从小鼠的补丁中提取体液免疫的关键参与者: 先进和优化的淋巴细胞分离协议

摘要

在这项研究中, 我们提出了一个新的和有效的方案, 从 peyer 的补丁 (pp) 的淋巴细胞分离, 随后可用于体内和体外功能分析, 以及流式细胞仪研究的卵泡 t辅助和萌发中心 b 细胞。

摘要

在肠道黏膜中, 免疫细胞构成了一个独特的免疫实体, 它促进免疫耐受, 同时增强免疫防御病原体。通过承载几个效应 t 和 b 细胞子集, 人们已经很好地证实了 peyer 的贴片 (pp) 在黏膜免疫网络中的重要作用。这些效应细胞、滤泡 t 辅助细胞 (tfh) 和生殖细胞 (gc) b 细胞的一部分在体液免疫调节方面具有专业化功能。因此, 在 pp 内对这些细胞亚群的分化程序和功能特性进行表征可以提供有关黏膜免疫的重要信息。为此, 一种易于应用、高效和可重复的从 pp 中分离淋巴细胞的方法对研究人员具有重要意义。在这项研究中, 我们的目的是建立一个有效的方法来分离淋巴细胞从小鼠 pp 具有高细胞产量。我们的方法表明, 最初的组织处理, 如使用消化试剂和组织搅拌, 以及细胞染色条件和抗体面板的选择, 有很大的影响质量和身份的分离淋巴细胞和实验结果。

在这里, 我们描述了一个协议, 使研究人员能够有效地从 pp 中分离出淋巴细胞群, 从而对 t 和 b 细胞子集进行可重复的流式细胞化评估, 主要侧重于 tfh 和 gc b 亚群。

引言

从开始到结束, 整个胃肠道都装饰着广泛的淋巴网络, 其中含有的免疫细胞比人类和小鼠¹中的任何其他器官都要多。peyer 的贴片 (pp) 是这个细胞免疫组织的肠道分支的主要组成部分, 即所谓的肠道相关淋巴组织 (galt)^2,3。在 pp 中, 成千上万的抗原来自膳食材料、微生物群和病原体, 正在不断取样, 必要时对其进行适当的免疫反应, 从而保持肠道免疫稳态。从这个意义上说, pp 可以被命名为 "小肠扁桃体"。pp 由主要的亚隔组成: 上皮下圆顶 (sed)、大 b 细胞卵泡区;t 细胞所在的上覆卵泡相关上皮 (fae) 和卵泡间区域 (ifr).这种独特的分块的 pp 使不同的效应细胞亚群合作, 从而赋予免疫能力的肠道。

pp 缺乏传入淋巴管, 由于这个原因, 从小肠输送到 pp 的抗原没有通过淋巴管进行, 而不是与大多数其他淋巴器官相比。相反, 位于 fae 的特殊上皮细胞, 即所谓的 m 细胞, 负责将腔内抗原转移到 ppp⁵中。随后, 被运输的抗原被树突细胞 (dc) 和吞噬细胞所吸收, 这些细胞位于 fae^6,7下的上皮圆顶 (sed) 区域。pp 中 dc 的抗原分选过程对于启动自适应免疫反应⁸和随后产生的 iga 分泌细胞⁹至关重要。

由于同源植物区系和膳食材料的抗原负担很重, pp 在 tfh^{和 iga +} gc b 细胞10等大量细胞中存在内源激活效应 t 和 b 细胞^亚群, 这表明 pp 是活性免疫的部位响应¹¹。在未接种的幼小 c57bl6 小鼠中收集的 pp 中, 可检测到 cd4 + t 细胞室中高达20–25% 的 tfh 细胞, 在总 b 细胞中可检测到高达 10-15%的 gc b 细胞。与其他 t 辅助细胞类型 (即th1、th2、th17 细胞) 不同, tfh 细胞对 b 细胞的独特取向主要是由于 cxcr5 表达, 从而促进 tfh 细胞沿 cxcl13 梯度¹³归巢。在 pp 的 b 细胞卵泡区, tfh 细胞诱导 iga 类开关重组和体细胞重组在激活的 b 细胞中, 高亲和力 iga 产生^细胞从中分化14。随后, 这些抗体分泌的血浆细胞迁移到固有层 (lp), 调节肠道内的免疫稳态 10.

在 pp 中确定和鉴定 tfh 和 gc b 细胞群, 可以使研究人员在稳定状态下研究体液免疫反应的动态, 而无需耗时的免疫模型传统上用于 tfh-gc b 细胞^{研究 15、16、17、18}。分析 pp 中的 tfh 细胞并不像其他细胞子集那么简单。技术挑战包括确定理想的组织制备条件、表面抗体标记组合, 以及选择适当的阳性和阴性对照。tfh 和 pp 研究领域在实验过程方面都表现出很大的差异, 由于几个原因, 它们远远没有就建立标准化协议达成共识。首先, pp 中的每个细胞子集往往受到组织制备条件的不同影响, 需要以特定于细胞的方式进行进一步的修饰。第二, 所报告的方法在 pp 细胞制备细节方面存在显著差异. 第三, 研究理想组织制备技术和实验条件的基于协议的比较研究的数量对于 pp 和 tfh 的研究是相当有限的。

目前基于协议的研究表明, pp 细胞制备^19,20,21,²²不是 tfh-或 gc b 细胞为导向。此外, 一些组织制备条件推荐的 ppp^19,20 , 如基于胶原蛋白的消化被发现影响 tfh 的结果, 流式细胞术对结果进行了否定^的18。在此基础上, 我们推断, 一个优化的、标准化的和可重复的协议, 可用于研究 ppp 中的 tfh 和 gc b 细胞动力学, 这对研究这一主题的研究人员将是有价值的。这种需要使我们有动力为 pp 淋巴细胞的分离和表征制定了改进的最新协议, 该协议经过了很好的优化, 可用于细胞恢复、活力和几个 t 和 b 的流式细胞仪表征的效率单元格子集。我们还旨在排除以前的协议中建议的几个费力的制备步骤, 从而减少从 pp 组织和细胞制备所需的操作和时间。

研究方案

本议定书中描述的所有研究和实验都是根据贝丝以色列执事医疗中心动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的指导方针进行的。

1. 设计实验设置和鼠标组

1. (可选)共同容纳实验小鼠, 以促进实验小鼠之间肠道微生物群的水平传递, 并减少 pp 淋巴细胞内的非特异性变异性。此外, 使用相同性别的垃圾配偶控制, 以最大限度地减少变异性。

2. 手术切除和组织准备步骤:

1. 小肠 (si) 的手术切除
   1. 使用 co2 窒息或机构动物伦理委员会批准的任何等效方法对小鼠进行安乐死。
   2. 将鼠标转移到专门的区域进行手术切除。将背部向下放置, 用70% 乙醇对腹部进行消毒。通过切割从中端线从到肋骨笼子的腹部皮肤和腹膜进行剖腹手术 , 从而打开腹腔。
      注: 在皮肤相对较小的部位进行第一个切口, 以避免穿透腹腔和损害肠道组织。继续切除, 直到所需的解剖边界。
   3. 识别盲肠, 这是一个理想的地标, 用于检测回肠末端, 它构成小肠的远端段。
      注: 盲肠通常位于小鼠腹部的左下角。
   4. 确定伊莱卡采岛交界处, 并在这个水平上尽可能远端切割, 以将小肠与盲肠分开。在接下来的步骤中, 避免与肠道壁过度的物理接触, 因为脆弱的 pp 在接触时很容易崩溃。
   5. 轻轻去除整个小肠, 直到幽门括约肌切割使用剪刀肠系膜。确定幽门和十二指肠之间的交界处, 并在这个级别剪断十二指肠, 这将导致小肠完全脱离腹腔。
      注: (i) 避免过度扩张, 因为这可能会导致肠壁破裂。(ii)如果除了 pp 淋巴细胞外, 还需要分离 lp 淋巴细胞, 则需要完全切除肠系膜脂肪。然而, 仅对于 pp 分离, 剩余的肠系膜脂肪可以在进一步的隔离步骤中提供一些好处;因此, 它应该被保存。
   6. 将分离的小肠放入一个6孔板充满冷 rpmi + 10% 的胎儿牛血清 (fbs), 并轻轻搅拌组织手动, 直到所有肠道段被淹没在冷介质中。在接下来的步骤中, 保持冰上的组织。
   7. 在解剖所需数量的小鼠小肠后, 从收集到的小肠进行 pp 切除。
2. pp 的手术切除和单细胞悬浮液的制备:
   1. 用钳子抓住肠系膜脂肪, 轻轻地将小肠转移到纸巾上, 并将肠系膜一侧面向纸巾。用冷 rpmi + 10% fbs 滋润整个肠道段, 以避免组织脱水和粘性。
      注: 在这一阶段, 仍然存在肠系膜脂肪是有帮助的, 因为 si 肠系膜部位的脂肪组织段将粘附在纸巾上, 使抗肠系膜部位朝上。
   2. 识别 pp, 它在肠道壁的抗肠系膜一侧呈 "花椰菜状" 形状, 呈白色多叶状集料。
      注: 在所有 pp 切除之前, 不建议冲洗出腔内的内容。排空腔内内容可能会导致 pp 崩溃, 并将防止 pp 与肠道壁之间的颜色对比, 这对 p p 的视觉识别非常有帮助。
   3. 在识别抗肠系膜一侧的 pp 后, 将手术曲线端剪刀放在 pp 上 (曲线应面朝上), 从其远端和近端边界约束 pp。
      可选: 用指尖轻轻地将 pp 推向剪刀的刀片。这种机动将导致更好地排除周围的非 pp 组织。轻轻地使用 pp, 不包括周围的肠道组织。
      注: (i) 此步骤对于获得最大的 pp 细胞产量, 同时最大限度地减少来自邻近肠道隔间 (如 lp 和肠道上皮) 的细胞污染至关重要, 这些隔间中也含有丰富的 t 细胞。(二) 从 c57bl6 小鼠中切除一种 si, 可收集 5-10 pp (平均大小, 多叶)。通过瞄准更小的 pp (而不是多叶), 使用此协议可以收集每只小鼠多达12-13 个 pp (c57bl6)。
   4. 将切除的 pp 转移到12井组织培养板, 其中充满了冰凉 rpmi + 10% fbs, 并使用钳子或弯曲的手术剪刀在冰上保持。
      注: (i) 在切除 pp 表面的 pp 后, 可以立即在纸巾上轻轻擦拭组织, 以清除 pp 表面的粘液和肠道内容。这一步骤将有助于提高 pp 淋巴细胞的生存能力。(二) 还可以根据总样品数量考虑将 pp 转移到不同的管, 而不是将 pp 转移到一个盘子上。
   5. 可选: 当 pp 切除并随后放置到井板中时, 可以通过拍摄含有 pp 的组织培养板的照片来记录从不同实验组/小鼠组收集的 pp 的数量和大小。
   6. 准备一套50毫升锥形管, 充满25毫升的 rpmi + 10% fbs (在37°c 预热)。使用一把剪刀, 从距离上剪下 1, 000μl 尖端的边缘, 使 pp 与1毫升移液器进行抽吸。用1毫升移液器吸吸 pp, 并将其从12孔组织培养板转移到制备的50毫升锥形管。
      注: 对每个鼠标样本使用新的提示, 以避免样品之间的交叉污染。
   7. 将盖子固定, 并在37°c 下将管垂直放置在轨道振动台中, 以125–150转/分的连续搅拌10分钟。同时, 准备一套新的50毫升管, 并在每个管的顶部放置一个40μm 的电池过滤器, 通过它将准备单细胞悬浮液。
      注: (i) 搅拌步骤将去除剩余的肠道内容、粘液和细胞碎片, 如果不去除, 这些物质会降低 pp 淋巴细胞的细胞活力和恢复。(ii) 不要在 pp 组织上应用任何类型的消化酶, 因为消化过程会导致细胞表面的 cxcr5 表达大幅丧失。
   8. 搅拌后, 将 pp 转移到放置在新制备的锥形50毫升管顶部的40μm 电池过滤器上。使用10毫升注射器柱塞的圆形侧面, 通过细胞过滤器轻轻破坏 pp, 产生单细胞悬浮液。用15–20毫升的冷 rpmi + 10% fbs 冲洗过滤器。
      注: (i) 在过滤之前, 水平摇晃含有 pp 的管。这种短暂的晃动将有助于将 pp 转移到细胞过滤器中。(二) 建议使用70μm 细胞过滤器分离非淋巴细胞免疫细胞 (例如单核细胞、巨噬细胞、dc)。
   9. 在4°c 条件下, 以 350–400 x g 离心单细胞悬浮液10分钟。
   10. 小心丢弃上清液, 以 10 x 10^{6 细胞}的浓度重新悬浮细胞。用血细胞仪计数细胞。
       注: (i) 在细胞计数之前, 可以使用以下公式大致估计每个小鼠 pp 组的总细胞数: "0.5-1 x10^6个单元格 x (pp 数目) = 细胞总数"。可能需要进一步稀释色氨酸蓝色的细胞计数。(二) 作为人工计数的替代办法, 可以使用自动单元格计数器。
   11. 以适当的体积 (例如200μl) 将 2-2.5 x¹⁰ 6 个细胞转移到96孔圆底板中。
       注: 对于单色和负对照样本, 0.5-1 x^{10 6个}单元格可能就足够了。
   12. 在4°c 条件下, 以 350 x g 离心板5分钟。把盘子打开
   13. 在200μl 染色缓冲液中清洗细胞。

3. 表面抗体染色

1. 可行性染色:
   1. 最后清洗后, 在 pbs (1:1000) 中稀释的100μl 可固定活力染料中重新悬浮细胞。在冰上或在4°c 的黑暗中孵化30分钟。
      注: (i) 用于检测 ffnp3 或 bcl-6 等关键转录因子的细胞内染色需要固定细胞。在这种情况下, 不能使用不可固定的活力染料 (例如, 7-aad、dapi)。(ii) 为稀释可固定的活力染料, 请不要使用任何含有蛋白质的染色缓冲液。此步骤中使用的介质必须不含蛋白质。(三) 使用活度染色排除死细胞至关重要, 因为死细胞会通过发射自身荧光和非具体结合表面抗体, 在流式细胞术分析中造成严重的技术困难, 这可能导致错误积极的结果。
   2. 用染色缓冲液清洗细胞两次。在4°c 条件下, 以 350 x g 离心5分钟。把盘子打开
2. fc 块和表面层 i:
   1. 在染色缓冲液中稀释抗 cc16/32 抗体 (1:200), 制备 fc-阻滞溶液。
   2. 将细胞重新用于制备的 fc-块溶液的20μl 中。在冰上孵化15分钟。
   3. 在不清洗的情况下, 加入在适当稀释下制备的80μl 表面抗体鸡尾酒 (抗体摘要见表 1 )。在冰上孵化至少30分钟。
   4. 加入过多的染色缓冲液清洗两次。在4°c 条件下, 以 350 x g 离心5分钟。把盘子打开
3. 表面-第二层:
   1. 在染色缓冲液中稀释荧光色素共轭链状双白蛋白, 制备链状维丁染色溶液。
   2. 最后清洗后, 用100μl 的预稀释链霉素 (1:100) 染色溶液重新悬浮细胞。在黑暗中冰上孵化至少15分钟。
   3. 用染色缓冲液清洗两次。在4°C 以 350 x g 离心5分钟。把盘子打开
      可选: 如果不希望细胞内染色的滤泡调节 t 细胞检测, 最后一次清洗后, 重新悬挂细胞在200μl 的染色缓冲液, 并转移到适当的管, 以获取流式细胞仪中的数据。当样品没有固定时, 应在3-4小时内通过流式细胞术采集数据, 以获得准确的结果。

4. 固定细胞

1. 使用 fnofp/转录因子染色缓冲液组中的试剂准备固定/渗透剂 (fix/perm) 工作解决方案。将固定-渗透剂的一部分与固定-渗透稀释剂的三部分混合到所需的最终体积。
2. 最后清洗后, 在200μl 的 fix/perm 工作溶液中重新悬浮细胞。
3. 在冰上或4°c 下将盘子生20分钟。此步骤不要超过20分钟。较长的孵育时间可能会严重降低细胞的恢复。
4. 在4°c 条件下, 以 350 x g 离心5分钟。把盘子打开(可选)在这一步之后, 固定细胞可以在4°c 的染色缓冲液中储存几天, 其中含有牛血清白蛋白 (bsa) 或 fbs, 直到随后的细胞内染色或流式细胞仪采集。
5. 将细胞重新注入200μl 的渗透性缓冲 (x1), 在纯化的去离子水中进行新的预稀释。
6. 在室温 (rt) 下, 以 350 x g 离心5分钟。
7. 用200μl 的渗透缓冲液和离心机在 350 x g 下清洗一次, 在 rt 清洗5分钟。

5. 细胞内染色

1. 在渗透缓冲液中稀释抗 cc16/32 抗体 (1:200), 制备 fc-块溶液。
   注: 固定步骤后, 细胞必须保持在渗透缓冲液中, 直到细胞内染色过程结束。
2. 最后清洗后, 在20μl 的 fc 块溶液中重新悬浮细胞。在黑暗中在 rt 中孵化10-15分钟。
3. 无需洗涤, 加入80μl 的细胞内抗体鸡尾酒 (100μl 最终体积), 在渗透缓冲液中预稀释。在 rt 孵化30分钟。
4. 在 rt 以 350 x g 的速度添加100μl 的 perm 缓冲器和离心机5分钟。
5. 用200μl 的渗透缓冲液清洗一次, 离心机以 350 x g 的速度清洗5分钟。
6. 最后清洗后, 在200μl 染色缓冲液中重新悬浮细胞, 并将细胞转移到适当的管中 (染色缓冲液中的最终体积为 400μl), 并通过流式细胞术获取数据。如果有带板式读取器选项的流式细胞仪, 则在96孔板中染色的样品也可以在不转移到管道中的情况下运行。此步骤可最大限度地减少细胞转移过程中的细胞丢失。
7. 在流式细胞仪上获取至少 5 x^{10 5个}总细胞, 以便能够对 tfh、tfr 以及 gc b 细胞进行重现性分析。

结果

与以前的协议²⁰不同, 我们观察到 pp 在整个 si 中分布不均匀, 而是更密集地分布在 si 的远端和近端, 如 图 1 a 所示.流式细胞仪分析显示, 如果遵循正确, 我们的协议给出了一个 pp 淋巴细胞群, 显示向前散射分布类似于脾细胞 (图 2a, e , 2A, h) 与 & gt;95% 细胞(

讨论

在这里, 我们描述了一个优化的协议流式细胞仪表征 tfh 和 gc b 细胞。我们的协议的主要优点之一是, 它能够从单个小鼠 (c57bl6 菌株) 中分离出多达 10^{7 (}平均 4-5 x 10 6 细胞) 的总 pp 细胞, 而无需任何消化过程。我们观察到, 细胞总产量与 pp 的数量呈正相关, 可以从以下简单的方程中估计出来, 这对实验规划很有帮助: "每只小鼠的总 pp 细胞计数 = 0.5–1 x (每只切除 pp 的数量...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-mouse CD4 antibody	eBioscience, Biolegend*	17-0041-81 ,10054*	For detailed information see Table 1
anti-mouse CD19 antibody	eBioscience	MA5-16536	For detailed information see Table 1
anti-mouse PD-1 antibody	eBioscience	61-9985-82	For detailed information see Table 1
anti-mouse ICOS antibody	eBioscience	12-9942-82	For detailed information see Table 1
anti-mouse GL7 antibody	Biolegend	144610	For detailed information see Table 1
anti-mouse CXCR5 antibody	Biolegend*, BD Bioscience	145512*, 551960	For detailed information see Table 1
anti-mouse BCL-6 antibody	Biolegend	358512	For detailed information see Table 1
anti-mouse Foxp3 antibody	eBioscience	17-5773-82	For detailed information see Table 1
Streptavidin-BV421	BD Bioscience	563259	For detailed information see Table 1
FixableViability Dye	eBioscience	L34957	For detailed information see Table 1
7AAD	Biolegend	420404	For detailed information see Table 1
FcBlock (CD16/32)	BD Bioscience	553141	For detailed information see Table 1
Collagenase II	Worthington	LS004176
Collagenase IV	Worthington	LS004188
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	eBioscience	00-5523-00
6-well,12-well & 96-well plates	Falcon/Corning	353046,353043/3596
50 ml conical tubes	Falcon	3520
40 µm cell strainer	Falcon	352340
10 ml syringe-plunger	Exel INT	26265
RPMI	Corning	15-040-CV
PBS	Corning	21-040-CM
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
Orbital shaker	VWR	Model 200
Curved-end scissor
Fine Serrated Forceps
Small curved scissor