Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Neste estudo, apresentamos uma nova e eficaz protocolo para a isolação de linfócitos de remendos de Peyer (PPs), que podem ser usados posteriormente para ensaios funcionais in vivo e in vitro , bem como estudos de fluxo cytometric t folicular auxiliar e células B de centro germinativo.

Resumo

Na mucosa do intestino, células do sistema imunológico constituem uma entidade imunológica exclusiva, que promove a tolerância imunológica ao mesmo tempo conferindo simultaneamente a defesa imunológica contra agentes patogénicos. Está bem estabelecido que de Peyer (PPs) têm um papel essencial na rede imune mucosal hospedando vários efetores T e células B subconjuntos. Uma certa fração dessas células efetoras, folicular T helper (TFH) e as células B do centro germinativo (GC) estão profissionalizando na regulação da imunidade humoral. Daí, a caracterização destes subconjuntos de célula dentro de PPs em termos de programa de diferenciação e propriedades funcionais pode fornecer informações importantes sobre a imunidade da mucosa. Para este fim, um método facilmente aplicável, eficiente e reprodutível de isolamento de linfócitos de PPs seria valioso para os pesquisadores. Neste estudo, tivemos como objetivo gerar um método eficaz para isolar linfócitos de rato PPs com rendimento elevado célula. Nossa abordagem revelou que o tecido inicial de processamento tais como o uso de reagentes digestivos e agitação de tecido, bem como coloração condições e seleção dos painéis de anticorpo celular, têm grande influência sobre a qualidade e a identidade dos linfócitos isolados e em resultados experimentais.

Aqui, descrevemos um protocolo que permite aos investigadores eficientemente isolar populações de linfócitos de PPs permitindo avaliação baseada em citometria de fluxo pode ser reproduzido de subconjuntos T e células B, principalmente focando TFH e GC B subconjuntos de célula.

Introdução

O trato gastrointestinal inteiro desde o início até o fim é adornado com uma extensa rede linfoide que contém células do sistema imunológico, mais do que qualquer outro órgão em humanos e rato1. Peyer do patches (PPs), constituem um componente importante do ramo intestinal desta organização imune celular, tecido linfoide associado intestino so-called (GALT)2,3. Dentro de PPs, milhares de milhões de antígenos derivados de matérias alimentares, microbiota comensal e patógenos estão sendo amostrados continuamente, e quando necessárias respostas adequadas do imunológico em direção a eles são montado assim manter imune intestinal homeostase. Nesse sentido, o PPs poderiam ser nomeados como "as amígdalas do intestino". PPC consiste em grandes compartimentos sub: cúpula subepithelial (SED), grandes zonas de folículo de células B; o epitélio sobrejacente do folículo-associado (FAE) e região interfollicular (IFR) onde as células T estão localizados4. Este exclusiva compartimentalização de PPs permite subconjuntos de células efetoras diferentes para cooperar, assim, confere a imunocompetência no intestino.

PPs não têm vasos linfáticos aferentes, e devido a este motivo, antígenos transportados para PPs do intestino não estão sendo conduzidos através de vasos linfáticos, em contraste com a maioria dos outros órgãos linfoides. Em vez disso, as células epiteliais especializadas localizadas na FAE, chamadas células M, são responsáveis para a transferência dos antígenos luminal para o PPs5. Posteriormente, os antígenos transportados são captados pelas células dendríticas (DCs) e os fagócitos que estão localizados na região abaixo da FAE6,7subepithelial cúpula (SED). Este processo de classificação de antígeno por DCs em PP é crucial para iniciar a resposta imune adaptativa8 e posterior geração de IgA secretando células9.

Devido o pesado fardo antigênico da flora comensal e material dietético, anfitrião do PPs endogenamente ativado effector T e células B subconjuntos em grande abundância como TFH e IgA+ GC B células10, sugerindo que o PPs representam um site de imune ativo resposta11. Detecção de até 20 – 25% células TFH dentro CD4 total+ T do compartimento de pilha e até 10-15% GC B células dentro das células B totais é possível em PPs colhidos C57BL/6 ratos jovens vivem12. Em contraste com outros tipos de células do ajudante de T (i. e., Th1, Th2, células Th17), células TFH mostram tropismo único em células B folículos principalmente devido à expressão de CXCR5, que promove a orientação de TFH célula ao longo de gradientes CXCL1313. Nas zonas de folículo de células B de PPs, células TFH induzem recombinação de interruptor de classe IgA e somática em células B ativadas, do qual as células produtoras de IgA de alta afinidade diferenciam14. Posteriormente, essas células plasmáticas desegregação migrar para a lâmina própria (LP) e regulam a homeostase imune do intestino,10.

Identificação e caracterização de populações de células TFH e GC B dentro PPs podem permitir aos investigadores investigar a dinâmica da humorais respostas imunes sob condições de estado estacionário, sem a necessidade de modelos de imunização demorada tradicionalmente usado em TFH-GC B célula estudos15,16,17,18. Analisar as células TFH dentro PPs não é tão simples como outros subconjuntos de célula. Desafios técnicos incluem identificar as condições de preparação do tecido ideal, combinação do anticorpo de superfície-marcador, bem como selecionando apropriados controles positivos e negativos. Campos de pesquisa tanto TFH e PP apresentam grande variabilidade em termos de procedimentos experimentais e estão longe de conferir um consenso para estabelecer protocolos padronizados devido a várias razões. Em primeiro lugar, cada subconjunto de célula dentro PPs tende a ser diferencialmente afetaram as condições de preparação de tecido que requer ainda mais modificações na forma de subconjunto específico de célula. Em segundo lugar, há uma discrepância significativa entre os métodos relatados sobre os detalhes da preparação da pilha de PPS. terceiro, o número de estudos comparativos com base em protocolo investigar técnicas de preparação do tecido ideal e condições experimentais para PP e TFH investigação é bastante limitada.

Estudos atuais baseados em protocolo sugeridos para PP célula preparação19,20,21,22 não eram TFH - ou GC orientada em células B. Além disso, algumas condições de preparação do tecido recomendadas para PPs19,20 , tais como digestão baseada em colagenase foram encontradas para afetar negativamente o resultado da identificação de TFH por citometria de fluxo18. Nesta base, nós raciocinou que um protocolo otimizado, padronizado e reproduzível que pode ser usado para estudar a dinâmica de células TFH e GC B no PPs seria valioso para os investigadores a trabalhar sobre este tema. Esta necessidade nos deu o impulso para gerar um protocolo melhorado e actualizado para o isolamento e caracterização de linfócitos PP finamente otimizado para recuperação celular, viabilidade e eficiência para a caracterização de fluxo cytometric de vários T e B subconjuntos de célula. Objetivamos também excluir várias etapas de preparação laboriosa sugeridas em protocolos anteriores, desse modo, reduzindo a manipulações necessárias e o tempo para a preparação de tecidos e células do PPs.

Protocolo

Todos os estudos e experimentos descritos neste protocolo foram conduzidos sob orientações de acordo com cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) do Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. concepção de montagem Experimental e grupos de Mouse

  1. (Opcional) Co da casa os ratos experimentais para facilitar a transmissão horizontal da microbiota do intestino entre ratos experimentais e reduzir variabilidade específico dentro de linfócitos PP. Além disso, use controles littermate do mesmo sexo para minimizar a variabilidade.

2. cirúrgica excisão e etapas de preparação do tecido:

  1. Remoção cirúrgica do intestino delgado (SI)
    1. Eutanásia em ratos usando CO2 asfixia ou qualquer método equivalente aprovado pelo Comitê de ética animal institucional.
    2. Transferi o mouse para uma área dedicada para excisão cirúrgica. Coloque a parte traseira para baixo e higienizar o abdômen com etanol a 70%. Realizar uma laparotomia pelo corte da pele abdominal e peritônio, ao longo da linha mediana do púbis para a caixa torácica abrindo a cavidade peritoneal.
      Nota: Execute a primeira incisão em uma área relativamente pequena da pele para evitar a penetração da cavidade peritoneal e danificar o tecido intestinal. Continue a excisão até fronteira anatômica desejada.
    3. Identifica o ceco, que é um marco ideal para a detecção de íleo terminal, que constitui o segmento distal do intestino delgado.
      Nota: Ceco geralmente está localizado no lado inferior esquerdo do abdômen do mouse.
    4. Identificar a junção ileocecal e fazer um corte nesse nível mais distal possível separar o ceco do intestino delgado. Durante os próximos passos, evite contato físico excessivo com a parede intestinal porque frágil PPs colapso facilmente ao toque.
    5. Remova cuidadosamente o intestino inteiro até o esfíncter pilórica cortando o mesentério com uma tesoura. Identificar a junção entre o piloro e o duodeno, e cortar o duodeno a este nível, o que levará para concluir o desprendimento do intestino delgado da cavidade abdominal.
      Nota: (i) Evite hiperextensão como isso pode causar a ruptura da parede intestinal. (ii) se isolamento de linfócitos de LP é desejado além de linfócitos PP, a remoção completa da gordura mesentérica é necessária. No entanto, para o isolamento de PP só, permanecendo gordura mesentérica poderia fornecer alguns benefícios durante as etapas de isolamento adicionais; Portanto, que deveria ser preservado.
    6. Intestino delgado lugar destacado em uma placa de 6 cheia de frio RPMI + 10% de soro fetal bovino (FBS) e agitar suavemente os tecidos manualmente até que todos os segmentos intestinais estão submersos na mídia fria. Manter os tecidos no gelo durante os próximos passos.
    7. Depois de dissecar o número desejado de intestino de rato, proceda à excisão de PP de intestino delgado coletado.
  2. Excisão cirúrgica de PPs e preparação da suspensão de célula única:
    1. Delicadamente transferir o intestino em uma papel toalha agarrando-se a gordura mesentérica usando fórceps e coloca a mesentérica virados para a toalha de papel. Umedeça o segmento intestinal inteiro com frio RPMI + 10% FBS para evitar a desidratação do tecido e viscosidade.
      Nota: Restante gordura mesentérica pode ser útil nesta fase porque segmentos de tecido adiposo no site mesentérico de SI vão ficar com a toalha de papel, mantendo o site antimesentérico virada para cima.
    2. Identifica o PPs, que aparecem como agregados multi lobulados brancos em forma de "couve-flor, como" antimesentérica do lado da parede intestinal.
      Nota: Flushing o conteúdo luminal não é recomendado até que todos os PPs são extirpados. Esvaziar o conteúdo luminal pode causar o colapso do PPs e impedirá o contraste de cores entre o PPs e a parede intestinal, que é muito útil para a identificação visual do PPs.
    3. Depois de identificar o PPs do lado antimesentérica, coloque a tesoura de ponta curva cirúrgica no PPs (curva deve enfrentar) o PP de restrição de sua borda distal e proximal.
      Opcional: Empurre o PP suavemente em direção as lâminas da tesoura, usando a ponta do dedo. Esta manobra vai levar a melhor exclusão dos não-PP tecido circundante. Excisar o PPs suavemente, excluindo o tecido intestinal.
      Nota: (i) este passo é fundamental para obter o máximo rendimento de célula PP, minimizando a contaminação de célula de vizinhas compartimentos intestinais tais como LP e epitélio intestinal, que também são ricos em células T. (ii) a partir de um SI extirpado do mouse C57BL/6, 5-10 PPs (tamanho médio, multi lobulado) podem ser coletados. Apontando ainda menores PPs (multi lobuladas), coleção de até 12-13 PPs por rato (C57BL/6) é possível usando este protocolo.
    4. O PPs extirpado de transferência para uma placa de cultura de tecido 12-bem preenchidos com gelada RPMI + 10% FBS e conservado em gelo, usando a pinça ou tesoura cirúrgica curva.
      Nota: (i) imediatamente após a excisão do PPs, muco e conteúdo intestinal na superfície dos PP podem ser limpos esfregando suavemente o tecido sobre uma toalha de papel. Esta etapa irá ajudar a melhorar a viabilidade de linfócitos PP. (ii) em vez de transferir o PPs para um prato, transferindo para separar os tubos também pode ser considerado dependendo do número total da amostra.
    5. Opcional: Quando a excisão de PP e posterior colocação na placa bem são concluídas, o número e o tamanho do PPs coletados de grupos experimentais/mouse diferente podem ser documentados por tirar uma foto da placa de cultura de tecidos que contenham PPs.
    6. Preparar um conjunto de tubos de 50ml cónico preenchido com 25 mL de RPMI + 10% FBS (pré aquecido a 37 ° C). Usando um par de tesouras, corte a borda de uma dica de 1.000 µ l da distância que permite a aspiração do PPs de pipeta de 1 mL. Aspirar o PPs de pipeta de 1 mL e transferi-los da placa de cultura de tecidos de 12 poços para os tubos cónicos preparado 50 mL.
      Nota: Utilize uma ponta nova para cada amostra de rato para evitar contaminação cruzada entre as amostras.
    7. Fixe a tampa e coloque os tubos na vertical em um agitador orbital a 37 ° C, com agitação contínua a 125-150 rpm durante 10 min. Enquanto isso, preparar um novo conjunto de tubos de 50 mL e coloque um coador de célula de 40 µm no topo de cada tubo, através do qual será preparada suspensão de célula única.
      Nota: (i) a etapa de agitação irá remover os restantes detritos conteúdo, muco e células intestinais, que diminuem a viabilidade celular e recuperação de linfócitos PP se não forem removidos. (ii) não se aplica qualquer tipo de enzimas digestivas no tecido PP porque o processo de digestão provoca uma perda dramática de CXCR5 expressão da superfície celular.
    8. Após a agitação, transferi o PPs para o filtro de célula de 40 µm colocado na parte superior dos tubos de 50ml cónico recém preparada. Usando o lado arredondado de um êmbolo de seringa de 10 mL, delicadamente perturbar o PPs através do filtro de célula para gerar suspensão única célula. Lave o filtro com 15-20 mL de frio RPMI + 10% FBS.
      Nota: (i) antes da filtragem, agite os tubos contendo o PPs horizontalmente. Este batido curto irá facilitar a transferência de PPs em filtros de célula. (ii) usando um coador de célula de 70 µm para o isolamento de células do sistema imunológico não-linfoides (EG., monócitos, macrófagos, DCs) é recomendado.
    9. Centrifugar as suspensões de célula única a 350 – 400 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
    10. Cuidadosamente, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em uma concentração de 10 x 106 células/mL. Conte as células usando um hemocytometer.
      Nota: (i) antes de a contagem de células, o número de células totais para cada grupo de rato PP pode ser aproximadamente calculado usando a seguinte fórmula: "0.5-1 x 106 células x (número de PPs) = contagem total de células". Mais diluições com trypan azul para a contagem de células podem ser necessárias. (ii) como uma alternativa para contagem manual, contadores de células automatizadas podem ser usados.
    11. Transferência de 2 a 2,5 x 106 células em volume adequado (ex., 200 µ l) em uma placa de 96 poços fundo redondo.
      Nota: Para uma única cor e as amostras de controlo negativo, 0,5-1 x 106 células podem ser suficientes.
    12. Centrifugue a placa a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Agite a placa.
    13. Lave as células em 200 µ l de tampão de coloração.

3. superfície anticorpos

  1. Viabilidade de coloração:
    1. Após a lavagem final, Ressuspender as células em 100 μL de viabilidade fixável corante diluído em PBS (1:1, 000). Incube durante 30 min no gelo ou a 4 ° C, no escuro.
      Nota: (i) intracelular de coloração para a detecção de transcrição chave fatores tais como Foxp3 ou Bcl-6 requer a fixação das células. Nesse caso, não-corrigível viabilidade corantes (ex., 7-AAD, DAPI) não pode ser usado. (ii) para diluir o corante de viabilidade fixável, não use qualquer coloração buffer que contém proteína. A mídia utilizada nesta etapa deve ser livre de proteína. (iii) a exclusão das células mortas, usando coloração de viabilidade é crucial, porque as células mortas podem causar sérias dificuldades técnicas em fluxo cytometry análise através da emissão de autofluorescência e por anticorpos superfície de ligação nonspecifically, que pode levar a falso resultados positivos.
    2. Lave as células duas vezes com tampão de coloração. Centrifugar a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Agite a placa.
  2. Bloco de FC e de superfície - camada i:
    1. Prepare a solução Fc-bloco diluindo o anticorpo anti-CD16/32 (1: 200) na coloração de reserva.
    2. Ressuspender as células em 20 μL de solução preparada de Fc-bloco. Incube por 15 min no gelo.
    3. Sem lavar, acrescentar 80 μL do anticorpo de superfície cocktail (ver tabela 1 para o anticorpo Resumo) preparado em diluições apropriadas. Incube no gelo pelo menos 30 min.
    4. Lave duas vezes pela adição de buffer de coloração excessiva. Centrifugar a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Agite a placa.
  3. Superfície - camada II:
    1. Prepare a solução de coloração de estreptavidina diluindo estreptavidina conjugada com fluorocromo no buffer de coloração.
    2. Após a lavagem final, Ressuspender as células com 100 μL de estreptavidina pré-diluída (1: 100) solução de coloração. Incube durante pelo menos 15 min no gelo no escuro.
    3. Lave duas vezes com tampão de coloração. Centrifugar a 350 x g por 5 min a 4° C. Agite a placa.
      Opcional: Se a coloracao intracelular para a deteção de célula folicular de T reguladoras não é desejada, após a última lavagem, Ressuspender as células em 200 μL de manchar o buffer e transferência em tubos apropriados para adquirir dados em citômetro de fluxo. Quando as amostras não são fixas, aquisição de dados por citometria de fluxo deve ser realizada em 3 – 4 h para obter resultados precisos.

4. fixação da pilha

  1. Prepare a solução de trabalho de fixação/permeabilização (correção/Perm) usando os reagentes de Foxp3/transcrição fator coloração Buffer definido. Misture uma parte de fixação/permeabilização concentrado com três partes de fixação/permeabilização diluente para o volume final desejado.
  2. Após a lavagem final, Ressuspender as células em 200 μL de solução de trabalho de correção/Perm.
  3. Incube a placa no gelo ou a 4 ° C por 20 min. Não exceda 20 min para esta etapa. Tempo de incubação severamente pode diminuir a recuperação celular.
  4. Centrifugar a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Agite a placa. (Opcional) Após esta etapa, células fixas podem ser armazenadas por vários dias a 4 ° C, de coloração, o buffer que contém albumina de soro bovino (BSA) ou FBS até aquisição de citometria intracelular subsequente da coloração ou fluxo.
  5. Ressuspender as células em 200 μL de permeabilização Buffer (x1) recém previamente diluído em água deionizada purificada.
  6. Centrifugar a 350 x g durante 5 min à temperatura ambiente (RT).
  7. Lave uma vez com 200 μL de tampão de permeabilização e centrifugar 350 x g por 5 min à RT

5. intracelular de coloração

  1. Prepare a solução de Fc-bloco diluindo o anticorpo anti-CD16/32 (1: 200) em tampão de permeabilização.
    Nota: Após a etapa de fixação, as células devem ser mantidas em buffer de permeabilização até ao final do processo de coloração intracelular.
  2. Após a lavagem final, Ressuspender as células em 20 μL de solução de Fc-bloco. Incube durante 10 a 15 min a RT no escuro.
  3. Sem lavar, acrescentar 80 μL de intracelular anticorpo cocktail (volume final de 100 μL) previamente diluído em tampão de permeabilização. Incubar durante 30 min à RT.
  4. Adicionar 100 μL de Buffer de Perm e centrifugar a 350 x g durante 5 min à RT
  5. Lave uma vez com 200 μL de tampão de permeabilização, centrifugar a 350 x g durante 5 min à RT
  6. Após a lavagem final, Ressuspender as células em 200 μL de tampão de coloração e transferir as células em tubos apropriados (volume final de 400 μL em buffer de coloração) e aquisição de dados por citometria de fluxo. Amostras coradas em placa de 96 poços também podem ser executadas sem transferir para tubos se um citômetro de fluxo com opção de leitor de placa está disponível. Esta etapa minimiza a perda de células durante a transferência de célula.
  7. Adquirir um mínimo de 5 x 105 células total sobre o citômetro de fluxo para ser capaz de realizar análises reprodutíveis de TFH, TFR, bem como as células B GC.

Resultados

Em contraste com um protocolo anterior20, temos observado que o PPs não estão distribuídas uniformemente por todo o SI mas são localizadas mais densamente em direção as extremidades distais e proximais de SI, como mostrado na figura 1A. Fluxo cytometric análise mostrou que, se seguidos corretamente, nosso protocolo dá uma população de linfócitos PP que demonstra a distribuição de dispers?...

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para caracterização de fluxo cytometric das células TFH e GC B. Uma das principais vantagens do nosso protocolo é que ele permite que o isolamento de até 107 (média de 4 – 5 x 106 células) de células PP totais de um único rato (estirpe C57BL/6) sem qualquer processo digestivo. Observamos que o rendimento total da célula foi positivamente correlacionado com o número de PPs e pode ser estimado a partir da seguinte equação simples que é útil par...

Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Laura Strauss e Peter Sage para discussões úteis e apoio com análises de citometria de fluxo.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-mouse CD4 antibodyeBioscience, Biolegend*17-0041-81 ,10054*For detailed information see Table 1
anti-mouse CD19 antibodyeBioscienceMA5-16536For detailed information see Table 1
anti-mouse PD-1 antibodyeBioscience61-9985-82For detailed information see Table 1
anti-mouse ICOS antibodyeBioscience12-9942-82For detailed information see Table 1
anti-mouse GL7 antibodyBiolegend144610For detailed information see Table 1
anti-mouse CXCR5 antibodyBiolegend*, BD Bioscience145512*, 551960For detailed information see Table 1
anti-mouse BCL-6 antibodyBiolegend358512For detailed information see Table 1
anti-mouse Foxp3 antibodyeBioscience17-5773-82For detailed information see Table 1
Streptavidin-BV421BD Bioscience563259For detailed information see Table 1
FixableViability DyeeBioscienceL34957For detailed information see Table 1
7AADBiolegend420404For detailed information see Table 1
FcBlock (CD16/32)BD Bioscience553141For detailed information see Table 1
Collagenase IIWorthingtonLS004176
Collagenase IVWorthingtonLS004188
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SeteBioscience00-5523-00
6-well,12-well & 96-well platesFalcon/Corning353046,353043/3596
50 ml conical tubesFalcon3520
40 µm cell strainerFalcon352340
10 ml syringe-plungerExel INT26265
RPMICorning15-040-CV
PBSCorning21-040-CM
FBSAtlanta BiologicalsS11150
Orbital shakerVWRModel 200
Curved-end scissor
Fine Serrated Forceps
Small curved scissor

Referências

  1. van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
  2. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  3. Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
  4. Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
  5. Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
  6. Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
  7. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
  8. Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
  9. Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
  10. Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
  11. Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
  12. Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
  13. Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
  14. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
  15. Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
  16. Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
  17. Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
  18. Espéli, M., Walker, J. M. . T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
  19. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
  20. De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
  21. Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
  22. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
  23. Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  24. Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
  25. Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
  26. Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
  27. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
  28. Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
  29. Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
  30. Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
  31. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  32. Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
  33. Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
  34. Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
  35. Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
  36. Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Cancer Researchedi o 141de Peyerc lulas foliculares de auxiliar Tcentro germinativo c lula Bisolamento de linf citosprepara o do tecidosubconjuntos de linf citosrg os linfoidescolagenase

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados