbung Puffer waschen. Zentrifuge bei 350 X g für 5 min bei 4° C. Streichen Sie die Platte.
      Optional: Wenn intrazelluläre Färbung für follikulären regulatorische T-Zell-Erkennung nicht, nach der letzten Wäsche gewünscht ist Aufschwemmen der Zellen in 200 μL der Färbung, Puffer und Transfer in die entsprechenden Rohre, Daten im Durchflusszytometer zu erwerben. Wenn die Proben nicht fixiert sind, sollte die Erfassung von Daten durch Durchflusszytometrie innerhalb von 3 – 4 h, um genaue Ergebnisse zu erhalten durchgeführt werden.

(4) Zelle Fixierung

  1. Bereiten Sie Fixierung/Permeabilisierung (Fix/Perm) funktionierende Lösung mit Reagenzien aus Foxp3/Transkription Faktor Färbung Puffer Set vor. Mischen Sie einteilige Fixierung/Permeabilisierung Konzentrat mit drei Teile der Befestigung/Permeabilisierung Verdünnungsmittel, das gewünschte Endvolumen.
  2. Nach der letzten Wäsche Aufschwemmen der Zellen in 200 μl Arbeitslösung Fix/Perm.
  3. Inkubieren Sie die Platte auf dem Eis oder bei 4 ° C für 20 min. Überschreiten Sie 20 min für diesen Schritt nicht. Längere Inkubationszeit kann die Zelle Erholung stark verringern.
  4. Zentrifuge bei 350 X g für 5 min bei 4 ° C. Streichen Sie die Platte. (Optional) Nach diesem Schritt können feste Zellen gespeichert werden, für mehrere Tage bei 4 ° C im Puffer mit Rinderserumalbumin (BSA) Färbung oder FBS bis nachfolgende intrazelluläre Färbung oder Flow Cytometry Erwerb.
  5. Aufzuwirbeln Sie die Zellen in 200 μl Puffer (x1) frisch vorab gereinigte deionisiertes Wasser verdünnt Permeabilisierung.
  6. Zentrifugieren Sie bei 350 X g für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
  7. Einmal waschen Sie mit 200 μL Permeabilisierung Puffer und Zentrifuge bei 350 X g für 5 min bei RT

(5) intrazelluläre Färbung

  1. Bereiten Sie die Fc-Block-Lösung durch Verdünnung von Anti-CD16/32 Antikörper (1: 200) in Permeabilisierung Puffer.
    Hinweis: Nach der Fixierung Schritt, die Zellen im Permeabilisierung Puffer bis zum Ende des intrazellulären Färbung Prozesses einzuhalten.
  2. Nach der letzten Wäsche Aufschwemmen der Zellen in 20 μL der Fc-Block-Lösung. 10-15 min bei RT im Dunkeln inkubieren.
  3. Ohne waschen, fügen Sie 80 μL der intrazellulären Antikörper cocktail (100 μL Endvolumen) vorab in Permeabilisierung Puffer verdünnt hinzu. 30 min bei RT inkubieren
  4. Hinzufügen von 100 μL des Perm Puffer und Zentrifuge bei 350 X g für 5 min bei RT
  5. Einmal waschen mit 200 μL der Permeabilisierung Puffer, Zentrifugieren bei 350 X g für 5 min bei RT
  6. Nach dem letzten Waschen Aufschwemmen der Zellen in 200 μL der Färbung Puffer und die Zellen in entsprechende Röhrchen (Endvolumen von 400 μl in Färbung Puffer) zu übertragen und Daten durch Durchflusszytometrie erwerben. Beispiele gebeizt in 96-Well-Platte können auch ausgeführt werden, ohne Sie in Tuben zu übertragen, wenn ein Durchflusszytometer mit Platte Reader-Option zur Verfügung steht. Dieser Schritt minimiert Zellverlust während Zelle übertragen.
  7. Erwerben ein Minimum von 5 x 105 total Zellen im Durchflusszytometer, reproduzierbare Analyse der TFH, TFR durchführen zu können sowie GC B Zellen.

Ergebnisse

Im Gegensatz zu einer vorherigen Protokoll20, haben wir beobachtet, dass PPs nicht gleichmäßig die SI verteilt sind aber mehr dicht zu den proximalen und distalen Enden des SI lokalisiert sind, wie in Abbildung 1A. Durchflusszytometrischen Analyse zeigte, dass, wenn korrekt befolgt, unser Protokoll ein PP-Lymphozytenpopulation gibt, die ähnlich wie Splenocyten (Abbildung 2A

Diskussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll für Durchfluss durchflusszytometrischen Charakterisierung von TFH und GC B Zellen optimiert. Einer der großen Vorteile unseres Protokolls ist, dass es die Isolation von bis zu 107 (durchschnittlich 4 – 5 x 106 Zellen) total PP Zellen aus einem einzigen Mausklick (C57BL/6-Stamm) ohne jede Verdauung ermöglicht. Wir beobachteten, dass die Ergebniszelle Ausbeute positiv mit der Anzahl der PPs korreliert war und aus die folgende einfache Gleichung, die hilfreich f?...

Offenlegungen

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Danksagungen

Wir möchten danken Laura Strauss und Peter Salbei für hilfreiche Diskussionen und mit Flow Cytometry Analysen zu unterstützen.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-mouse CD4 antibodyeBioscience, Biolegend*17-0041-81 ,10054*For detailed information see Table 1
anti-mouse CD19 antibodyeBioscienceMA5-16536For detailed information see Table 1
anti-mouse PD-1 antibodyeBioscience61-9985-82For detailed information see Table 1
anti-mouse ICOS antibodyeBioscience12-9942-82For detailed information see Table 1
anti-mouse GL7 antibodyBiolegend144610For detailed information see Table 1
anti-mouse CXCR5 antibodyBiolegend*, BD Bioscience145512*, 551960For detailed information see Table 1
anti-mouse BCL-6 antibodyBiolegend358512For detailed information see Table 1
anti-mouse Foxp3 antibodyeBioscience17-5773-82For detailed information see Table 1
Streptavidin-BV421BD Bioscience563259For detailed information see Table 1
FixableViability DyeeBioscienceL34957For detailed information see Table 1
7AADBiolegend420404For detailed information see Table 1
FcBlock (CD16/32)BD Bioscience553141For detailed information see Table 1
Collagenase IIWorthingtonLS004176
Collagenase IVWorthingtonLS004188
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SeteBioscience00-5523-00
6-well,12-well & 96-well platesFalcon/Corning353046,353043/3596
50 ml conical tubesFalcon3520
40 µm cell strainerFalcon352340
10 ml syringe-plungerExel INT26265
RPMICorning15-040-CV
PBSCorning21-040-CM
FBSAtlanta BiologicalsS11150
Orbital shakerVWRModel 200
Curved-end scissor
Fine Serrated Forceps
Small curved scissor

Referenzen

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